. אנחנו אסירי תודה קרן Boettcher, האגודה נוירודגנרטיביות (#17-II-344) על תמיכתם של מחקר זה.

בכל ההליכים הכרוכים עכברים אושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו-Anschutz קמפוס מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה (91813(05)1D).
 1. יום 1: ראשי (1°) Immunostaining עם חסימת שור אלבומין (BSA) <ol><li>Air-dry קפוא מקטעי שריר hindlimb העכבר (למשל, השוקתי הקדמי, הסוליה) רכוב על שקופיות טעונה ~ 30 דקות 11. לשרטט גבול סביב הסעיפים באמצעות עט PAP הידרופובי המכשול.</li>
	<li>המקום ~ µL 250 תמיסת מלח 5% BSA/פוספט buffered (BSA/PBS) בכל שקופית כדי לחסום נוגדן ספציפי שאינו מחייב. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר במשך ה 1</li>
	<li>תוך חסימת, להכין 1:50 דילולים של הנוגדן 1° supernatant ב 5% BSA/PBS (כל הם נוגדנים חד-שבטיים העכבר; ראה טבלה 1 6 , 12); להכין 250 µL של פתרון לכל שקופית. תמשיך 1° נוגדן מניות ואגרות דילולים קרח</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> טבלה 1: נוגדנים העיקרי היה להבחין MyHCs.
<ol start="4"> <li>בעקבות השאיפה של הפתרון חסימה של BSA/PBS 5%, להוסיף 250 µL של 1° נוגדן דילול על השקופיות המתאים. להוסיף 250 שקופיות BSA/PBS משני (2°) נוגדן בלבד שליטה שלילי µL של 5%.</li>
	<li>Incubate ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות בסביבה לחה. 
	הערה: צלחת פטרי יתעופף עם לחה מסנן נייר עשוי לשמש חדר מתאים הדגירה.</li>
</ol> 2. יום 2:2 ° Immunostaining עם פלורסנט נוגדנים <ol><li>תשאף 1° נוגדן פתרון או לשלוט פתרון BSA/PBS 5%. תשטוף הכל מחליק שלוש פעמים, 10 דקות עם 5% BSA.</li>
	<li>בעת הכביסה, להכין 1:200 דילולים של הנוגדנים מטוהרים, fluorophore מצומדת ° 2 ב- 5% BSA/PBS (ראה טבלה 2, כל הם העכבר נגד עז). להכין µL 250 של פתרון לכל שקופית. להחזיק 2° fluorophore מצומדת נוגדנים בחשכה על קרח</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> בטבלה 2: נוגדנים משניים Fluorophore מצומדת נהגו להמחיש העיקרי נוגדן זיהוי של MyHCs.
<ol start="3"> <li>בעקבות השאיפה של היישום השלישי של 5% BSA/PBS פתרון חסימה, להוסיף 250 µL של דילול נוגדן 2° על כל השקופיות. תקופת דגירה של 90 דקות בטמפרטורת החדר בסביבה האפל, הלח.</li>
	<li>וביופסיה 2° נוגדן פתרון. תשטוף הכל מחליק שלוש פעמים, 10 דקות עם 5% BSA/PBS.</li>
	<li>שטיפה עם PBS. להתייבש במשך 10 דקות</li>
	<li>הר את coverglass עם מדיום הרכבה מימית לא קבועים, צמיגות נמוכה.</li>
	<li>כאשר יבש, לאטום את הקצוות שקופיות עם לק. יבש ואחסן slidebox האפל.</li>
</ol> 3. הדמיה שקופיות עם מיקרוסקופ Epifluorescence <ol><li>לנקות את השקופיות עם קטן, 70% ספוג אתנול מעבדה-מחיקה.</li>
	<li>קבל תמונות דיגיטליות סעיפים שריר immunostained באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מצויד עם מנגנון הצילום (ראה את הטבלה של חומרים).
	<ol><li>בחר אזור של 1 מ 2 (10 X אובייקטיבי, נה 1.4).</li>
		<li>תצוגה מצומדת אלקסה 488 ° 2 פלורסצנטיות נוגדנים דרך 505 ננומטר מסנן לעבור זמן. להציג את קרינה פלואורסצנטית שנוצר על ידי עירור של אלקסה 594-מצומדת ° 2 נוגדנים דרך מסנן פס ארוך 595 nm. דיגיטייז תמונות עם מחשב PC עם תוכנת הדמיה תואם. כולל את בר בקנה מידה של הדמיה תוכנה לניתוח בשלב מאוחר יותר.</li>
	</ol></li></ol> 4. ניתוח של תמונות עם פיג'י הערה: לפני שתמשיך עם ניתוח, פיג'י (זמין באופן חופשי של מכוני הבריאות הלאומיים, בת'סדה, מרילנד) חייב להיות מותקן באמצעות https://imagej.net/Fiji/Downloads. כמו כן, המאקרו המשמשים בתהליך הזה מסופק קובץ משלים. מקם את קובץ המאקרו במדריך נגיש.
<ol><li>טען brightfield תמונה של המקטע הנבחר בפיג'י. נווט אל תוספים &#8594; פילוח &#8594; פילוח לומד מהר קודם ל-</li>
	<li>על מנת מתנים האזורים הסלולר של המקטע, למתוח קו על בד, ולחץ &#34; להוסיף מחלקה 1 &#34;. לאחר מכן, צייר קו על השטח בין סיבי, ולחץ &#34; להוסיף לשיעור 2 &#34; כדי לסמן על התחומים חוץ-תאית. חזור עד ישנם 5-10 תוויות בכל כיתה.
	<ol><li>לחץ על הרכבת המסווג. על וכתוצאה מכך אדום וירוק הכיסוי, להוסיף תוויות יותר באופן ידני (ראה שלב 4.2) לחתיכות באופן שגוי מקוטע של התמונה, במידת הצורך. חזור עד סיבים (אדום) מופרדים כראוי הרווח בין סיבים (ירוק)-</li>
	</ol></li> <li>לחץ על &#34; ההסתברות לקבל &#34; ולשמור את התמונה בתיקיה החדשה שכותרתו.</li>
	<li>חזור על הפעולות לעיל (שלבים 4.2-4.3) עם התמונה פלורסנט שנלקחו באותו השדה. תווית סיבי immunostained כמו &#34; מחלקה 1 &#34; ואת כל האיזורים הלא-פלורסנט כמו &#34; מחלקה 2 &#34;. לשמור את מפת הסתברות שנוצר באותה תיקיה שבה מאוחסן התמונה brightfield מעובד.</li>
	<li>פתח את אחת ממפות שנשמר קודם לכן ההסתברות בפיג'י. לצייר קו ישר על הבר סולם המסופקים על ידי תוכנת הדמיה. . לך לנתח &#8594; לקבוע קנה מידה. לשנות את הפרמטרים (קרי, מרחק ידוע, יחידת אורך) לערכים המתאימים שלהם כפי שהוצגה על ידי סרגל קנה מידה ולאחר מכן בדוק &#34; Global &#34; תיבת לתקנן את קנה המידה עבור כל תמונה.</li>
	<li>נווט אל תוספים &#8594; מאקרו &#8594; לרוץ &#8594; Tyagi et al. סיבים כמת macro.ijm (ראה קובץ משלים). . מיד, תופיע חלונית הניווט. פתחו את התמונה &#39; s מארח תיקיה; תיבת דו-שיח תופיע. עבור כל תיבת דו-שיח, לשנות &#34; רקע &#34; ערך רשימה נפתחת כדי &#34; האור. &#34; הערה: התיקיה עכשיו יאוכלסו עם תמונות של קווי המתאר סיבים וקבצים תוכנת הגיליון האלקטרוני של התוצאות (קוטר CSA, Feret הם הכי יקר לכימות סיבים מורפולוגיה; פרמטרים נמדד ניתן להתאים במדידות לנתח הגדר). סיבים מורפולוגיה נתונים שנוצרו על-ידי הפונקציה נקבובית-אנליזה של פיג'י יועברו באופן אוטומטי לקבצים תוכנת הגיליון האלקטרוני עבור שתי תמונות שדה פלורסנט ובהיר.</li>
	<li>לחשב את השבר של סיבי לבטא MyHC נתונה בשדה על-ידי חלוקת מספר סיבים פלורסנט בשטח על ידי מספר סיבים הכולל בתמונה בהירים השדה התואם.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease.">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li><li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity.">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li><li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle.">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li><li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase.">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li><li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat,+mouse,+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis.">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains.">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++permeation+and/or+binding+to+Cav1.1+fine-tunes+skeletal+muscle+Ca2++signaling+to+sustain+muscle+function.">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li><li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen.">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li><li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining.">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li><li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse.">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li><li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres.">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li><li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber+types+in+C57Bl6j+mice.">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li><li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse.">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li></ol>

המחברים יש אינטרסים סותרים לא לחשוף.

. הנה, סיפקנו כיוון שימושי לצורך זיהוי סוגי סיבי שריר השלד. בעשותו כן, נתאר באלגוריתם הרומן לניתוח הנתונים.
מאז התוצאות שלנו במידה רבה לאשר את אלה של דוחות קודמים5,8,10 , משקפים משלנו מדידות ידניות, האלגוריתם מופיע לדייק. ובכל ז...

זה כבר ידוע מזה זמן כי שרירי השלד מורכב של סיבי יחיד של סוגים רבים1. בתחילה, שתי קבוצות של סיבי מאופיינים על סמך מאפייניהם כויץ ו בשם, בהתאם, איטי עווית (סוג), במהירות עווית (סוג II). קטגוריות אלה היו מכובדים נוספים על בסיס סיבים חילוף החומרים. מאז סוג סיבים עשירים המיטוכונדריה, מסתמך על מטבוליזם חמצוני, הם היו הובהר על-ידי nicotinamide אדנין dinucleotide robustly חיובי-tetrazolium רדוקטאז (NADH-TR) diaphorase2 או succinate דהידרוגנאז (SDH)3 מכתים. לעומת זאת, סוג II סיבי הציג פחותה מעלות משתנה של NADH-TR diaphorase או SDH מכתים, חולקו לשתי תת-קבוצות במהירות עווית (מסוג IIA ו- IIB) במידה מסוימת בגסות על סמך קיבולות חמצוני היחסי שלהם. הבדלים אלו בין סיבי היה רוחי בצורה יעילה יותר על ידי צביעת צולבות הקישור חוטים שרירן-ATPase שבו סוג סיבים כתם כהה לאחר דגירה מראש ב- pH 4.0 ולקלוט מסוג IIB סיבי precipitate דגירה לפני הבא ב- pH 10.0 בסיבי IIA סוג צביעת intermediately4.
לאחרונה, נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MyHC) איזופורמים התפתחה מבדיל עדינה יותר של סיבים מסוג5. סוג אני, הקלד IIA, מסוג IIB סיבים ניתן כל לזהות בדייקנות בהתבסס על הפרופיל שלהם MyHC. בנוסף, במהירות עווית סמויה ביניים סיבים מסוג אחר, הקלד IIX, היה מזוהה6. סיבי היברידית לבטא MyHC אחד או יותר היו גם אושרו5,7,8. מינים מסוימים כגון החתול הבבון ידועים לא מסוג IIB MyHCs אקספרס6. למרות MyHC immunostaining הוא כעת הערכת המדינה-of-the-art הקומפוזיציה שריר, הניתוח של הנתונים שהושגו באמצעות טכניקה זו היא מסורבלת ולדרוש זמן רב ללא עזרה אוטומטית. לשם כך, קומץ בשיטות אוטומטיות למחצה כדי לנתח את הנתונים האלה כבר מפותחת5,9,10. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי יחסית לזיהוי immunohistochemical של סיבי השריר-סוג5,7,8,10, יחד עם רומן חצי אוטומטיות אלגוריתם שמאיץ את ניתוח של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים עם דיוק.

<table width="974">
	<colgroup>
		<col style="width:226pt" width="301" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
		<col style="width:193pt" width="257" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Bovine Serum Albumin</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A9418-100G</td>
			<td class="xl66" style="width:193pt" width="257">5% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Hydrophobic Barrier Pap Pen</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Scientific Device Laboratory</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">9804-02</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Microscope Slides</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Globe Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">1358W</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Coverglass</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">12-544-E</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Immumount</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">9990402</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Nail Polish</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">L&#39;Oreal</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">Discontinued</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">SPOT RT/KE</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">SPOT Imaging Solutions</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">RT940</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Dell Optiplex</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BA-F8 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgG2b; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">SC-71 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monclonal mouse IgG1; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BF-F3 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">6H1 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21145</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21121</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21044</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">OCT</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sakura Finetek</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">4583</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">isopentane</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">O3551-4</td>
			<td class="xl66">cool with liguid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">PBS</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Bioreagents</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">BP665-1</td>
			<td class="xl66">10X, dilute to 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Kim wipes</td>
			<td class="xl66">Kimberly-Clark</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">06-666A</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition

במשך שנים, היו הבחנות בין סוגי סיבי שריר השלד הטוב דמיינו ידי מכתימה צולבות הקישור חוטים שרירן-ATPase. לאחרונה, נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MyHC) איזופורמים התפתחה מבדיל עדינה יותר של סוג סיבים. מסוג I, הקלד IIA, הקלד IIX ו סיבים מסוג IIB עכשיו יכול להיות מזוהה עם דיוק בהתבסס על הפרופיל שלהם MyHC; עם זאת, ניתוח ידנית של נתונים אלו יכול להיות איטי ולא גמור מייגע. בהקשר זה, הערכה מהירה, מדויקת של סיבים מסוג הרכב מורפולוגיה הוא כלי מאוד רצוי. כאן, אנו מציגים עבור המדינה-of-the-art נוגדן של MyHCs בסעיפים קפוא המתקבל העכבר שריר hindlimb בהופעה עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן שמאיץ את ניתוח סיבים מסוג וסיבים מורפולוגיה של פרוטוקול. כצפוי, שריר הסוליה מוצג צביעת עבור מסוג I ו סיבים IIA, אך לא עבור סוג IIX או סוג סיבי IIB. מצד שני, שריר השוקה הקדמי היה ברובו מורכב סוג IIX ו- type IIB סיבים, חלק קטן של סוג IIA סיבים, מעט או ללא סוג סיבים. מספר תמונות המרות שימשו כדי ליצור מפות ההסתברות לצורך מדידת היבטים שונים של סיבים מורפולוגיה (קרי, שטח חתך הרוחב (CSA), קוטר Feret מקסימלית וללא מינימלי). הערכים שהתקבלו עבור פרמטרים אלו הושוו עם ערכים שהושג באופן ידני. אין הבדלים משמעותיים נצפו בין בכל מצב של ניתוח לגבי CSA, קוטר Feret מינימלי או מקסימלי (כל p &#62; 0.05), המציין את הדיוק של שיטת שלנו. לפיכך, פרוטוקול הניתוח שלנו immunostaining ניתן להחיל את החקירה של השפעות על השריר הרכב דגמים רבים של הזדקנות, מיופתיה.

השרירים Hindlimb (קרי, השוקתי הקדמי, הסוליה) גזור מן עכבר C57BL/6 זכרים בגיל לא ידוע היו פלאש קפוא ידי שוקע כייר פלסטיק המכיל את השריר ב אוקטובר במתחם איזופנטאן מקורר חנקן נוזלי. לאחר מכן, משתמש cryotome, 8-10 מיקרומטר מקטעים טורי היו ב-20 ° C גזורה הועבר שקופיות זכוכית שונים מפרוטוני...

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition at JoVE.com

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה איזופורמים התפתחה כמבדיל המדינה-of-the-art של סיבי השריר והשלד-סוג (קרי, סוג, הקלד IIA, הקלד IIX, הקלד IIB). כאן, אנו מציגים פרוטוקול מכתימים יחד עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן המקל על הערכה מהירה של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים.

ניתוח חצי אוטומטי של מורפולוגיה שרירי השלד העכבר והרכב סיבים מסוג

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

semi-automated-analysis-mouse-skeletal-muscle-morphology-fiber-type

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K Views.  University of Colorado School of Medicine. נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה איזופורמים התפתחה כמבדיל המדינה-of-the-art של סיבי השריר והשלד-סוג (קרי, סוג, הקלד IIA, הקלד IIX, הקלד IIB). כאן, אנו מציגים פרוטוקול מכתימים יחד עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן המקל על הערכה מהירה של מורפולוגיה סיבים מסוג ?...

Video: Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

מיו מכני ניתוח בשרירי השלד מבודדת

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

שרירי השלד מין Dimorphism מ Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

הערכה של מבנה הנכון חדרית ותפקוד בעכבר הדגם של תעוקת עורק ריאה על ידי Transthoracic אקו

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

נהלי ביופסיה של שריר שלד אנושי באמצעות טכניקת Bergstrom השתנה

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

דימות תהודה מגנטית כמותי של מחלת שריר שלד

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

בן אנוש<em&gt; Vastus lateralis</em&gt; ביופסיה בשרירי השלד שימוש וייל-בלייסלי Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

אינדוקציה הערכת נזק שרירי השלד Exertional בבני אדם

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed in mice is high. Phenotypic characterization of these mouse models also requires the examination of cardiac function and morphology. Echocardiography and magnetic resonance imaging (MRI) are commonly used approaches to characterize cardiac function and morphology in mice. Echocardiographic and MRI equipment specialized for use in small rodents is&#160;expensive and requires a dedicated space. This protocol describes cardiac measurements in mice using a clinical echocardiographic system with a 15 MHz human vascular probe. Measurements are performed on anesthetized adult mice. At least three image sequences are recorded and analyzed for each animal in M-mode in the parasternal short-axis view. Afterwards, cardiac histological examination is performed, and cardiomyocyte diameters are determined on hematoxylin-eosin- or wheat germ agglutinin (WGA)-stained paraffin sections. Vessel density is determined morphometrically after Pecam-1 immunostaining. The protocol has been applied successfully to pharmacological studies and different genetic animal models under baseline conditions, as well as after experimental myocardial infarction by the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). In our experience, echocardiographic investigation is limited to anesthetized animals and is feasible in adult mice weighing at least 25 g.

Echocardiographic examination is frequently used in mice. Expensive high-resolution ultrasound devices have been developed for this purpose. This protocol describes an affordable echocardiographic procedure combined with histological morphometric analyses to determine cardiac morphology.

בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

הרכב הגוף וניתוח מטבולית שכולאת בעכברים פד שומן גבוה

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

ניתוח כמותי של הרכב הסלולר בנגעים טרשת עורקים מתקדמת של שריר חלק תא שושלת היוחסין-עקיבה עכברים

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...