The authors have no acknowledgements.

<ol>
	<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li><li>Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations.">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li><li>Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+and+high+sensitivity+test+for+MYD88+mutations+using+locked+nucleic+acid.">Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid.</a> Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).</li><li>Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+blocking+polymerase+chain+reaction+for+detection+of+single+nucleotide+minority+mutations+from+clinical+specimens.">Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens.</a> Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).</li><li>Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+All+Next+Generation+Sequencing+Diagnostics+are+Created+Equal:+Understanding+the+Nuances+of+Solid+Tumor+Assay+Design+for+Somatic+Mutation+Detection.">Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection.</a> Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).</li><li>Smith, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+estimates+of+clonal+evolution+and+subclonal+heterogeneity+can+arise+from+PCR+duplicates+in+deep+sequencing+experiments.">Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments.</a> Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).</li><li>Varettoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+the+MYD88+(L265P)+somatic+mutation+in+Waldenstr&#246;m's+macroglobulinemia+and+related+lymphoid+neoplasms.">Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenstr&#246;m's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms.</a> Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYD88+L265P+in+Waldenstr&#246;m+macroglobulinemia,+immunoglobulin+M+monoclonal+gammopathy,+and+other+B-cell+lymphoproliferative+disorders+using+conventional+and+quantitative+allele-specific+polymerase+chain+reaction.">MYD88 L265P in Waldenstr&#246;m macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction.</a> Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).</li><li>Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waldenstr&#246;m+macroglobulinemia:+2012+update+on+diagnosis,+risk+stratification,+and+management.">Waldenstr&#246;m macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management.</a> Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).</li><li>Salar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MYD88+(L265P)+Mutation+Confers+Very+Poor+Response+and+Outcome+after+Second-Line+Therapy+in+Patients+with+Diffuse+Large+B-Cell+Lymphoma+(DLBCL).">MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL).</a> Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).</li><li>Ngo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenically+active+MYD88+mutations+in+human+lymphoma.">Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma.</a> Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).</li><li>Pasqualucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+coding+genome+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma.">Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).</li><li>Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+concepts+for+PCR+primer+design.">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).</li><li>Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).</li><li>Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., M&#248;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphism+genotyping+using+locked+nucleic+acid+(LNA).">Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA).</a> Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).</li><li>Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+mutation+artifacts+after+formalin+fixation+and+error+prone+translesion+synthesis+during+PCR.">In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR.</a> BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).</li><li>Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Gr&#252;nberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+and+K-ras+mutation+analysis+in+non-small+cell+lung+cancer:+comparison+of+paraffin+embedded+versus+frozen+specimens.">EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens.</a> Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).</li><li>Solassol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS+mutation+detection+in+paired+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+colorectal+cancer+tissues.">KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues.</a> Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).</li><li>Yost, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+high-confidence+somatic+mutations+in+whole+genome+sequence+of+formalin-fixed+breast+cancer+specimens.">Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens.</a> Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).</li><li>Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+sequence+artifacts+in+amplicon-based+massively+parallel+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+DNA+by+enzymatic+depletion+of+uracil-containing+templates.">Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates.</a> Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).</li><li>Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+amplification+of+rare+mutations+using+locked+nucleic+acid+oligonucleotides+that+competitively+inhibit+primer+binding+to+wild-type+DNA.">Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA.</a> J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).</li><li>Mancini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+novel+methods+for+rapid+detection+and+quantification+of+DNMT3A+R882+mutations+in+acute+myeloid+leukemia.">Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia.</a> J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).</li><li>Parsons, B. L., Heflich, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+selection+methods+for+the+direct+analysis+of+point+mutations.">Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations.</a> Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).</li><li>Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+amplification:+a+method+for+high-fidelity+template-driven+nucleic+acid+amplification.">Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification.</a> BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).</li><li>Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+of+a+primer+at+a+mutation:+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA.">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li><li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Sensitivity+Testing+Shows+Multiclonal+Mutations+in+Patients+with+CLL+Treated+with+BTK+Inhibitor+and+Lack+of+Mutations+in+Ibrutinib-Naive+Patients.">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

את assay WTB-PCR המתואר כאן משתמשת בסדרה הגנרית של פריימרים עם אוליגו חסימת נועד לחסום הגברה של DNA WT במהלך הארכה (איור 1). מוצר WTB-PCR הוא רצף אז עבור ניתוח מוטאציות. כלי השירות של WTB-PCR / סאנגר טמון בפשטותה, רגישות גבוהה, ו-תפוקה גבוהה. באמצעות ההנחיות המתוארות כאן, רוב מב...

רצף סנגר באופן מסורתי את תקן הזהב בדיקות עבור שתי מוטציות סומטיות ידועים ובלתי ידועים. אחת המגבלות של רצף סנגר הוא הגבול של זיהוי שלה (~ 10 - אלל מוטנטי 20% בתוך רקע של WT) 1. רמה זו של רגישות אינה מתאימה לזיהוי מוטציות סומטיות ברמה הנמוכה שעשויה להיות נוכח דגימות מרקמות ממאירות או בחולים עם כמה תאים סרטניים במחזור, או כאשר מח עצם (BM), הוא מעשה טלאים. זה גם עושה הערכת מחלה שיורית לאחר טיפול או לגילוי מוטציות עמידות המתעוררים במהלך הטיפול קשה על ידי רצף קונבנציונאלי בלבד 2. על ידי החלפת PCR קונבנציונאלי עם חומצות גרעין נעול (LNA) בתיווך wild-type חסימת PCR (WTB-PCR) ב רצף סנגר, רגישויות של עד 0.1 אלל מוטנטי% בתוך הרקע של WT ניתן להשיג 2, 3, 4. בשנתWTB-PCR, העשרה עבור אללים מוטנטים מושג באמצעות התוספת של קצר (~ 10 - 14 NT) חסימה (LNA) oligonucleotide שקושרה מעדיפים את WT DNA ובכך למנוע ההגברה של WT DNA. מוצר WTB-PCR מועשר המוטציה יכול להיות רצף אז. על ידי חסימת WT DNA ולא בחירת מוטציות ספציפיות WTB-PCR מאפשרת העשרה של שניהם מוטציות ידועות ובלתי ידועים הנוכחות שברי תא דקות. שיטות מרובות כיום משמשות לזיהוי מוטציות שברי תאים קטנים. זה כולל מערכת מוטצית אלל ספציפי PCR, הגברה-עקשנית (נשק), denaturing כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (DHPLC), חרוזים, תחליבים, הגברה, ומגנטיות (קורן), שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM), ברזולוציה גבוהה נקודה ואחרים היתוך. עם זאת, רוב השיטות אלה מוגבלים-תוצאות חיוביות שגויות ואת היכולת לזהות רק מוטציה אחת כי assay תוכנן עבור 4 </sup&gt;. WTB-PCR, לעומת זאת, מאפשרת למשתמש לדמיין עקבות רצף המאפשרת זיהוי של סוגי מוטציה מרובים ויכולים לסייע פוסלים תוצאות חיוביות שגויות עקב ממצאים או אירועים דיאמינציה. סידור הדור הבא (NGS) עשוי להציע חלופה הולמת סידור קונבנציונלי, אולם, עלויות משמעותיות גדולות יותר, מורכבות, וזמן assay כבר לדקלם את זה אופציה מיותרת עבור סוגי מחלות רבים עם כמה סמנים מולקולריים ברורים או לניטור מטופלים בתרופה עבור מתעוררים מוטציות עמידות. יתר על כן, שיעורי חיובי כוזבים גבוהים כאשר הגירסות באיתור עם תדרי אלל מוטנטי של פחות מ 5% יכולות להוות בעיה עבור NGS מבוסס amplicon 5, 6. כאן אנו מדגימים את הגידול רגיש מושג על ידי WTB-PCR הקרנה עבור מוטציות בגן 88 גורם בידול מיאלואידית כפי שתואר על ידי Albitar ואח. 3 MYD88 mutatioNS הם גורמים אבחון פרוגנוסטי חשוב Macroglobulinemia של Waldenström (WM), gammopathy מונוקלונלי IgM בעל משמעות לא ידוע (IgM-MGUS), לימפומה אזור שוליים הטחול (SMZL), מפוזר לימפומה B-cell גדול (DLBCL). מוטציות MYD88 נמצאים כמעט בכל המקרים של WM וכ 50% מהחולים עם אימונוגלובולין M (IgM) -secreting MGUS. וחשוף, מוטציות MYD88 נמצאות רק 0-6% מחולים עם SMZL ו נעדרות מיאלומה נפוצה 7, 8. מכיוון מורפולוגיים חופפים, immunophenotypic, ציטוגנטית, ואת המאפיינים הקליניים בין WM ו- SMZL או מיאלומה נפוצה-IgM יכול לעתים קרובות לסבך אבחנות דיפרנציאלי, בנוכחות מוטציה MYD88 עשוי לשמש כגורם 9 זיהוי שימושי. מוטציות MYD88 גם קושרו עם נטל המחלה יותר בחולים עם DLBCL והישרדות כוללת עניים לאחר טיפול 7, </sup&gt; 10. בנוסף, בגלל מוטציות MYD88 נמצאים בתדירות גבוהה יותר B-cell-like מופעל (ABC) DLBCL מ מרכז נבטי B-cell-like (GCB) DLBCL או לימפומה B-cell mediastinal העיקרי (PMBL), מצב המוטציה MYD88 עשויה לשמש סמן פונדקאי עבור תת ABC 11, 12. הפרוטוקול המפורט הניתן כאן משמש כתבנית שממנו המבחנים חדשים ניתן לפתח או ברוב מבחני רצף הקיימים ניתן להתאים בקלות לזהות מוטציות בתדירות נמוכות במדויק סוגים שונים מדגמים. הגישה יכולה לשמש גם עבור ניטור ואיתור מוטציות עמידות שעשויות להתפתח גידולים או אפילו חיידקים שעלולים להתפתח תוך חולי מטופלים עם טיפול ממוקד או אנטיביוטיקה. יתר על כן, היא מתייחסת ותרופות רבות מהבעיות הקשורות להעשרת מוטציה, במיוחד משובץ-פרפין קבוע פורמלין (FFPE) רקמות.

<table><tbody><tr><td>1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100% alcohol</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol</td></tr><tr><td>3730XL sequencer</td><td>ABI</td><td></td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>For magnetic bead PCR purification</td></tr><tr><td>Aluminum sealing foils</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>For PCR and cold storage</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer</td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 Series</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP rotor (for PCR plate)</td></tr><tr><td>Cold plate for 96 well plates</td><td>Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, RNAse-free, ultra-pure water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side-Skirted Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>For use in PCR Purification.</td></tr><tr><td>Ethanol Absolute&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 proof, for molecular biology</td></tr><tr><td>Exiqon website Oligo Tools</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.exiqon.com/oligo-tools&quot;&gt;www.exiqon.com/oligo-tools&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA polymerase (5 U/&amp;micro;L)</td><td>Roche</td><td>12032937001</td><td>With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td></td><td></td><td>2% agarose gel</td></tr><tr><td>GeneRead DNA FFPE extraction Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>180134</td><td>Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>For sequencing.</td></tr><tr><td>LNA oligonucleotide</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5&#039;-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)</td></tr><tr><td>M13-F Sequencing Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5&#039;-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R Sequencing Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5&#039;-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Model 5430</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR forward primer</td><td>IDT</td><td></td><td>5&#039;-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR reverse primer</td><td>IDT</td><td></td><td>5&#039;-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR plates</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1,000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Plate septa, 96 well</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>For BM aspirate and peripheral blood</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>For sequencing analysis</td></tr><tr><td>Slide basket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filtered pipette tips</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1,000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Thermomixer C&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Wash reservoir</td><td></td><td></td><td>~ 1,000 mL</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>Histology grade</td></tr></tbody></table>

wild-type blocking pcr combined with direct sequencing as a highly sensitive method for detection of low-frequency somatic mutations

גילוי וזיהוי מדויק של מוטציות בתדירות נמוכה יכול להיות בעייתי כאשר להערכת מחלת שיורי לאחר טיפול, בדיקות סקר לאיתור מוטציות עמידות המתעוררים במהלך הטיפול, או כאשר יש מטופלים כמה תאים סרטניים במחזור. Wild-סוג חסימת PCR ואחריו לניתוח רצפי מציעה רגישות גבוהה, גמישות, ופשטות כמו מתודולוגיה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה אלה. על ידי הוספת מעוצבים בהתאמה אישית נעול oligonucleotide חומצות גרעין אל assay סידור חדש או בעבר הקים קונבנציונאלי המבוסס PCR, רגישויות של כ 1 אלל מוטנטי רקע של 1000 אללים WT יכולה להיות מושגת (1: 1000). חפצי רצף אירועים הקשורים דיאמינציה נפוצים ברקמות מוטבעות פרפין קבוע בפורמלין ניתן לתיקון חלקי על ידי שימוש glycosylase DNA אורציל במהלך שלבי חילוץ. הפרוטוקול המותאם כאן הוא ספציפי לזיהוי מוטצית MYD88, אך יכול לשמש כתבנית לעצב כלassay WTB-PCR. יתרונות של assay WTB-PCR מעל מבחני אחרים מנוצלים בדרך כלל לאיתור מוטציות בתדירות הנמוכה כולל אלל ספציפי PCR ו PCR כמוני בזמן האמת כוללים מופעים פחות של תוצאות חיוביות שגויות, גמישות רבה יותר וקלות ליישום, ואת היכולת לזהות הן ידוע ומוטציות ידועות.

סקירה מושגית של WTB-PCR במהלך ההארכה מוצגת באיור 1. בגלל חוסר התאמה של נוקלאוטיד יחיד ההיברידי החוסם-DNA מקטינה טמפרטורת ההתכה שלה מאוד (ΔT מ = 20 - 30 מעלות צלזיוס), הגברה של אלל WT חסום בזמן DNA תבנית מוטציה אינה כרוכה בתשלום כדי להשלים ארכה <sup clas...

Watch this Scientific Journal Video about Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations at JoVE.com

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Research

JoVE Journal

Genetics

11.6K Views.  NeoGenomics Laboratories. Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Video: Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Behavior

<meta charset="utf8"></head><body>אופטימיזציה של זיהוי מוטציות בתדר נמוך עם PCR חוסם מסוג פראי

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting for drug resistance mutations and circulating tumor cell mutations during therapy. Traditional Sanger sequencing has 5%-20% wild-type mutation detection, so its limit of detection cannot meet the corresponding requirements. The wild-type blocking technologies that have been reported to overcome this include blocker displacement amplification (BDA), non-extendable locked nucleic acid (LNA), hot-spot-specific probes (HSSP), etc. These technologies use specific oligonucleotide sequences to block wild-type or recognize wild-type and then combine this with other methods to prevent wild-type amplification and amplify mutant amplification, leading to characteristics like high sensitivity, flexibility, and convenience. This protocol uses BDA, a wild-type blocking PCR combined with Sanger sequencing, to optimize the detection of RHOA G17V low-frequency somatic mutations, and the detection sensitivity can reach 0.5%, which can provide a basis for MRD monitoring of angioimmunoblastic T-cell lymphoma.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: קידום איתור מוטציות בתדירות נמוכה ברקמות סרטניות

This article introduces the application of a low-frequency detection method based on Sanger sequencing in angioimmunoblastic lymphoma. Provide a basis for applying this method to other diseases.

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך