המחברים רוצה להודות באדן-וירטמברג Stiftung לתמיכה הפיננסית שלהם במסגרת "סינתזה חומר Bioinspired" (BioMatS-14).

1. הידרוג הכנה
<ol>
	<li>מערבבים 200 מ ג של BSA עם 1 מ"ל של יונים H2O ליצירת מלאי BSA 20% (w/v) (מניות פתרון A).</li>
	<li>µL 165 תערובת של THPC פתרון (134 mg/mL) עם 4.835 מ ל מים יונים כדי ליצור THPC במניה פתרון (פתרון מניות B).</li>
	<li>שוקל 1 מ ג של KCSSGKSRGDS (1,111.1 g/mol) פפטיד (או של פפטיד תא-דבק המקביל), למהול אותו ב- µL 100 סטרילי H2O להשגת פתרון 10 מ"ג/מ"ל (מניות פתרון C). הערה: שלב זה הוא אופציונלי והוא רק צריך להיכלל אם הידרוג נועדה ליישום התרבות תאים.</li>
	<li>להסיר את החלק התחתון של צלחת 96-ובכן ולהחליף אותו עם ניילון נשלף. הערה: עבור לוחות המשמש כאן, התחתון אפשר להסיר בקלות על ידי הפעלת לחץ בתחתית כל טוב; בתחתית פלסטיק דק פשוט יפול החוצה.</li>
	<li>מיקס 100 µL של פתרון מניות BSA (א) ו- µL 100 של THPC במניה פתרון (B) (אופציונלי: 4 µL של מניות פתרון C hydrogels functionalized, תא-דבק) בצלחת 96-ובכן כדי לקבל 200 µL של הידרוג. לערבב את המרכיבים על ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 5 פעמים כדי להבטיח הידרוג אחיד לאחר הפילמור.</li>
	<li>מקם את הצלחת 96-ובכן בטמפרטורת החדר (RT) למשך כ- 10 דקות עד כל hydrogels הם polymerized כראוי.</li>
	<li>לאט ובזהירות להסיר את ניילון נצמד מהחלק התחתון של הלוח.</li>
	<li>הקש את hydrogels מהצלחת 96-ובכן באמצעות חותמת קטנה, להעביר אותם ל 1.5 mL צינורות עם PBS סטרילי, pH 7.4. הערה: hydrogels יש בצורת גליל, עם קוטר של 4 מ מ, גובה של 8 מ מ.</li>
	<li>אחסן את hydrogels באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C עד מספר חודשים.</li>
</ol>
2. ליופיליזציה את Hydrogels
<ol>
	<li>למלא 1.5 mL צינורות µL 500 סטרילי יונים H2O, הסירי את הפקק. להעביר את hydrogels 1.5 mL התגובה הצינורות בעזרת מרית.</li>
	<li>לעטוף את הצינורות 1.5 mL בחוזקה עם פרפין הסרט--לפחות שלוש שכבות עבור כל מבחנה. שימוש במחט לנקב חורים קטנים בסרט כדי לאפשר שחרור הגז באמצעות הרכבת התחתית.</li>
	<li>המשך לאחד השלבים הבאים:
	<ol>
		<li>להעביר את המבחנה חנקן נוזלי פתרון עבור 5 דקות כדי להבטיח כי המים של הידרוג לחלוטין להקפיא. מיד לאחר הסרת של החנקן הנוזלי, להעביר את הבקבוקונים ההקפאה מייבש כדי למנוע את החומר מפשיר. הערה: הליך זה תוצאות הנקבוביות על 10-15 מיקרומטר ברדיוס.</li>
		<li>שמור את הבקבוקונים ב-20 ° C בלילה לאט להקפיא את hydrogels. מיד לאחר הסרת מ-20 ° C, להעביר את הבקבוקונים ההקפאה מייבש כדי למנוע את החומר מפשיר. הערה: הליך זה תוצאות הנקבוביות על 50-60 מיקרומטר ברדיוס.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לאחר 24 שעות (אידוי מוחלט של המים סביב את הידרוג), להפשיר את החומר על-ידי הסרתו מכוננים ההקפאה מייבש. הערה: ניתן לנתח את גודל הנקבוביות עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (שלב 5, "הידרוג ויזואליזציה").</li>
</ol>
3. חלקיקים שטיפת
<ol>
	<li>הכינו את הידרוג כמתואר בצעדים 1.1-1.5.</li>
	<li>לאחר ערבוב המרכיבים, להוסיף ישירות NaCl עד רוויה מתרחשת (36 מ"ג/מ"ל). מוסיפים מלח עד גביש מלח ניתן לראות בפתרון התמיסה לבן.</li>
	<li>להעביר את הצלחת 96-ובכן מטרף ומנערים עד הפילמור מתרחש (כ- 10 דקות). הסר את hydrogels הצלחת, כמתואר בצעדים 1.7-1.8.</li>
	<li>דגירה של hydrogels לפחות 24 שעות ביממה במלון RT במים סטריליים על מטרף (20 סל ד) כדי elute כל מלח מן התבנית הידרוג. לאחסן את hydrogels ב 4 ° C ב- PBS עבור אפילו מספר חודשים.</li>
</ol>
4. ערוץ היווצרות
<ol>
	<li>להכין hydrogels כפי שמתואר בשלב 1. להסיר את הידרוג הפתרון באמצעות מלקחיים ומרוקנים את המים העודפים עם נייר סופג מאוד, מניחים אותה על גוש קרח יבש.</li>
	<li>להקפיא את הידרוג ב-30 s בזהירות להסיר אותו מהגוש. לא לעשות נזק של הידרוג; בזהירות להשתמש מרית לגרד אותו הבלוק. להעביר את הידרוג צינור 1.5 מ"ל וזה יבש לילה ב 37 º C.</li>
</ol>
5. הידרוג ויזואליזציה
<ol>
	<li>הכן פתרון מניות rhodamine B על ידי דילול 1 מ ג של rhodamine B ב- 10 מ"ל ל- PBS. להכין לדילול טורי על-ידי דילול הפתרון rhodamine מניות ב- PBS עד ריכוז של 0.001 מ"ג/מ"ל (דילול פקטור: 100)</li>
	<li>הסר את הידרוג הפתרון אחסון (למשל, משלב 2.4.), להעביר אותו צינור 1.5 מ עם 1 מ"ל של 0.01 מ"ג/מ"ל rhodamine B פתרון. מכתים את הידרוג לילה ב- rhodamine B פתרון RT.</li>
	<li>למחרת, להעביר את הידרוג אשר ניתן לאבחן עד 10 מ"ל של PBS (pH 7.4) ושטוף במשך לפחות 3 שעות.</li>
	<li>להעביר את הידרוג לשקופית ממוצע-8 היטב, לכסות אותו. עם PBS.</li>
	<li>לחתוך פרוסות קטנות הידרוג (בערך גובה 0.5 מ מ בתוך) באמצעות סכין.</li>
	<li>באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ, להמחיש את הידרוג באורך-גל של 514 nm (המטרה: EC תוכנית-Neofluar 40 x / 1.30 שמן DIC M27, המטוס במצב סריקה: 514 ננומטר, and זום: 1 X).</li>
</ol>
6. תא תרבות היתכנות
<ol>
	<li>מסנן סטרילי כל מלאי פתרונות (A, B ו- C) עם מסנן 0.45 מיקרומטר.</li>
	<li>הכינו את הידרוג כמתואר בצעדים 1.1-1.4, כולל את פפטיד תא-דבק לפני הידרוג הפילמור.</li>
	<li>לאחר ערבוב המרכיבים, מיד pipette את התערובת לתוך ממוצע-שקופית 8 טוב עד החלק התחתון מכוסה לגמרי. הערה: שלב זה חייב להתבצע ישירות ובמהירות לאחר ערבוב את הרכיבים, כמו הפילמור מתרחש בתוך דקות בשקופית.</li>
	<li>התרבות התאים אדהזיה, מעבר כדי לקבל השעיה תא בודד באמצעות טכניקות תרבות תא סטנדרטי. להעביר את התאים מראש ומחוממת, אמצעי סטרילי של תרבות תא DMEM בתוספת סרום שור עוברית (FBS, 10% (w/v)), פניצילין-סטרפטומיצין (1% (w/v)), והפתרון חומצת אמינו שאינן חיוניות (גברתי, 1% (w/v)).</li>
	<li>הרוזן את התאים עם נויבאואר ספירת קאמרית, בזהירות פיפטה µL 200 של מספר תאים (2 x 105 תאים/cm2) על גבי משטח הידרוג הרצוי.</li>
	<li>מכסה את ממוצע שקופית 8 עם המכסה, להעביר אותו אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). תקופת דגירה של פחות 4 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר לפחות 4 שעות של קובץ מצורף הסלולר, לשטוף את התאים פעמיים עם 200 µL של תרבית תאים סטרילי PBS.</li>
	<li>לתקן את התאים µL 200 פורמלין 3.7 אחוזים (v/v) למשך 10 דקות ב RT. ולשטוף פעמיים עם PBS (~ 200 µL). הערה: ללבוש ציוד מגן אישי המתאים בעת טיפול פורמלדהיד.</li>
	<li>Permeabilize התאים עם 200 µL של 0.1% X טריטון עבור 5 דק לשטוף פעמיים עם PBS.</li>
	<li>כתם התאים עם phalloidin-rhodamine על-ידי ערבוב µL 5 מניות methanolic עם µL 195 ל- PBS והוספת זה לתאים-כתם RT. את התאים עבור 20 דקות בחושך. לשטוף פעמיים עם PBS.</li>
	<li>לחקור את מאפייני אדהזיה תא בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי 514 nm (המטרה: EC תוכנית-Neofluar 40 x / 1.30 שמן DIC M27, המטוס במצב סריקה: 514 ננומטר, and זום: 1 X). לנתח את התמונות באמצעות תוכנה מתאימה (ראה את הטבלה של חומרים).</li>
</ol>
7. הידרוג מאפיינים
<ol>
	<li>נפיחות יחס.
	<ol>
		<li>יבש לחלוטין את hydrogels ב 37 מעלות צלזיוס לפחות ליום אחד.</li>
		<li>שוקל כל הידרוג ורשום את המשקל המדויק.</li>
		<li>למלא צינור תגובה 2 מ ל mL 1.5 ל- PBS.</li>
		<li>להעביר את הידרוג לתוך הצינורית התגובה הזאת 2 מ"ל, לגמרי לטבול אותו ב- PBS.</li>
		<li>להשאיר את הידרוג לפחות יומיים ב- PBS ב RT להגיע שיווי משקל עם טוב, מגניב.</li>
		<li>לאחר שלושה ימים, להסיר את הידרוג הפתרון, לייבש אותו עם ממחטת נייר כדי להסיר עודפי מים מפני השטח הידרוג.</li>
		<li>שוקלים את הידרוג.</li>
		<li>לחשב את יחס נפיחות באמצעות הנוסחה הבאה: 
		<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55813/55813eq1.jpg"> כאשר Wd הוא משקל של הג'ל מיובשים (שלב 7.1.2.) ו- Ws הוא המשקל של הג'ל רטוב (שלב 7.1.7). הכפל עם 100 כדי לקבל את אחוז יחס נפיחות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>יציבות pH וטמפרטורה.
	<ol>
		<li>להעביר 5 מ של PBS צינור תגובה 15-mL.</li>
		<li>התאם את פתרון ה-pH המתאים (למשל, pH 2, 7 או 10) עם NaOH, HCl. הביאו הפתרון הטמפרטורה המתאימה (למשל, RT, 37 ° C או 80 ° C).</li>
		<li>להעביר את הידרוג זה להיחקר על יציבותו לתוך הפתרון המתאים. להתאים מחדש את ה-pH במידת הצורך. הערה: כל hydrogels צריך להיות לגמרי נפוחות בשלב זה (ראה את היחס נפיחות) כדי למנוע פרשנות שגויה של המשקל עקב הנפיחות של החומר.</li>
		<li>לאחר במרווחי זמן מסוימים, להסיר את הידרוג מהפתרון (למשל, כל שעה עד 2 ימים), לייבש אותו עם ממחטת נייר סופג מאוד להסיר את המים העודפים, שוקל אותה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>השפלה אנזימטיות.
	<ol>
		<li>להכין פתרון אנזים מניות של 300 U טריפסין, פפסין, לפי הוראות היצרן.</li>
		<li>להעביר את הידרוג (למשל, משלב 1.8) הפתרון המתאים. הערה: כל hydrogels צריך להיות לגמרי נפוחה בשלב זה כדי למנוע פרשנות שגויה של המשקל.</li>
		<li>לאחר במרווחי זמן מסוימים, להסיר את הידרוג מהפתרון (למשל, כל שעה), לייבש אותו עם ממחטת נייר סופג מאוד להסיר את המים העודפים, שוקל אותה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirki, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics.">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine. 5 (3), 469-484 (2011).</li><li>Liu, Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomimetic+hydrogel+based+on+methacrylated+dextran-graft-lysine+and+gelatin+for+3D+smooth+muscle+cell+culture.">A biomimetic hydrogel based on methacrylated dextran-graft-lysine and gelatin for 3D smooth muscle cell culture.</a> Biomaterials. 31 (6), 1158-1170 (2010).</li><li>Raic, A., R&#246;dling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomimetic+macroporous+PEG+hydrogels+as+3D+scaffolds+for+the+multiplication+of+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).</li><li>Wong Po Foo, C. T. S., Lee, J. S., Mulyasasmita, W., Parisi-Amon, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-component+protein-engineered+physical+hydrogels+for+cell+encapsulation.">Two-component protein-engineered physical hydrogels for cell encapsulation.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 106 (52), 22067-22072 (2009).</li><li>Zhu, J., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+properties+of+hydrogel+tissue-engineering+scaffolds.">Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds.</a> Expert Rev Med Devic. 8 (5), 607-626 (2011).</li><li>Samaryk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+Approach+to+Develop+Porous+Hydrogels+with+a+Regular+Pore+Distribution+and+Investigation+of+their+Physicomechanical+Properties.">Versatile Approach to Develop Porous Hydrogels with a Regular Pore Distribution and Investigation of their Physicomechanical Properties.</a> J Appl Polym Sci. 114 (4), 2204-2212 (2009).</li><li>Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+3D+cell+culture:+potential+application+for+tissue-based+bioassays.">Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays.</a> Bioanalysis. 4 (12), 1509-1525 (2012).</li><li>Park, H., Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Swelling+Ratio+of+Injectable+Hydrogel+Composites+on+Chondrogenic+Differentiation+of+Encapsulated+Rabbit+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+In+Vitro.">Effect of Swelling Ratio of Injectable Hydrogel Composites on Chondrogenic Differentiation of Encapsulated Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells In Vitro.</a> Biomacromolecules. 10 (3), 541-546 (2010).</li><li>Stokols, S., Tuszynski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fabrication+and+characterization+of+linearly+oriented+nerve+guidance+scaffolds+for+spinal+cord+injury.">The fabrication and characterization of linearly oriented nerve guidance scaffolds for spinal cord injury.</a> Biomaterials. 25 (27), 5839-5846 (2004).</li><li>Sung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Impact+of+2D+and+3D+Fibroblast+Cultures+on+In+Vitro+Breast+Cancer+Models.">Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models.</a> PLoS One. 8 (10), 1-13 (2013).</li><li>Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+hydrogel+guidance+channels+facilitate+regeneration+of+adult+rat+brainstem+motor+axons+after+complete+spinal+cord+transection.">Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection.</a> J Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).</li><li>Shoichet, M. S., Li, R. H., White, M. L., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+hydrogels+used+in+cell+encapsulation:+An+in+vitro+comparison+of+alginate+and+agarose.">Stability of hydrogels used in cell encapsulation: An in vitro comparison of alginate and agarose.</a> Biotechnol Bioeng. 50 (4), 374-381 (1996).</li><li>Chiu, Y. -. C., Kocag&#246;z, S., Larson, J. C., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+physical+and+mechanical+properties+of+porous+poly+(ethylene+glycol)-co-(L-lactic+acid)+hydrogels+during+degradation.">Evaluation of physical and mechanical properties of porous poly (ethylene glycol)-co-(L-lactic acid) hydrogels during degradation.</a> PloS One. 8 (4), e60728 (2013).</li><li>Jonker, A. M., L&#246;wik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-+and+Protein-Based+Hydrogels.">Peptide- and Protein-Based Hydrogels.</a> Chem Mater. 24 (5), 759-766 (2012).</li><li>Bodenberger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+bread+and+beer:+whole+cell+protein+extracts+from+baker's+yeast+as+a+bulk+source+for+3D+cell+culture+matrices.">Beyond bread and beer: whole cell protein extracts from baker's yeast as a bulk source for 3D cell culture matrices.</a> Appl Microbiol Biot. 101 (5), 1-11 (2016).</li><li>Bodenberger, N., Paul, P., Kubiczek, D., Walther, P., Gottschalk, K. E., Rosenau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cheap+and+easy+to+handle+protein+hydrogel+for+3D+cell+culture+applications+a+high+stability+matrix+with+tunable+elasticity+and+cell+adhesion+properties.">A novel cheap and easy to handle protein hydrogel for 3D cell culture applications a high stability matrix with tunable elasticity and cell adhesion properties.</a> Chem Sel. 1 (7), 1353-1360 (2016).</li><li>Agarwal, S., Wendorff, J. H., Greiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+electrospinning+technique+for+biomedical+applications.">Use of electrospinning technique for biomedical applications.</a> Polymer. 49 (26), 5603-5621 (2008).</li><li>Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-electrospraying+and+droplet-based+microfluidics:+control+of+cell+numbers+within+living+residues.">Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues.</a> Biome Mater. 5 (2), 21001 (2010).</li><li>Jayasinghe, S. N., Irvine, S., McEwan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+electrospinning+highly+concentrated+cellular+suspensions+containing+primary+living+organisms+into+cell-bearing+threads+and+scaffolds.">Cell electrospinning highly concentrated cellular suspensions containing primary living organisms into cell-bearing threads and scaffolds.</a> Nanomedicine. 2 (4), 555-567 (2007).</li><li>Selimovi&#263;, &. #. 3. 5. 2. ;., Oh, J., Bae, H., Dokmeci, M., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+strategies+for+generating+cell-encapsulating+hydrogels.">Microscale strategies for generating cell-encapsulating hydrogels.</a> Polymers. 4 (3), 1554-1579 (2012).</li><li>Annabi, N., Nichol, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+porosity+and+microarchitecture+of+hydrogels+for+tissue+engineering.">Controlling the porosity and microarchitecture of hydrogels for tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. 16 (4), 371-383 (2010).</li><li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+matrices:+state+of+the+art.">Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).</li><li>Bodenberger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methods+for+pore+generation+and+their+influence+on+physio-chemical+properties+of+a+protein+based+hydroge.">Evaluation of methods for pore generation and their influence on physio-chemical properties of a protein based hydroge.</a> Biotech Rep. 12, 6-12 (2016).</li><li>Raja, S. T. K., Thiruselvi, T., Mandal, A. B., Gnanamani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+and+redox+sensitive+albumin+hydrogel:+A+self-derived+biomaterial.">pH and redox sensitive albumin hydrogel: A self-derived biomaterial.</a> Sci Rep. 5, 15977 (2015).</li><li>Hennink, W. E., van Nostrum, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+crosslinking+methods+to+design+hydrogels.">Novel crosslinking methods to design hydrogels.</a> Adv Drug Deliver Rev. 64, 223-236 (2012).</li><li>Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrakis(hydroxymethyl)+phosphonium+chloride+as+a+covalent+cross-linking+agent+for+cell+encapsulation+within+protein-based+hydrogels.">Tetrakis(hydroxymethyl) phosphonium chloride as a covalent cross-linking agent for cell encapsulation within protein-based hydrogels.</a> Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2008).</li><li>Cal&#243;, E., Khutoryanskiy, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomedical+applications+of+hydrogels:+A+review+of+patents+and+commercial+products.">Biomedical applications of hydrogels: A review of patents and commercial products.</a> Eur Polym J. 65, 252-267 (2015).</li><li>Huang, H., Herrera, A. I., Luo, Z., Prakash, O., Sun, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transformation+and+physical+properties+of+a+hydrogel-forming+peptide+studied+by+NMR,+transmission+electron+microscopy,+and+dynamic+rheometer.">Structural transformation and physical properties of a hydrogel-forming peptide studied by NMR, transmission electron microscopy, and dynamic rheometer.</a> Biophys J. 103 (5), 979-988 (2012).</li><li>Draghi, L., Resta, S., Pirozzolo, M. G., Tanzi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microspheres+leaching+for+scaffold+porosity+control.">Microspheres leaching for scaffold porosity control.</a> J Mater Sci. 16 (12), 1093-1097 (2005).</li><li>Whang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Bone+Regeneration+with+Bioabsorbable+Scaffolds+with+Novel+Microarchitecture.">Engineering Bone Regeneration with Bioabsorbable Scaffolds with Novel Microarchitecture.</a> Tissue Eng. 5 (1), 35-51 (1999).</li><li>Ziv, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tunable+silk-alginate+hydrogel+scaffold+for+stem+cell+culture+and+transplantation.">A tunable silk-alginate hydrogel scaffold for stem cell culture and transplantation.</a> Biomaterials. 35 (12), 3736-3743 (2014).</li><li>Butruk-Raszeja, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Athrombogenic+hydrogel+coatings+for+medical+devices--Examination+of+biological+properties.">Athrombogenic hydrogel coatings for medical devices--Examination of biological properties.</a> Colloid Surface B. 130, 192-198 (2015).</li><li>L&#252;, S., Li, B., Ni, B., Sun, Z., Liu, M., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoresponsive+injectable+hydrogel+for+three-dimensional+cell+culture:+chondroitin+sulfate+bioconjugated+with+poly(N-isopropylacrylamide)+synthesized+by+RAFT+polymerization.">Thermoresponsive injectable hydrogel for three-dimensional cell culture: chondroitin sulfate bioconjugated with poly(N-isopropylacrylamide) synthesized by RAFT polymerization.</a> Soft Matter. 7 (22), 10763 (2011).</li><li>Ruoslahti, E., Pierschbacher, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+perspectives+in+cell+adhesion:+RGD+and+integrins.">New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins.</a> Science. 238 (4826), 491-497 (1987).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

The production of macroporous matrices can be beneficial to many different fields. It has high technical and economic potential due to the defined structure of the hydrogel and the ability to control and tune specific material properties. However, the introduction of supramolecular structural elements, such as pores or channels, to a 3D template might influence the overall properties of a material, such as the swelling ratio or the stiffness. This can result in the undesired decomposition, degradation, or breakdown of th...

Hydrogels הם חומרים היוצרים לא מסיסים רשתות 3D מסוגל מחייב כמויות גדולות של מים. חומרים כאלה יכולים לספק תנאים סביבתיים מעולים עבור תאים חיים. כיום, שם הוא הגדלת עניין דור של מבנים תלת מימדיים הידרוג בהתפתחות תהליכים כדי להתאים שלהם מאפיינים כימיים ופיזיים. ברגע זו מושגת, תבנית עבור הצמיחה של תאים, המניפולציה של התנהגות הסלולר יכול להיות שנוצר1,2,3,4. אלה מבנים תלת-ממד לא רק ליצור סביבה יותר טבעי ומציאותי יותר גישות קונבנציונליות דו מימדי, אבל הם גם לחשוף בפניך אפשרויות חדשות לצמיחה של תאי גזע או גידול מודלים5. חומרים שונים בעלי טווח של מאפיינים התלויים בעיקר גודל הנקבוביות של ג'ל6. הנקבוביות לשחק תפקיד מכריע תא תרבות יישומים, הנדסת רקמות, וגידול מכוונת של תאי גזע. לדוגמה, חמצן וחומרים מזינים מפוזרת באמצעות המטריקס, ועל כמות מספקת להיות מסוגל להגיע את התאים7. מצד שני, מטבוליטים מזיקות להסירו מהר ככל האפשר, ועל די שטח עבור גדילת התאים להיות זמין7. כתוצאה מכך, המאפיינים של החומר, ובכך גודל הנקבוביות, להשפיע באופן חמור על יישומים אפשריים של האפשר והתועלת של המטריקס. תהליכי צמיחת תאים שונים בהתאם המאפיינים של החומר, יכול להתרחש תרבית תאים תלת-ממד, כולל הקמת מבנים עצביים; הצמיחה ואת התמיינות של תאים בעור או עצם; וגידול בבימויו של שורות תאי גזע מיוחד, כמו hepatocytes או fibroblasts2,3,8,9,10,11. עוד נקודה מכרעת המשפיעים על יישום אפשרי של חומר היא יציבותו כלפי גירויים חיצוניים12. לדוגמה, הידרוג חייב לשמור על שלמותה מכני תא תרבות בתקשורת או על גוף האדם.
בשנים האחרונות, מחקר על hydrogels תרבות תלת התא התעצמה, מחקרים רבים בוצעו כדי לפתור את ארכיטקטורות תלת-ממד של מערכות13. Hydrogels מורכב מרכיבים מסונתז כימית נחקרות הנפוץ ביותר כי הם יכולים להיות בקלות מסונתז והוא כימי ששינה שהם מייצגים את יציבות גבוהה (ראה ז'ו. et al., 2011 לסקירה)5. עם זאת, חלבונים יש תכונות מועילות רבות: כמו מה שנקרא "דיוק פולימרים," הם מסתיימים; יש להם באורך מוגדר; הם קלים יחסית לשינוי; . ויש להם מספר רב של היעד אתרים14,15. בהקשר זה, ניתן להפיק ספציפי מאוד, חדשני מבנים עבור יישום בתחומים רבים. במחקר זה, המבוסס על חלבון הידרוג16 שימש להפגין את היכולת של שיטות ומבוססת להשפיע על הארכיטקטורה תלת-ממד של החומר. יתר על כן, היכולת של ותחולה לדור נקבובית גם נחקר.
טכניקות רבות זמינות לשנות מבנים תלת-ממד, כולל שיטות פשוטות והן בטכניקות מתוחכם, מאוד מיוחדים מתחומים שונים של חומר מדעי. טכניקה נפוצה היא השימוש electrospinning כדי ליצור מבנים מוגדרים היטב17. סיבי טעונה נשלפות מקבוצת פתרון על ידי שדה חשמלי, ואז לחזק עם חשיפה לחמצן. בדרך זו, יכול להיות מיוצר סיבי בטווח של ננומטרים עד מספר מיקרונים. שיטות נוספות לכוון את גודל המבנה, הפצה של הנקבוביות בתוך המטריצה הם הדפס אבן רכה, פוטוליתוגרפיה, מיקוד hydrodynamic, אלקטרו ריסוס, ביו-הדפסה18,19,20. חיסרון משמעותי של טכניקות אלה הוא התלות שלהם על ציוד ספציפי, יקר ולא בחומרים כימיים מיוחדים או חומרים. יתר על כן, ניסיון עם טכניקות אלה הוא לעתים קרובות לא להעברה ישירות חומרים מבוססי חלבונים, רבים של כימיקלים והשיטות אינם תא תואם.
מצד שני, טכניקות רבות אין לסמוך על ציוד מיוחד, שהופך אותם קל וזול כדי להחיל ולאחר להתרבות. שיטה נפוצה עבור מבנה מניפולציה הוא הליהוק הממס21,22,23. חלקיקים נוספים לפני התגובה הפילמור ומופצים למשל כדי להרוות את הפתרון. לאחר הפילמור, שינוי של תנאי לדילול או שינוי pH, מוביל יוצרות של החלקיקים, בעוד הנקבוביות להישאר בתוך החומר. הכימיקלים שמשתמשים בהם בטכניקות אלו, כגון מלח, סוכר, פרפין, ג'לטין, גיר, הם זול וזמין. ב ליופיליזציה, hydrogels נפוחות מוקפאים. סובלימציה עוקבות של השלבים נוזלי תחת ואקום הוא ואז לבצע24,23,25. סובלימציה מים מן הרשת הוא עדין מספיק כדי לשמור על המבנים תלת-ממד מסוים של החומר. גז קצף, פתרון זרמו עם גז, ואילו הפילמור מתרחש, עוזב את הנקבוביות בתוך ג'ל21. ניתן להתאים את גודל ואת ההפצה של הנקבוביות בהתאם זרם הגז.
כדי ליצור את הידרוג חלבון, BSA היא הגיבה כלוריד phosphonium tetrakis (hydroxymethyl) (THPC) בתגובה Mannich-סוג כדי לאפשר היווצרות קשרים הדדיים בין אמינים ראשי הקבוצות הידרוקסי של מולקולה ארבע חמוש מקשר26. אפשרי intermediates מזיקים יוסרו על ידי שטיפה מוגזמת של החומר לאחר התגובה מתרחשת.
מחקר זה מדגים את האפשרות לטיפול חומר מבוסס-BSA עם טכניקות שונות כדי לשנות, להתאים את גודל הנקבוביות. כל אחת מהטכניקות יכול לשמש במעבדה כל ברחבי העולם, אין ציוד מיוחד הכרחי. בנוסף, פרמטרים שונים, כגון יחס נפיחות degradability אנזימטיות, pH ויציבות הטמפרטורה רגישות, היו בחן, לעומת אחד את השני, במיוחד מכבדים להשפעתם של הטכניקות השונות על הדור של ארכיטקטורות תלת-ממד. לבסוף, החומרים היו functionalized עם תא-דבק פפטידים לחקור אפשרי ליישום חומרי תרבית תאים. שתי שורות תאים מודל שונה שימשו: A549 ו- MCF7.

<table><tbody><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (high glucose)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nonessential Amino Acid Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.05% Phenol Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99.8%, verg&amp;auml;llt</td><td>&amp;Ouml;lfabrik Schmidt</td><td>2133</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>3854.2</td><td></td></tr><tr><td>THPC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>0.1% Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td>Slightly toxic</td></tr><tr><td>Phalloidin-rhodamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>3.7% Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies / Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>F8775-25ML</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>2 83.1826.001&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro; slide 8 well</td><td>Ibidi GmbH</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>KCSSGKSRGDS peptide</td><td>UPEP Ulm</td><td>Custom sysnthesis</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 99.8%, verg&amp;auml;llt</td><td>Carl Roth&amp;nbsp;</td><td>K928.5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml Polysterene Round-Bottom Tube&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 50 ml&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>62.547.254&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 1.5 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,690,001</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 2 ml&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sarsted Ag und Co.</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner</td><td>655073</td><td></td></tr><tr><td>FreezeDryer Epsilon 1-6D,&amp;nbsp;</td><td>Christ, Osterode am Harz, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software Version 2012 Sp1, black edition, 407 version 8,1,0,484</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSA Imaga Analyzer Software, GSA Image Analyzer, GSA, Version 419 3.8.7</td><td>GSA GmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

easy manipulation of architectures in protein-based hydrogels for cell culture applications

Hydrogels מזוהים כחומרי מבטיח ליישומים תרבות תא, בשל היכולת שלהם לספק סביבות תא רטוב מאוד. בתחום תבניות תלת-ממד עולה בשל הדמיון פוטנציאלי של החומרים האלה מטריצה חוץ-תאית טבעיים. Hydrogels חלבון מבוססת מבטיחים במיוחד כי הם יכולים בקלות להיות functionalized ולא ניתן להשיג מבנים המוגדרים עם מאפיינים physicochemical מתכווננת. עם זאת, ייצור תבניות תלת-ממד macroporous ליישומים התרבות תאים, תוך שימוש בחומרים טבעיים לעיתים קרובות מוגבל על ידי שלהם תכונות מכניות חלש יותר בהשוואה לאלו של חומרים סינתטיים. . הנה, הוערכו שיטות שונות כדי לייצר macroporous אלבומין שור (BSA)-מבוסס מערכות הידרוג, עם גדלים נקבובית מתכווננת בטווח של 10-70 מיקרומטר ברדיוס. יתרה מזאת, שיטה להפקת ערוצי בחומר זה חלבון מבוססת כי הם כמה מאות מיקרונים ארוך הוקמה. השיטות השונות כדי לייצר את הנקבוביות, כמו גם את השפעת גודל הנקבוביות על תכונות חומר כגון נפיחות יחס, pH, יציבות טמפרטורה, בהתנהגות השפלה אנזימטיות, נותחו. גודל הנקבוביות נחקרו במדינת מקומיים, נפוחות של hydrogels באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. הכדאיות ליישומים תרבות תא הוערך באמצעות שינוי פפטיד תא-דבק RGD של המערכת חלבון, שתי שורות תאים דגם: תאי סרטן השד אנושי (A549) ו- adenocarcinomic האנושי מכתשי הבזליים בתאי אפיתל (MCF7).

Hydrogel development has become one of the most prominent fields in material research-related biological studies, with thousands of entries indexed in scientific research archives. Although the behavior of many systems is well studied, the manipulation of 3D networks, especially of sensitive protein-based materials, is often a major issue in material science. Another commonly underestimated challenge is the correct measurement of the native structure of a material using cryo electron micr...

Watch this Scientific Journal Video about Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications at JoVE.com

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

שיטות שונות כדי לתפעל אדריכלות תלת מימדי המבוסס על חלבון hydrogels מוערכים פה לגבי תכונות החומר. הרשתות macroporous הן functionalized עם פפטיד תא-דבק, הכדאיות שלהם בתרבות תא מוערך באמצעות שתי שורות תאים מודל שונה.

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

easy-manipulation-architectures-protein-based-hydrogels-for-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.7K Views.  Ulm University. שיטות שונות כדי לתפעל אדריכלות תלת מימדי המבוסס על חלבון hydrogels מוערכים פה לגבי תכונות החומר. הרשתות macroporous הן functionalized עם פפטיד תא-דבק, הכדאיות שלהם בתרבות תא מוערך באמצעות שתי שורות תאים מודל שונה.

Video: Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Bioengineering

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

הכנת הידרוקסי-PAAm הידרוג לצימוד האפקטים של רמזי mechanotransduction

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

הייצור של חלבון כמו אלסטין Hydrogels כימוס, Immunostaining של תאים ב- 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...