אנו מודים לאגודת מקס פלנק, תכנית Frontier אדם המדע (HFSP) וBoehringer Ingelheim Fonds למימון ותמיכה.

1. הכנת חומר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של צינורות FEP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את צינור FEP (איור 2 א) על ידי שטיפת נוזלים (בצעדים האמורים להלן) דרך הצינור ובאמצעות מזרק מצורף עם צינורית קצה קהה (איור 2) באור 1:.. להשתמש בכפפות בכל הליך הערה 2: אנו ממליצים חיתוך הצינור בחתיכות של CA. 1 מ &#39;אורך וניקוי אלה במקביל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית לשטוף את הצינור עם 1 M NaOH שוב ושוב. ואז להעביר את הצינור לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר מלא 0.5 M NaOH וultrasonicate זה ל10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צינור הפולימר לאגן קטן עם DDH 2 O. שטוף את הצינור ראשון עם DDH 2 O ולאחר מכן עם EtOH 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך להעביר את צינור FEP לצינור צנטריפוגות טרי עם EtOH 70%. שוב ultrasonicate צינור צנטריפוגות זה ל10 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את צינור FEP ניקה לחתיכותשל כ 3 סנטימטר (אורך אופייני לשימוש בהרכבה והדמיה דג הזברה) ויישר אותם במידת צורך. אחסן את צינורות FEP ניקו בצינור צנטריפוגות טרי 50 מיליליטר מלא DDH 2 O (איור 2 ג). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון מניות Tricaine <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.4% מניות פתרון Tricaine ידי המסת Tricaine 400 מ&quot;ג (MS-222) ב97.9 DDH מיליליטר 2 O. לאחר האבקה נמסה לגמרי, להתאים את ה-pH 7.0 באמצעות 2.1 מיליליטר 1M טריס (pH 9.0). הגן על הפתרון מן האור. aliquots חנות ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת methylcellulose 3% <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3% פתרון methylcellulose לציפוי הפנימי של צינורות FEP כמתואר להלן. לחמם 11 E3 בבקבוק זכוכית של כ 60-70 מעלות צלזיוס ולהוסיף את הכמות המתאימה של אבקת methylcellulose. להוסיף סרגל ערבוב ומערבבים ב 4 ° C. ברגע שהפתרון הוא התקרר אל מתחת 30 מעלות צלזיוס, להוסיף פתרון Tricaine לג סופיoncentration של 100 מ&quot;ג / ל &#39; שמור ערבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של .1.5% וagarose 0.1% בE3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הכמות המתאימה של אבקת agarose נקודת התכה נמוכה בנפח מוגדר של E3 בבקבוק זכוכית. לחמם את התערובת במיקרוגל ולנער אותו פעם בכמה זמן, עד לפתרון agarose מופיע הומוגנית, ללא כל גבישים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר aliquots של .0.1% פתרון agarose ב1.5 מיליליטר צינורות תגובה. ניתן לאחסן aliquots ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפתרון 1.5% למעייל צלחת פטרי פלסטיק. עובי שכבת agarose צריך להיות CA. 2 מ&quot;מ. לאחר agarose הוא התגבש, להוסיף בינוני E3 על גבי השכבה, כדי למנוע אותו מהתייבשות. הצלחת המצופה ניתן לאחסן ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על דג הזברה מבוגר (Danio rerio) ועוברים על 28.5 מעלות צלזיוס ולטפל בהם בהתאם לפרוטוקולים שהוקמו 11,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את דגי זכר ונקבה בשעתי אחר הצהריים ולהפריד ביניהם באמצעות מחיצה. הסר את המחיצה בבוקר שלמחרת לעת ההזדווגות של הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את העוברים בצלחת מלאה בE3 ולבחון אותם באמצעות סטראו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב24 hpf (או שלב התפתחותי העניין שלך), בחר בעובר דג הזברה לביטוי הקרינה ולהעביר את החיוביות לצלחת חדשה עם E3 הטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> dechorionate את העוברים בזהירות תוך שימוש בשני מלקחיים חדים (2D דמויות ו2E). השתמש במלקחיים הראשונים כדי לתפוס ולהחזיק את סיסי ומלקחיים שני לקרוע אותו פתוח ולמשוך אותה באור 1:. בצע את הצעד הזה עם העזרה של סטראו. </li></ol></li></ol> 2. הרכבה רב שכבתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי צינור FEP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף צינורית קצה קהה למזרק. הכנס את הצינורית בזהירות במשך כ 3 מ&quot;מ לתוך קצה אחד של ניקה וחתך חתיכה. צינור FEP (2F דמויות ו2G) הערה 1: כפפות ולהימנע מכל שימוש או סחיט כיפוף של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את הקצה החופשי של צינור FEP לmethylcellulose 3% ולמלא את הצינור עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לשחרר את methylcellulose על ידי לחיצה על המזרק. מחק את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים 2.1.2 ו 2.1.3 באמצעות E3 הערה 1:. הצינורות מצופים צריכים לשמש להרכבה באופן מיידי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דג הזברה לagarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם aliquot אחד agarose 0.1% ל70 מעלות צלזיוס בגוש חום. ורטקס בקצרה צינור התגובה ולהעביר אותו לגוש חום מוגדר 38 ° C (איור 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צינור התגובה מ הגוש החום ולתת לו להתקרר לזמן קצר. הוספת Tricaine לריכוז סופי של 133-200 מ&quot;ג / ליטר ומערבולת שוב (איור 2 ט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באחד מעוברי דג הזברה dechorionated וtransfe. R אותו לצינור התגובה עם agarose 0.1% שחומם מראש באמצעות פיפטה פסטר זכוכית (י 2 דמויות ו2K) הערה 1: נסה להעביר E3 נוסף קטן ככל האפשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את העובר עם צינור FEP מצורף מזרק (איור 2L). . הצינור צריך להיות מלא לחלוטין עם agarose 0.1%, עם העובר ממוקם קרוב לקצה אחד של הצינור ועם הראש והצביע לעבר הפתח של צינור הערה 1: הקפד לקחת כמה agarose לפני תופס את הדגים. הערה 2: משוך בעדינות על המזרק כדי למנוע בועות באור 3:. שמור את הצינור בכיוון אופקי, כדי למנוע דליפה של התוכן שלה (איורים 2M ו2N). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור הצינור <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2. רב שכבתי וגובר לעוברי דג הזברה.) אתילן Fluorinated פרופילן (צינורות FEP) על תוף כבל לפני הכנה. B) מזרק עם צינורית קצה קהה המצורפת. C) ניקה וחתך צינור FEP. D, E) dechorionation של 24 hpf עוברי דג הזברה. F) חיבור הצינור לצינורית הקצה הקהה. G) המזרק עם צינורית וצינור מחובר. H) aliquot של 0.1% agarose בתוך צינור תגובה בעת העברתו לגוש חום. אני) vortexing של נמס העברת agarose. J) ספיגה של עובר dechorionated באמצעות פיפטה זכוכית. K) של העובר לagarose נמס. L) צריך של העובר עם סובבי agarose לתוך צינור FEP. M, N) עובר דג הזברה בתוך צינור FEP . <strong&gt; O) חיתוך הצינור בין דגימה וצינורית. P) לחבר את הצינור על ידי השימוש בצלחת מצופה agarose. ש) העובר בתוך הצינור המחובר. הכנת המדגם הסופית במחזיק מתכת R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי צפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הצינור מהצינורית (איור 2 טו &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להיצמד סוף הצינור המכיל את הדגים דרך כל השכבה של agarose 1.5% בצלחת הפלסטיק לחבר את הצינור (איור 2P) הערה 1:. למנוע היווצרות של בועות ולנסות לקבל משטח ישר תקע על ידי ההחזקה . צינור בדיוק בניצב לפני השטח agarose הערה 2: סובב את הצינור מעט כדי להשיג התוספת נחמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הדגימה רכוב בצינור תגובה 1.5 מיליליטר עם E3, כדי למנוע התייבשות. המדגם הוא now מוכן להיות צילם. לפני ההדמיה, לבדוק אם הדגים יושבים ממש על גבי התקע (2Q דמויות ו2R). ודא גם להוסיף Tricaine למדיום בתוך חדר ההדמיה באותו הריכוז כמו בהרכבה בינונית. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+functional+imaging+at+cellular+resolution+using+light-sheet+microscopy.">Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 10 (5), 413-420 (2013).</li><li>Swoger, J., Muzzopappa, M., L&#243;pez-Schier, H., Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+retrospective+lineage+tracing+using+SPIM+for+zebrafish+organogenesis+studies.">4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies.</a> J. Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2011).</li><li>Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques.">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J. Biophoton. , 1-11 (2012).</li><li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+real-time+developmental+biology.">Light sheet microscopy for real-time developmental biology.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 566-572 (2011).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+scanned+laser+light+sheet+fluorescence+microscopy.">Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb. Prot. 2010 (5), (2010).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+entire+embryos+with+Digital+Scanned+Laser+Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy.">Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).</li><li>Desmaison, A., Lorenzo, C., Rouquette, J., Ducommun, B., Lobjois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+sample+holder+for+single+plane+illumination+microscopy.">A versatile sample holder for single plane illumination microscopy.</a> J. Microsc. 10, (2013).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Nusslein-Volhard, C., Zebrafish Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2002).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J. Vis. Exp. (69), (2012).</li><li>Jin, S. -. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -. N., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).</li><li>Pauls, S., Geldmacher-Voss, B., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+histone+variant+H2A.F/Z+and+a+transgenic+H2A.F/Z:GFP+fusion+protein+for+in+vivo+studies+of+embryonic+development.">A zebrafish histone variant H2A.F/Z and a transgenic H2A.F/Z:GFP fusion protein for in vivo studies of embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 211 (12), 603-610 (2001).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+on+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects on ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data.">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שיטות מיקרוסקופיה מתקדמות כגון מיקרוסקופיה גיליון אור תאפשר לנו להקליט את נתוני תמונה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה במשך כמה ימים, אבל גם דורשות מדגם טכניקות הרכבה כדי לשפר. אנו מציגים פרוטוקול מפורט של multilayer הרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור של פיתוח דג הזברה. השיטה היא פשוטה ליישום ואנו משתמשים בו במעבדה שלנו על בסיס יומי. צינורות FEP רכיבים מרכזיים באסטרטגיית ההרכבה שלנו הם צינורות עשויים אתילן Fluorinated פולימר פרופילן (FEP). החלטנו להשתמש FEP בעיקר בשל מדדה השבירה של 1.338, שהוא דומה למים ולכן מתאים באופן אידיאלי למיקרוסקופיה גיליון אור עם מטרות מים טבילה ודגימה הדורשת תקשורת מימית. הצינורות עם 0.8 מ&quot;מ קוטר פנימי ו0.4 עובי דופן מ&quot;מ יתאים לדג הזברה מתפתח יפה מאוד, ניתן להשתמש בם עם מחזיקי מדגם טיפוסיים המתאימים ל1.6 מ&quot;מ<html> נימים והם הבחירה הראשונה שלנו לשיטת ההרכבה הציגה. בדקנו אותם ביסודיות בהגדרות בבנייה העצמית שלנו, כמו גם במערכת המסחרית &quot;Lightsheet Z.1&quot; על ידי Carl Zeiss מיקרוסקופית ומצאנו כי צינורות FEP מציעים יציבות לטווח ארוך, יש השפעה מינימאלית בלבד על ביצועים אופטיים ו10 nonfluorescent. הם, לעומת זאת, אינם מתאימים ליישומים עם דגימות שדורשות מקדם שבירה שונה, למשל פינה דגימה. צינורות, כמו גם שקפים עשויים FEP זמינים במגוון רחב של קטרים ​​ועוביים. בנוסף, ניתן להמס FEP ב 260 ° C ובכך מציע אפשרויות אינסופיות כמעט למדגם תומך הרכבה בהזמנה אישית. צינורות הפולימר נוטים להיות מסופקים לא סטרילי, ולכן פרוטוקול הניקוי משלב מספר צעדים על מנת להבטיח האיכות אופטית הטובה ביותר. הציפוי עם methylcellulose מבטיח ששום חלק של עובר דג הזברה גדל מקלות לפולימר. התחת =&gt; ההרכבה בינונית &quot;jove_step&quot; ההחלטה לagarose 0.1% מבוססת על בדיקות מקיפות של שיעור צמיחה וחוסר תנועה בריכוזים שונים של agarose וmethylcellulose 10. ריכוזי agarose מעל 0.1% כבר הראו השפעה חמורה על קצב הצמיחה של 24 דג הזברה hpf. בנוסף אנו משתמשים במינונים נמוכים של תרופות ההרדמה Tricaine. פוטנציאל פעולה בלוקים Tricaine, ובכך מעכב את העברת האותות בין המוח ושרירים ומדכא התכווצויות שרירים 16. ריכוז של 133-200 מ&quot;ג / ליטר מבטיח חוסר תנועה מספקת של דג הזברה בין 24-72 hpf. עם זאת, Tricaine וסמים הרדמה אחרים שבדקו מינון מופע תופעות לוואי תלוי כגון בצקת לב. בנוסף המינון הנדרש של Tricaine משתנה עם השלב ההתפתחותי של העובר. לכן אנו ממליצים להקטין את ריכוז Tricaine לסכום הדרוש לשלבי ההתפתחות שהם צילמו. כדי להבטיח performan הטוב ביותרce ולמנוע היווצרות של תוצרי לוואי רעיל, יש להשתמש בפתרון מניות Tricaine מוכן או מופשר טריים, מוגן מפני אור ולא מחומם מעל 30 ° C. ההטבעה בצינורות FEP גם מאפשרת שינוי קל של ההרכבה בינונית לתת דין וחשבון לצרכי ספציפיים. עבור זמן לשגות הדמיה של הלב, מומלץ להשתמש methylcellulose 3% ו100 מ&quot;ג / ליטר Tricaine במקום agarose 0.1% ו200 מ&quot;ג / ליטר להרכבה. Methylcellulose הוא צמיג יותר מ -0.1% agarose ובכך לספק חוסר תנועה גבוהה יותר בעצמה ופחות Tricaine צריך לשמש כדי להבטיח כליאה של העובר. Tricaine רגיש לטמפרטורות מעל 30 מעלות צלזיוס, ויכול גם להיות מדולל על ידי הבינוני בחדר ההדמיה, מה שמוביל לירידה בביצועים ומתעוות האפשרית של העובר. לפיכך, הקפד גם להשתמש Tricaine במדיום ההדמיה שבדגימה רכוב היא שקועה. אם הניסויים שלך דורשים שימוש גבוה יותרטמפרטורות, אנו ממליצים להחליף את המדיום בחדר ההדמיה או כל הזמן על ידי שימוש במערכת זלוף או ידני עם צינור ומזרק בין שתי נקודות זמן. שלבים קריטיים השלבים הקריטיים בתהליך של הרכבת מדגם הם הצריכה של הדגימה לתוך הצינור וההחדרה של תקע agarose. הצריכה מגדירה את עמדתו הראשונית של העובר, שהוא מסורבל לשנות לאחר מכן. דגימות מרובות צריכה להיות זמינות לעלות וצריכה להיות במעקב באיכות ההרכבה עם סטראו. אם כיוון המדגם אינו משביע רצון, לשנות את המהירות של ציור את הדגימה והימנעות התנועות הבאות של הבוכנה עשוי לעזור כמו זה לעתים קרובות מסובב את העובר. 1.5% תקע agarose הוא הכרחי כדי למנוע דליפה של agarose .0.1%. פני השטח של התקע בתוך הצינור צריך להיות שטוחים לא להשפיע על הנטייה המדגם במהלך פיתוח. כדי להשיג גלישה טובהאס, בעוביים שונים של שכבות agarose צריכים להיבדק והצינור צריך להיות הכניס לתוך agarose הרגיל אל פני השטח. מסתובב הצינור קצת ומוציא את הצינור משחרר בזהירות את התקע מהצלחת. איכות ההרכבה יש לבדוק עם סטראו לפני ההדמיה. הדמיה Multiview אחד יתרונות גדולים של מיקרוסקופיה גיליון אור הוא ההדמיה Multiview, היכולת לסובב את הדגימה, לרכוש Z-ערימות מזוויות מרובות ולאחר מכן להירשם ולמזג אותם. שיטה הוקמה לרשום Z-הערימות בחלל 3D היא רישום מבוסס חרוז באמצעות חרוזי ניאון המקיפים את המדגם כסמני אמונים 17. שיטה זו אך מסתמכת על הרכבה בינונית מוצקה כגון agarose 1.5% ונראה אפוא להיות בקנה אחד עם multilayer הרכבה שהוצג כאן. אבל כמה פתרונות חלופיים לעבוד בהתאם ליישום. ראשית, חרוזי הניאון יכוליםישולב בתקע agarose, שצריך להיות בשדה הראייה במהלך הרכישה. שנית, יכולות להיות מכוילים עמדות השלב שלפני הניסויים בפועל באמצעות טור agarose 1.5% עם חרוזי ניאון. שלישית, ניתן להשתמש בם סמנים חלופיים כגון גרעיני ניאון כדי לזהות את המיקום של Z-הערימות יחסית זה לזה. התאדות setups מיקרוסקופיה גיליון האור אופייני להשתמש מדגם חדר פתוח, מה שמוביל לאידוי הבלתי נמנע של המדיום. מאז המדיום הוא חיוני להישרדותה של הדגימה, כדי להגביל את האידוי של מדיום ההרכבה ולמקדם השבירה הנכונה בין אופטיקה ומדגם, אנו ממליצים לקחת אחד או יותר מהאמצעים הבאים כדי למנוע אידוי. ראשית, בינוני בתא ניתן להחליף כל הזמן על ידי מערכת זלוף. שנית, המדיום יכול להיות ומילא באופן ידני. שלישית, התא יכול להיות מכוסה במכסה או בנייר כסף גמיש. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; אספקת חמצן FEP הפולימר פותח כדי לעמוד במגוון רחב של חומרים כימיים ולכן הוא חזק, אינרטי מבחינה כימית וnonpermeable לגז. במקרה של חמצן רב שכבתי הרכבה יכולה רק לחדור דרך תקע agarose וממשק agarose באוויר, אבל זה עדיין לא הראה אם ​​אספקת החמצן בהרכבה רב שכבתית היא בחומרה נמוכה יותר בהשוואה להתקנה ב1.5% agarose מבלי לתמוך בצינור פולימר. עם זאת, כמו בהרכבת agarose 1.5% יכולים לשמש רק כשעתיים לפני מורפולוגיה דג הזברה מושפעת הרכבה רב שכבתית נראה שיש הפתרון מעולה הכולל הדמיה לטווח ארוך. הדמיה בשלבים מוקדמים יותר של פיתוח רב שכבתי והרכבה הפכה כעת טכניקת ההטבעה סטנדרטית שלנו למיקרוסקופיה גיליון אור הזמן לשגות של hpf מבוגרת מ24 דג הזברה. חוץ מזה, אנחנו גם להשתמש בצינורות הפולימר להדמיה של עוברי שלב מוקדם יותר. הדוארmbryos להישאר בchorions והם רכובים בצינור FEP עם קוטר פנימי של 1 מ&quot;מ ומלא E3. דג הזברה יכולה לפתח בחופשיות בתוך סיסית ועדיין יכולה להיות צילמה גם באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור. השקפה הרכבת המדגם רב שכבתי הציגה משחררת את מלוא הפוטנציאל של מיקרוסקופיה גיליון אור לביולוגיה התפתחותית בזמן אמת עם דג הזברה. זה יכול בקלות להיות מאומץ על שיטות מיקרוסקופיה אחרות כגון טומוגרפיה אופטית הקרנה (OPT) ואורגניזמים אחרים. אנו מאמינים כי צינורות FEP בגודל הסטנדרטי הם רק הצעדים הראשונים לקראת מדגם טכניקות הרכבה המותאמת לצרכי ספציפיים.

כדי להבין את האירועים המורכבים ויחסי גומלין בעובר, במחקר בביולוגיה התפתחותית הוא יותר ויותר עוברים ממיקרוסקופי של תאים ואיברים בודדים להדמית vivo של כל האורגניזמים. שיטות מיקרוסקופיה מסורתיות בדרך כלל לא מצליחות להציע פתרון מרחב ובזמן לעקוב אחר אירועים מהירים על פני תקופה ארוכה של זמן ולעתים קרובות גורמות להלבנה או תופעות phototoxic במדגם 1. אנחנו ואחרים מצאו מיקרוסקופיה גיליון אור (איור 1) להיות הטכניקה האידיאלית עבור ההדמיה vivo של דג הזברה 2-4. התאורה של המדגם עם סדין דק של אור הלייזר, מאונך לציר זיהוי, מציעה חתך אופטי מהיר עם רזולוציה מרחבית גבוהה, כמו גם למזער צילום רעילות 5. במקביל, בשל הסדר אופטי ייחודי זה, טכניקות הרכבת מדגם מסורתיות באמצעות צלחות פטרי או תאי תרבות אינן מתאימות. באור טיפוסישלושה מנועים translational מיקרוסקופ הגיליון ומנוע סיבובי להחזיק את המדגם, כך שזה יכול להיות ממוקם בדיוק, הסתובב ומבט מכל כיוון. בדגימות האחרונות למיקרוסקופיה גיליון אור יש לעתים קרובות היה משובץ ב1-2% agarose בתוך נימי זכוכית 6,7. במקרה זה הצילינדר agarose הקרושה עם הדגימה מוטבעת הנמתח מנימי הזכוכית לתוך תא המדגם מלא בינוני כמו מים להדמיה. יש agarose מקדמת שבירה קרובה למים, ולכן הוא מתאים באופן מושלם למיקרוסקופיה גיליון אור in vivo המאפשרת אופטיקה תאורה וזיהוי תיקן מים. המדגם מוגבל בagarose הנוקשה וניתן הדמיה גם לתקופה קצרה של זמן, אבל שינויים וצמיחה של העובר morphogenetic הם מאוד לקויים כאשר הדמיה במשך כמה שעות 7,8. למרות שפתרונות עבור יישומים אחרים פותחו 9, דג הזברה הזמן לשגות לטווח ארוך לא פולשנית<html> יכולת צילום במיקרוסקופ אור גיליון לא ניתן לנצל באמצעות הטבעת agarose 1.5% הקונבנציונלית. לפיכך, אנו פיתחנו אסטרטגית הרכבה חדשה למיקרוסקופיה גיליון אור vivo של עוברי דג הזברה 10. המדגם הוא רכוב ב0.1% agarose עם Tricaine 200 מ&quot;ג / ליטר בתוך צינור עשוי מפולימר אתילן Fluorinated ברור אופטי פרופילן (FEP). העובר המוטבע מתפתח בדרך כלל עקב צמיגות נמוכה של המדיום. במקביל, צינור FEP מגביל את המדיום ואת המדגם עבור משך הניסוי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט של הטכניקה החדשה ההרכבה ומציג נתונים המשקפת את היתרונות שלה על פני הפרוטוקול הקונבנציונלי. אנו מראים כי עם התפתחות דג הזברה השיטה שלנו ניתן הדמיה ברציפות עם רזולוציה מרחבית ובזמן גבוה על פני תקופה של יותר מיומיים. 5in &quot;עבור: src =&quot; &quot;/&gt; /&quot; = src &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg איור 1. העיקרון של מיקרוסקופיה גיליון אור. דג הזברה רכוב בצינור עשוי אתילן Fluorinated פרופילן (FEP) יכול להיות מתורגמת ומסובב דרך מישור המוקד של מטרת זיהוי. סדין דק של אור הלייזר (גיליון אור) צפוי על ידי מטרת התאורה למישור המוקד של מטרת האיתור ומאיר סעיף אופטי דק בלבד של הדגימה. אות הקרינה הנפלטת נאסף על ידי מטרת האיתור ונרשמה על שבב מצלמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

מיקרוסקופיה גיליון אור היא טכניקת הדמיה האידיאלית ללמוד התפתחות עוברית דג הזברה. בשל צילום רעילות והלבנה מינימליות, הוא מתאים במיוחד לזמן לשגות הדמיה לטווח ארוך על פני שעות רבות עד מספר ימים. עם זאת, יש צורך במדגם אסטרטגית הרכבה מתאימה, אשר מציעה גם כליאה והתפתחות תקינה של המדגם. רב שכבתי וההרכבה, טכניקת הטבעה חדשה באמצעות agarose ריכוז נמוך בצינורות ברורים אופטי, החברה מתגברת על מגבלה זו ומשחררת את מלוא הפוטנציאל של מיקרוסקופיה גיליון אור לביולוגיה התפתחותית בזמן אמת.

ההדמיה multiday של דג הזברה כלי דם פיתוח אנו משתמשים ב1 DPF Tg (kdrl: GFP) 13 דג הזברה כדי להדגים את היתרונות של אסטרטגית הרכבה רב שכבתית למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך. המטרה היא תמונת ההתפתחות של כלי הדם בכל דג הזברה על קורס של 2 ימים. עובר דג הזברה היה רכוב ב0.1% agarose בתוך צינור פולימר methylcellulose מצופה. הנה, דג הזברה אינה מוגבל על ידי ההרכבה בינונית ויכולה להתפתח באופן נורמלי. ראשו מעלה, הזנב מרחיב כלי דם וההנבטה מופיעה באין מפריעה (איור 3). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> איור 3. הדמיה multiday של פיתוח כלי הדם דג הזברה. כלי הדם של multilayer רכוב 1 DPF Tg (kdrl: GFP) 13 דג הזברה מתפתחת באין מפריע במיקרוסקופ גיליון אור במשך יומיים. גיליון אור הלייזר 488 ננומטר הלהיב את הקרינה ואת האות זוהתה באמצעות 10X/0.3 אובייקטיבי W ומצלמה EMCCD. Z-ערימות נרכשו על ארבעה עמדות סמוכות כל 10 דקות ולאחר מכן תפרו עם 15 פיג&#39;י. תחזיות בעוצמה מקסימלית של קבוצת משנה של נקודות זמן מוצגות. בר סולם:. 500 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> הדמיה של דג הזברה מוקדם עובר הנה, אנחנו מדגימים את היכולת של צינורות FEP כתמיכה גוברת למיקרוסקופיה גיליון אור של עובר דג הזברה מוקדם ביום הראשון לאחר הפריה. Hpf Tg 8 (H2A: GFP) 14 עובר דג הזברה היה רכוב עם סיסי בשלמותה בתוך צינור מלא-E3 עם iקוטר nner של 1 מ&quot;מ. כי תוצאות בהידוק קל של סיסית. כל התהליכים התפתחותיים בעובר אינם מושפעים על ידי ההרכבה וניתן דמיינו בצורה אופטימלית באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור. בדוגמא זו, אנו צילמו את הדגימה מעל במהלך שעות 12 (איור 4). אופייני צורת שינויים בעובר מוקדם, כגון התארכות הגוברת של החלמון והעיבוי של רקמות לאורך קו האמצע, יהיו מדוכאים בעת שימוש בהרכבה המסורתית ללא סיסי בagarose 1.5%. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . איור 4 הדמיה של עובר דג הזברה המוקדם Tg (H2A: GFP). דג הזברה 14 עוברת עובר מוקדם. GFP נרגש גיליון אור הלייזר 488 ננומטר ואות הקרינה זוהועם מטרת W 10X/0.3 ומצלמה EMCCD. Z-ערימות משתי זוויות נרכשו כל 3 דקות במהלך של שעות 12. תחזיות בעוצמה מקסימלית מנורמלות של קבוצת משנה של הזמן לשגות מוצגות. טשטוש גלוי תנועה ב19 תוצאות hpf מהרעד העובר במהלך רכישה, שכן אין הרדמה היו בשימוש. בר סולם:. 150 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish at JoVE.com

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

ההתפתחות של דג הזברה יכולה להיות אחרי על פני ימים עם מיקרוסקופיה גיליון אור כאשר עוברים מוטבעות בצינורות פולימר ברורים אופטי עם agarose ריכוז נמוך.

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

multilayer-mounting-for-long-term-light-sheet-microscopy-of-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  ההתפתחות של דג הזברה יכולה להיות אחרי על פני ימים עם מיקרוסקופיה גיליון אור כאשר עוברים מוטבעות בצינורות פולימר ברורים אופטי עם agarose ריכוז נמוך. 

Video: Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

לטווח ארוך הדמיה בתאי יונקים באמצעות מיקרוסקופית שדה רחב

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

יישום של שרף אור נרפא, דבק שיניים אלקטרודות הרכבה או בדיקות Microdialysis בניסויים כרונית

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור של שורשי הצמח גדל על פני השטח של ג&#39;ל

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, שיטה להרכבה ממושכת על זחל לטווח ארוך הדמיה לזמן קצר

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.