שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום HIV כגון קביעת ההרכב הגנטי של proviruses HIV וסוגי תאים שונים. במיוחד זיהוי אלה שהם שלמים גנטית ופוטנציאל שכפול מוסמך. היתרונות העיקריים של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת לנו להגביר כמעט באורך מלא HIV proviruses מתאים נגועים ב- HIV יחיד ולאחר מכן רצף אלה על ידי רצף הדור הבא.
כדי להתחיל, הכן את כל המאגרים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. להשיג גלולת תא ולהוסיף מאה microliters של מאגר תזה למיליון תאים. מערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה.
Lyse התאים על ידי דגירה במחזור תרמי ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ולאחר מכן להוסיף 85 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. כדי להתחיל הגברה יחיד HIV-1 DNA proviruses לערבב את reagents עבור PCR הסיבוב הראשון כמפורט בטבלה אחד של פרוטוקול הטקסט. הוסף 38 microliters ל 85 בארות בצלחת PCR 96 היטב תווית צלחת זו כמו PCR 1.
לאחר מכן, להעביר את לוחית PCR 1 לאזור ברור המיועד לתוספת של DNA גנומי. באמצעות טריס הידרוכלוריד מדללים באופן סדרתי את הדנ"א הגנומי מיחס של 1 עד 3 ליחס של 1 עד 81 ומוודאים להכין 45 מיקרוליטרים של כל דילול. הוסף שני מיקרוליטרים של דנ"א גנומי מדולל לכל דגימה היטב ושני מיקרוליטרים של טריס הידרוכלוריד לכל באר בקרה שלילית.
לאטום את הצלחת כולה למעט שליטה חיובית היטב. לאחר מכן, עבור לאזור המיועד לתוספת של השליטה החיובית. מוסיפים שני מיקרוליטרים של השליטה החיובית ל באר המתאימה ולאחר מכן לאטום את הצלחת לחלוטין.
השתמש ספינר צלחת PCR כדי לסובב בקצרה את לוח PRC 1 ולהמשוך את כל התוכן שיורית מצדי הבארות. הפעל את לוח PCR 1 במחזור התרמי כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מערבבים את הרה-גנטים לסיבוב השני של PCR כמפורט בטבלה הראשונה.
הוסף 28 מיקרוליטרים של תערובת PCR 2 זו ל-85 בארות של צלחת PCR חדשה של 96 בארות. סמן לוח זה כ- PCR 2. באמצעות ספינר צלחת, לזמן קצר לסובב את לוח PCR 1 כדי למשוך את כל התוכן שיורית מצדי הבארות.
הוסף 80 מיקרוליטרים של טריס הידרוכלוריד לכל באר של צלחת זו. לאחר מכן, השתמש פיפטה ערוץ mutli להעביר שני microliters מכל באר של לוח PCR 1 ל בארות המתאימות בצלחת PCR 2. לאטום את צלחת PCR 2 עם עטיפת דבק ברורה.
בקצרה לסובב את לוח PCR 2 ספינר צלחת. בינתיים, לאטום את צלחת PCR 1 עם סרט איטום חום לאחסון לטווח ארוך במינוס 20 מעלות צלזיוס. הפעל את לוח PCR 2 במחזור תרמי כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
ואז לסובב בקצרה את לוח PCR 2 כדי למשוך את כל התוכן שיורית מצדי הבארים. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להוסיף 60 microliters של טריס הידרוכלוריד לכל באר. לאחר מכן, הפעל 15 microliters של כל באר על שני 48 היטב precast אחד אחוז ג'לים אגרוז המכילים אתידיום ברומיד.
זהה את בארות המכילות את המוצר המוגבר ואת הגדלים המשוערים שלהן ושמור את תמונת הג'ל. לאחר מכן, לקבוע את הדילול שבו לא יותר מ 30 אחוז של בארות חיוביות עבור מוצר מוגבר. ראשית, השתמש ספינר צלחת לסובב בקצרה את לוח PCR 2 ולהמשוך את כל התוכן שיורית מצדי הבארות.
מעבירים 40 מיקרוליטרים מה בארות המכילות מוצר מוגבר ל בארות המתאימות של צלחת מידי חדשה של 96 בארות. לאחר מכן, הגדר ערכת טיהור מבוססת הזנה מגנטית המוודאת להביא את החמרוזים המגנטיים לטמפרטורת החדר ולהכין פתרון טרי של 80 אחוז אתנול. לאחר שהחרוזים מגיעים לטמפרטורת החדר, הם מוודאים שהם נמצאים בהשבתה יסודית.
בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של חרוזים ל-40 המיקרוליטרים של המוצר המוגבר בכל באר של צלחת ה-midi. מערבבים על ידי צינור בעדינות למעלה ולמטה 10 פעמים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
לאחר מכן, להעביר את הצלחת לעמוד מגנטי ולתת לו לנוח במשך שתי דקות. לאחר מכן, הסר והשליך את העל-טבעי. כשהצלחת עדיין על הדוכן, שטפו את חרוזים על ידי הוספת מאתיים מיקרוליטרים של תוסף האתנול של 80 אחוז לכל באר.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות ולאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant. חזור על תהליך שטיפה זה פעם אחת מהוספת אתנול להשלכת על טבעי. באמצעות פיפטה רב ערוצית להסיר כל אתנול עודף.
תן את האוויר חרוזים יבש במשך 15 דקות. לאחר מכן, הסר את הצלחת מהעמוד. מוסיפים 30 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון לכל באר ומערבבים על ידי צינורות בעדינות למעלה ולמטה 10 פעמים.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. מניחים את הצלחת בחזרה על מעמד מגנטי ולתת לו לנוח במשך שתי דקות. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 25 microliters של supernatant ל בארות המתאימות של צלחת PCR חדשה 96 היטב.
לאחר מכן, השתמשו בפוטומטר ספקטרום כדי לקבוע ולתיעד את הריכוז המשוער של כל מוצר דנ"א מוגבר. הגדר ערכת כימות דנ"א כפולה ודלל את המאגר לפעמים אחת במים סטריליים ללא DNAs. הוסף 99 מיקרוליטרים של המאגר למספר מתאים של בארות ריקות בצלחת תרבות רקמה תחתונה שטוחה.
לאחר מכן, להוסיף מאה microliters של חיץ לשלוש בארות ריקות. כדי שכל מוצר מוגבר יימדד, הוסף מיקרוליטר אחד של דנ"א מטוהר בטריליקט לכל מאגר המכיל באר. לדלל lambda כפול תקוע DNA 10 לקפל משני ננוגרם למיקרוליטר לנקודה אפס אפס ננוגרם למיקרוליטר כדי להכין את הסטנדרטים.
הוסף מאה מיקרוליטרים של כל תקן דנ"א כפול תקוע לשלוש בארות. לדלל את צבע florescence 1 עד 200 עם חיץ. הוסף במהירות מאה מיקרוליטרים לכל באר המכילה מדגם, ריק או סטנדרטי ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה.
לאחר מכן, לכסות את הצלחת עם נייר כסף, כדי למנוע מגע עם אור. באמצעות קורא מיקרופלסטיק, להקליט את פליטת florescence. השתמש במדידות המוקלטות כדי לקבוע את הריכוז של דנ"א כפול תקוע בכל דגימה.
לאחר מכן לדלל כל מוצר מטוהר עם מים לריכוז של נקודת אפס שתי ננוגרם לכל microliter. בעקבות PCR מקונן, המוצרים המוגברים פועלים על ג'ל אגרוז אחוז אחד. ניתן לקבוע את האיכות הראשונית של ה- PCR על-ידי בדיקת הפקדים.
מכיוון שפקדים שליליים המכילים מוצר מוגבר מצביעים על זיהום ועל הבקרות החיוביות ללא מוצר מוגבר מצביעים על הגברה לא מספקת. רק בארות פועלות בדילול נקודת קצה המכילות פרווירוסים מוגברים בודדים נחשבים לתרשים. בעוד בארות המכילות proviruses מוגברת מרובים באורכים שונים ניתן לדמיין בשלב זה, הם לא צריכים להיבחר עבור רצף.
עבור הרכבת דה נובו, ניתן להעריך את איכות הרציף שהורכב לעומק מספיק ושוויון כיסוי. ניתן לזהות בשלב זה גם אוכלוסיות מעורבות על ידי נוכחות של כיסוי לא אחיד. ייצוג חזותי של הרצפים המבודדים ממשתתף אחד מגלה כי 97 אחוזים מהרצפים שלהם פגומים.
עם רצפים שלמים שנמצאו בתאי CD4 חיוביים של אפקט וזיכרון מעבר. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי רק מוצרים מוגברים שהושגו בדילול מגביל, זה המקום שבו לא יותר מ 30 אחוזים של בארות חיוביות, מכילים provirus יחיד. בעקבות הליך זה, מוצרים מוגברים ניתן לרצף כדי לקבוע את ההרכב הגנטי של פרווירוסים HIV.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום HIV לחקור את ההפצה של פרווירוסים HIV שלמים גנטית וסוגי תאים שונים בחולים על טיפול כדי לקבוע היכן גנטית שלם ופוטנציאל שכפול proviruses מוסמך להסתיר. אל תשכח כי עבודה עם תאים נגועים ב- HIV יכול להיות מסוכן ואמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים ועובד מעבדה מוסמכת תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
