Name: determination of the glycogen content in cyanobacteria
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

המחברים מכירים במחקר Nordic Energy (AquaFEED, פרויקט מס &#39;24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, פרויקט מס&#39; 12-131844) וווילום פונדן (פרויקט מס &#39;13363)

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות Cyanobacterial <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Synechocystis sp. PCC 6803 ב 30 מעלות צלזיוס BG11 בינוני 8 , עם אספקה ​​קבועה של אוויר בתוספת 1% (V / V) CO 2 . להאיר את התרבויות ברציפות עם אור בכל צפיפות השטף הפוטוסינתזה פוטון של פוטון 50 μmol / m 2 / s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Synechococcus sp. PCC 7002 בנוזל A + בינוני 23 (בינוני BG11 יכול לשמש גם), עם אספקה ​​קבועה של אוויר בתוספת 1% (V / V) CO 2 . הטמפרטורה צריכה להיות 37 ° C. להאיר את התרבויות ברציפות עם אור בכל צפיפות השטף הפוטוסינתזה פוטון של 150 μmol פוטון / m 2 / s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של התרבות ב 730 ננומטר באמצעות קובט עם נתיב אור של 1 ס&quot;מ. אם הערך OD הוא מעל 0.8, לעשות דילולים מתאימים כדי להשיג מדידות OD כי הם פרופורציונליים לריכוז התא. הערה: הפרוטוקולים המוצגים להלן מתאימים לתרבויות נוזליות, עם צפיפות תאים המתאימה לערך של 730 ננו-מטר של 2 או יותר. כאשר תרבויות בשלב הצמיחה מעריכי הרצוי, אשר בדרך כלל יש ערך 730nm OD מתחת 1, לרכז את צפיפות התאים על ידי צנטריפוגה resuspension במאגר או בינוני להשיג ערך 730nm OD של 2 ומעלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגרים וריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 50 מ&quot;מ טריס HCL חיץ ב pH 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 50 מ&quot;מ סודיום אצטט המאגר ב pH 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון מלאי של 8 U / mL amyloglucosidase ב 50 מ&quot;מ מאגר אצטט אצטט, pH 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון המניות של 2 U / מ&quot;ל ​​α-amylase ב 50 מ&quot;מ מאגר אצטט אצטט, pH 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במים מזוקקים, פתרונות סטנדרטיים Makeglucose בריכוזים הנעים בין 0 ל 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​,. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מגיב אלוהים- POD מן D- גלוקוז Assay Kit (פורמט GODPOD), fOllowing ההוראה של היצרן. </li></ol></li></ol> 2. קביעת התא יבש משקל (אופציונלי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 2 מ&quot;ל של תרבות או resuspension התא (ראה שלב 1.1) לצינור 2.0 מ&quot;ל ו צנטריפוגה ב XG 6,000 ו 4 ° C במשך 5 דקות. מחק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של מים צנטריפוגות ב XG 6000 ו 4 ° C במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה התא 0.5 מ&quot;ל של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה למגש אלומיניום שקול מראש. מעבירים את המגש לתנור ייבוש ב 105 ° C לייבוש לילה (כ 18 שעות). קריטי: חשוב שהמגש יטופל במלקחיים כדי למנוע העברת חומר מהאצבעות. יבש מגש אלומיניום ריק מראש, שקול תחת אותם תנאים כדי לקבוע כל ירידה במשקל המגשים במהלך ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הייבוש, הוציאו את המגש מהתנור ואפשרו לו לאזן את הקונדיטיעל 5 דקות לפני שקילתו עם דיוק של 0.0001 גרם. הערה: ניתן להשתמש בערך כדי לנרמל את תוכן הגליקוגן על בסיס משקל תא יבש. </li></ol> 3. תמוגה של תאים Cyanobacterial <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מ&quot;ל של תרבות או resuspension התא (ראה שלב 1.1) לצינור 1.5 מ&quot;ל ו צנטריפוגות ב XG 6,000 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מחק את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של 50 מ&quot;מ Tris-HCl, pH 8, ו צנטריפוגות ב XG 6000 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מחק supernatant ו resuspend תא גלולה ב 1 מ&quot;ל של חיץ Tris-HCl. חזור על התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend גלולה μL 500 של 50 מ&quot;מ טריס HCL חיץ, pH 8. קריטי: Resuspend גלולה היטב עבור תמוגה התא יעיל. שמור על resuspension בקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים resuspended ב 4 מעלות צלזיוס על ידי ביצוע 30 מחזורים של ultrasonication, כל מחזור בהיקף של 30 שניות בתדר של 20 קילוהרץ עם משרעת מקסימלית,ואחריו 90 s ללא. הערה: שיטה זו יכולה ביעילות lyse Synechococcus sp. PCC 7002. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להעביר resuspension התא כדי צינור בורג שווי ולהוסיף חרוזי תחמוצת זירקוניום לצינור, בעקבות הוראות היצרן. הגדר את הצינור homogenizer רקמות lyse התאים על 4 מעלות צלזיוס על ידי ביצוע 2 מחזורים של מכות, כל מחזור המורכב של 5 דקות בהגדרת תדר של 5. הערה: שיטה זו יכולה ביעילות lyse Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור המכיל lysate למשך 10 דקות ב XG 6,000 ו 4 ° C. הערה: גלולה צריך בעיקר מורכב פסולת התא גדול. אם יש מספר משמעותי של תאים רצופים, חזור על שלב 3.4. שמור את supernatant על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות מסחרי BCA assay Protein Kit. הערה: ניתן להשתמש בערך כדי לנרמל את תוכן הגליקוגןעל בסיס תוכן חלבון. </li></ol> 4. גליקוגן משקעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר chlorophyll א lysate התא על ידי ערבוב 900 μL של 96% (V / V) אתנול ו 100 μL של supernatant משלב 3.5 ב 1.5 מ&quot;ל צינור בורג מכסה. לאחר סגירת מכסה, לחמם את הצינור על 90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות באמצעות בלוק חימום במעבדה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינור על קרח במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב XG 20,000 ו 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בזהירות להסיר את supernatant; גלולה מכיל גליקוגן. לייבש קלות את גלולה באוויר כדי להסיר אתנול עודף. קריטי: ייבוש מוגזם של גלולה יש להימנע, אחרת זה הופך להיות קשה solubilize בשלב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: מדוד את הספיגה של supernatant שהושג בשלב 4.3 ב 664 ננומטר, כדי לקבוע את כלורופיל תוכן. השתמש במקדם ספיגה של 84.6 ליטר / גרם / ס&quot;מ 24 . הערה: הערך יכול לשמש לנורמליזציהתוכן הגליקוגן. </li></ol> 5. הידרוליזה אנזימטית וקביעת גליקוגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize גלולה שהתקבלו בשלב 4.3 μL 100 של חומצה אצטט 50 מ&quot;מ, pH 5, ולהוסיף 50 μL של 8 U / mL amyloglucosidase ו 50 μL של 2 U / mL α-amylase. מערבבים חומרים אלה היטב באמצעות מערבולת. הערה: ערבוב על ידי pipetting אינו מומלץ כי גלולה הגליקוגן הוא צמיג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת על 60 מעלות צלזיוס על בלוק חימום עבור 2 שעות כדי לאפשר את העיכול של הגליקוגן לתוך מולקולות הגלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב XG 10,000 במשך 5 דקות ולהעביר supernatant לצינור 1.5 מ&quot;ל חדש. </li></ol> 6. קביעת תוכן גלוקוז הכולל באמצעות מגיב אלוהים- POD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של גלוקוז supernatant שהושגו בשלב 5.3 באמצעות מגיב אלוהים- POD. העברת 100 μL של supernatant מ 5.3 שלב היטב בצלחת 96-היטב. כבקרה שלילית,השתמש 100 μL של חומצה אצטט 50 מ&quot;מ, pH 5. ליצירת עקומת כיול, גם למדוד את הפתרונות הסטנדרטיים גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μL של אלוהים מגיב POD לכל מדגם במהירות לערבב על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת סטטי על 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הקלט את הערך absorbance ב 510 ננומטר באמצעות קורא צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הריכוז של גלוקוז באמצעות עקומת כיול המתקבל סטנדרטים הגלוקוז. הערה: ריכוז הגליקוגן בתאי התא מתבטא בריכוז הגלוקוז (μg / mL). </li></ol>

<ol>
	<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants.">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li><li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+Synechocystis+using+isotope+distribution+from+C-13-labeled+glucose.">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li><li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714.">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li><li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions.">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li><li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium.">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li><li>M&#246;llers, K. B., Cannella, D., J&#248;rgensen, H., Frigaard, N. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation.">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).</li><li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Synechocystis.+sp.+strain+PCC+6803+with+N2+and+CO+2+in+a+diel+regime+reveals+multiphase+glycogen+dynamics+with+low+maintenance+costs.">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li><li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Non-coding+RNA+Ncr0700/PmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li><li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function.">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE.">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li><li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li><li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+group+2+{sigma}+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803.">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li><li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li><li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+pathway+of+glucosylglycerol+synthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li><li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase.">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004 (2015).</li><li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN.">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li><li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products.">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li><li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+and+antagonistic+effects+of+&#945;-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion.">Synergistic and antagonistic effects of &#945;-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li><li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis.">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li><li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+(H2O2)+scavenging+activity+of+plant+extracts.">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li><li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria:+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002.">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophylls+and+carotenoids:+Pigments+of+photosynthetic+biomembranes.">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li><li>L&#243;pez, C. V. G., del Carmen Cer&#243;n Garc&#237;a, M., Fern&#225;ndez, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass.">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li><li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion.">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li><li>D&#237;az-Troya, S., L&#243;pez-Maury, L., S&#225;nchez-Riego, A. M., Rold&#225;n, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803:+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases.">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li><li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA,+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats.">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li><li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light.">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

צעדים קריטיים בפרוטוקול הם משקעים גליקוגן resuspension. לאחר צנטריפוגה לאחר משקעים אתנול, גליקוגן יוצר גלולה שקוף כי באופן רופף דבקות קירות microcentrifuge צינורות. לכן, בעת הסרת supernatant, תשומת לב מיוחדת צריך להינתן כדי לא להסיר את גלולה. גליקוגן גלולה הוא דביק, solubilization יכול להיות ק...

Cyanobacteria לצבור גליקוגן כחנות פחמימות הגדולות של פחמן מ CO 2 קבוע באור באמצעות פוטוסינתזה. גליקוגן הוא גליקן המורכב של גלוקן ליניארי α-1,4 מקושר עם סניפים שנוצרו על ידי α-1,6 המקושרים גלוקוזיל קישורים. גליקוגן ביוסינתזה ב cyanobacteria מתחיל עם ההמרה של גלוקוז -6 פוספט לתוך ADP גלוקוז דרך פעולה רציפה של phosphoglucomutase ו- ADP גלוקוז pyrophosphorylase. מחצית הגלוקוז ב- ADP-glucose מועברת לקצה הלא-מפחית של עמוד השדרה α-1,4-glucan של הגליקוגן על-ידי סינתזה של גליקוגן אחת או יותר (GlgA). לאחר מכן, אנזימים מסתעפים להציג את הקישור α-1,6 מקושר גלוקוזיל, אשר המורחבת נוספת כדי ליצור את החלקיקים גליקוגן. בחושך, גליקוגן מחולק על ידי גליקוגן phosphorylase, אנזים גליקוגן זיוף, α-glucanotransferase, ו- malto-dextrin phosphorylase לתוך גלוקוז phosphorylated גלוקוז חינם. הזנות אלה intO מסלולים קטבוליים, כולל מסלול פוספט חמצון, מסלול Embeden-Meyerhof-Parnas (glycolysis), ואת מסלול Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 . מטבוליזם גליקוגן ב cyanobacteria יש צבר עניין הולך וגובר בשנים האחרונות בגלל הפוטנציאל של cyanobacteria להתפתח מפעלים תא חיידקים מונע על ידי אור השמש לייצר כימיקלים ודלקים. מטבוליזם גליקוגן יכול להיות שונה כדי להגדיל את התשואה של המוצרים, כי הגליקוגן הוא מאגר פחמן גמיש הגדול ביותר בחיידקים אלה. דוגמה לכך היא cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, אשר כבר מהונדסים גנטית לייצר mannitol; הפרעה גנטית של סינתזת הגליקוגן מגדיל את התשואה מניטול 3 פי 5 . דוגמה נוספת היא ייצור של ביואתנול מ-גליקוגן נטען wildtYe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . תוכן גליקוגן תא wildtype עשוי להיות עד 60% מהמשקל היבש של התא במהלך רעב חנקן 6. ההבנה שלנו של מטבוליזם גליקוגן ורגולציה התרחבה גם בשנים האחרונות. בעוד גליקוגן ידוע לצבור באור להיות catabolized בחושך, קינטיקה מפורטת של מטבוליזם הגליקוגן במהלך מחזור דיל היה רק ​​לאחרונה התגלה Synechocystis sp. PCC 6803 7 . יתר על כן, כמה גנים המשפיעים על הצטברות של גליקוגן זוהו. דוגמה בולטת היא התגלית כי pingA histidine histidine ואת הלא קידוד RNA PmgR1 טופס אשד פיקוח ולשלוט על הצטברות של גליקוגן. מעניין, את pmgA ו pmgR1 מחיקת מוטציות לצבור פעמיים כמו גליקוגן כמו זן wildtype של Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . אלמנטים רגולטוריים אחרים ידועים גם להשפיע על הצטברות של גליקוגן, כולל אלטרנטיבה גורם סיגמא E גורם תעתיק CyAbrB2 10 , 11 . כמו עניין גליקוגן הרגולציה ומטבוליזם לגדול, פרוטוקול מפורט המתאר את קביעת התוכן הגליקוגן הוא מוצדק. מספר שיטות משמשות בספרות. חומצה hydrolysis ואחריו קביעת התוכן monosaccharide באמצעות ניתוח בלחץ גבוה אניון כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם גלאי amperometric פעמו או קביעת ספקטרומטריים בעקבות טיפולים עם חומצה פנול נמצאים בשימוש נרחב שיטות כדי משוער תוכן הגליקוגן 9 , 10 , 12 , 13 . עם זאת, בלחץ גבוה אניון החלפת chromatographi נוזלימכשיר C הוא יקר מאוד ואינו להפלות גלוקוז נגזר גליקוגן מן הנגזר אחרים glycoconjugates המכילים גלוקוז, כגון סוכרוז 14 , glucosylglycerol 15 , תאית 16 , 17 , 18 , אשר ידועים לצבור כמה מינים cyanobacterial. השיטה חומצה פנול ניתן לבצע באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. עם זאת, הוא משתמש ריאגנטים רעילים מאוד אינו מבחין גלוקוז נגזר glycoconjugates שונים, וגם לא להבחין גלוקוז מ monosaccharides אחרים המהווים חומרים סלולריים, כגון גליקוליפידים, lipopolysaccharides, מטריצות תאיים 12 . יש לציין כי חומצה חמה-פנול assay משמש לעתים קרובות לקביעת התוכן הכולל פחמימות ולא על הקביעה הספציפית של תוכן גלוקוז 12 . אנזימטיתDrolysis של גליקוגן לגלוקוז על ידי α-amyloglucosidase ואחריו זיהוי של גלוקוז באמצעות assay אנזים מצמידים מייצר readout colorimetric כי הוא רגיש במיוחד ספציפיים גלוקוז נגזר גליקוגן. הספציפיות יכולה להיות משופרת נוספת עם משקעים מועדפים של גליקוגן מ lysates התא על ידי אתנול 5 , 8 , 19 . כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור assay מבוסס אנזים של תכולת הגליקוגן בשני מינים cyanobacterial הנחקרים ביותר, Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002, ב wildtype ו זנים מוטציה. על מנת להבטיח הידרוליזה יעילה, קוקטייל של α-amylase ו α-amyloglucosidase משמש 8 . Endo משחק α-amylase hydrolyzes את α-1,4-linkages ב glucans שונים לתוך dextrins, אשר hydrolyzed נוספתO גלוקוז על ידי exo משחק α-amyloglucosidase 20 . ההשפעות הסינרגיסטיות של אנזימים אלה ידועות היטב, ואנזימים אלה משמשים באופן שגרתי להידרוליזה סלקטיבית של עמילן, שהוא גלוקן מקושר ל- α כמו גליקוגן, מבלי להשפיע על גליקוקונג&#39;נטים אחרים, כגון תאית, ביומסה הצמחית 21 . גלוקוז משוחרר מזוהה כמותית לאחר assay אנזים מצמידים המורכב oxidase גלוקוז, אשר מזרז את הפחתת חמצן מי חמצן ואת חמצון של גלוקוז ל lactone ו peroxidase, אשר מייצרת צבע quinoneimine בצבע ורוד מי חמצן, תרכובת פנולית, ו- 4-aminoantipyrine 22 .

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td><td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190 Microplate Reader&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Eliza plate reader</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M-CE</td><td>Beads beater</td></tr><tr><td>Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer</td><td>Amersham Biosciences</td><td>NA</td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>pH adjutment</td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32319</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-AMGPU</td><td>Enzyme for glycogen depolymerization</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>Enzyme for glycogen depolymerization</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>Standard for the glucose assay</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein assay kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>For determination of protein concentrations</td></tr><tr><td>Aluminum drying trays, disposable</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>For determination of cell dry weights</td></tr><tr><td>D-Glucose assay kit (GODPOD format)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>For determination of glucose concentrations</td></tr><tr><td>Zirconium oxide breads, 0.15 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZrOB015</td><td>Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td></tr><tr><td>RINO tubes</td><td>Next Advance</td><td>NA</td><td>Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td></tr></tbody></table>

determination of the glycogen content in cyanobacteria

Cyanobacteria לצבור גליקוגן כמו פחמן תאיים הגדולות ואנרגיה אחסון במהלך פוטוסינתזה. ההתפתחויות האחרונות במחקר הדגישו מנגנונים מורכבים של מטבוליזם גליקוגן, כולל מחזור diel של biosynthesis ו catabolism, רגולציה רגולציה, ואת מעורבותם של RNA לא קידוד. במקביל, נעשים מאמצים להפנות פחמן מגליקוגן למוצרים רצויים בקיאנובקטריות מהונדסות גנטית כדי לשפר את תפוקת המוצרים. כמה שיטות משמשות כדי לקבוע את תוכן הגליקוגן ב cyanobacteria, עם משתנות משתנה המורכבות הטכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לקביעת אמין של תוכן הגליקוגן ב cyanobacteria כי ניתן לבצע במעבדה סטנדרטית מדעי החיים. הפרוטוקול כרוך משקעים סלקטיבי של גליקוגן מן lysate התא ואת deolymerization אנזימטי של גליקוגן לייצר מונומרים גלוקוז, אשר מזוהים על ידי גלוקוז שורIdase-peroxidase (GOD-POD) אנזים מצמידים אנזים. השיטה יושמה על Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002, שני מינים cyanobacterial מודל כי נמצאים בשימוש נרחב בהנדסה מטבולית. יתר על כן, השיטה בהצלחה הראו הבדלים בתכולת הגליקוגן בין wildtype לבין מוטנטים פגומים ברכיבים רגולטוריים או גליקוגן biosynthetic גנים.

10 מ&quot;ל של wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 גדלו בתנאים photautotrophic עד הערך 730nm OD הגיעו כ 0.8. התאים נקצרו resuspended ב 50 מ&quot;מ טריס HCl, pH 8. ערך 730nm OD הותאם 2-3. תכולת הגליקוגן נותחה בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל. תכולת הגליקוגן לכל 730 ננו-מטר היה 13 ± 1.8 מיקרו...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

כאן, אנו מציגים assay אמין וקל למדידת תוכן הגליקוגן בתאי cyanobacterial. ההליך כרוך משקעים, דה פולימריזציה לבחירה, ואיתור של שאריות גלוקוז. שיטה זו מתאימה הן wildtype והן זנים מהונדסים גנטית והוא יכול להקל על ההנדסה המטבולית של cyanobacteria.

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

determination-of-the-glycogen-content-in-cyanobacteria

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.9K Views.  Carlsberg Research Laboratory.  כאן, אנו מציגים assay אמין וקל למדידת תוכן הגליקוגן בתאי cyanobacterial. ההליך כרוך משקעים, דה פולימריזציה לבחירה, ואיתור של שאריות גלוקוז. שיטה זו מתאימה הן wildtype והן זנים מהונדסים גנטית והוא יכול להקל על ההנדסה המטבולית של cyanobacteria. 

Video: Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are the most important components of phycobilisomes, the major light-harvesting antennae in cyanobacteria and several algae taxa. The phycobilisomes of Synechocystis contain two phycobiliproteins: phycocyanin and allophycocyanin. This protocol describes a simple, efficient, and reliable method for the quantitative determination of both phycocyanin and allophycocyanin in this model cyanobacterium. We compared several methods of phycobiliprotein extraction and spectrophotometric quantification. The extraction procedure as described in this protocol was also successfully applied to other cyanobacteria strains such as Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., and Nostoc sp., as well as to red algae Porphyridium cruentum. However, the extinction coefficients of specific phycobiliproteins from various taxa can differ and it is, therefore, recommended to validate the spectrophotometric quantification method for every single strain individually. The protocol requires little time and can be performed in any standard life science laboratory since it requires only standard equipment.

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Here, we present a protocol to quantitatively determine phycobiliprotein content in the cyanobacterium Synechocystis using a spectrophotometric method. The extraction procedure was also successfully applied to other cyanobacteria and algae strains; however, due to variations in pigment absorption spectra, it is necessary to test the spectrophotometric equations for each strain individually.

קביעת spectrophotometric תוכן Phycobiliprotein Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Immunology and Infection

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains of &#945;1,4-linked glucose residues with branches introduced through the addition of &#945;1,6-linkages. Understanding how the synthesis and degradation of glycogen are regulated and how glycogen attains its characteristic branched structure requires the study of the enzymes of glycogen storage. However, the methods most commonly used to study these enzyme activities typically employ reagents or techniques that are not available to all investigators. Here, we discuss a battery of procedures that are technically simple, cost-effective, and yet still capable of providing valuable insight into the control of glycogen storage. The techniques require access to a spectrophotometer, operating in the range of 330 to 800 nm, and are described assuming that the users will employ disposable, plastic cuvettes. However, the procedures are readily scalable and can be modified for use in a microplate reader, allowing highly parallel analysis.

Techniques to measure the activity of key enzymes of glycogen metabolism are presented, using a simple spectrophotometer operating in the visible range.

שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are influenced by its structure. Hence, a suitable extraction method that isolates representative samples of glycogen is crucial to the study of this macromolecule. Compared to other extraction methods, a method that employs a sucrose density gradient centrifugation step can minimize molecular damage. Based on this method, a recent publication describes how the density of the sucrose solution used during centrifugation was varied (30%, 50%, 72.5%) to find the most suitable concentration to extract glycogen particles of a wide variety of sizes, limiting the loss of smaller particles. A 10 min boiling step was introduced to test its ability to denature glycogen degrading enzymes, thus preserving glycogen. The lowest sucrose concentration (30%) and the addition of the boiling step were shown to extract the most representative samples of glycogen.

An optimal sucrose concentration was determined for the extraction of liver glycogen using sucrose density gradient centrifugation. The addition of a 10 min boiling step to inhibit glycogen-degrading enzymes proved beneficial.

מיצוי מולקולות גליקוגן בכבד לקביעת מבנה הגליקוגן

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This enables quantifications of ultrastructural aspects such as volume fractions, surface area to volume ratios, morphometry, and physical contact sites of different subcellular structures. In the 1970s, a protocol for enhanced staining of glycogen in cells was developed and paved the way for a string of studies on the subcellular localization of glycogen and glycogen particle size using transmission electron microscopy. While most analyses interpret glycogen as if it is homogeneously distributed within the muscle fibers, providing only a single value (e.g., an average concentration), transmission electron microscopy has revealed that glycogen is stored as discrete glycogen particles located in distinct subcellular compartments. Here, the step-by-step protocol from tissue collection to the quantitative determination of the volume fraction and particle diameter of glycogen in the distinct subcellular compartments of individual skeletal muscle fibers is described. Considerations on how to 1) collect and stain tissue specimens, 2) perform image analyses and data handling, 3) evaluate the precision of estimates, 4) discriminate between muscle fiber types, and 5) methodological pitfalls and limitations are included.

A modified post-fixation procedure increases the contrast of glycogen particles in tissue. This paper provides a step-by-step protocol describing how to handle the tissue, conduct the imaging, and use stereological methods to obtain unbiased and quantitative data on fiber type-specific subcellular glycogen distribution in skeletal muscle.

כימות של התפלגות גליקוגן תת-תאית בסיבי שריר השלד באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached to each other by &#945;-1,6 glucoside linkages, referred to as branch points. Among the different forms of carbon storage (i.e., starch, &#946;-glucan), glycogen is probably one of the oldest and most successful storage polysaccharides found across the living world. Glucan chains are organized so that a large amount of glucose can quickly be stored or fueled in a cell when needed. Numerous complementary techniques have been developed over the last decades to solve the fine structure of glycogen particles. This article describes Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE). This method quantifies the population of glucan chains that compose a glycogen particle. Also known as chain length distribution (CLD), this parameter mirrors the particle size and the percentage of branching. It is also an essential requirement for the mathematical modeling of glycogen biosynthesis.

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis FACE Method

In the present protocol, the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) technique is used to determine the chain length distribution (CLD) and the average chain length (ACL) of glycogen.

קביעת התפלגות אורך שרשרת גלוקאן של גליקוגן באמצעות שיטת אלקטרופורזה של פחמימות בסיוע פלואורופור (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Biology

A Non-Degradative Extraction Method for Molecular Structure Characterization of Bacterial Glycogen Particles

Currently, there exist a variety of glycogen extraction methods, which either damage glycogen spatial structure or only partially extract glycogen, leading to the biased characterization of glycogen fine molecular structure. To understand the dynamic changes of glycogen structures and the versatile functions of glycogen particles in bacteria, it is essential to isolate glycogen with minimal degradation. In this study, a mild glycogen isolation method is demonstrated by using cold-water (CW) precipitation via sugar density gradient ultra-centrifugation (SDGU-CW). The traditional trichloroacetic acid (TCA) method and potassium hydroxide (KOH) method were also performed for comparison. A commonly used lab strain, Escherichia coli BL21(DE3), was used as a model organism in this study for demonstration purposes. After extracting glycogen particles using different methods, their structures were analyzed and compared through size exclusion chromatography (SEC) for particle size distribution and fluorophore-assisted capillary electrophoresis (FACE) for linear chain length distributions. The analysis confirmed that glycogen extracted via SDGU-CW had minimal degradation.

Bacterial glycogen structure is greatly impacted by extraction methods which may result in molecular degradation and/or biased sampling. It is essential to develop methods to minimize these problems. Here, four extraction methods have been compared using size distribution and chain length distribution as key criteria for minimizing extraction artifacts.

Currently, there exist a variety of glycogen extraction methods, which either damage glycogen spatial structure or only partially extract glycogen, ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. Studying the structure and composition of phycobilisome is of great interest to scientists because it reveals the evolution and divergence of photosynthesis in cyanobacteria. This protocol provides a detailed and optimized method to break cyanobacterial cells at low cost by a bead-beater efficiently. The intact phycobilisome can then be isolated from the cell extract by sucrose gradient ultracentrifugation. This method has demonstrated being suitable for both model and non-model cyanobacteria with different cell types. A step-by-step procedure is also provided to confirm the integrity and property of phycobiliproteins by 77K fluorescence spectroscopy and SDS-PAGE stained by zinc sulfate and Coomassie Blue. The isolated phycobilisome can also be subjected to further structural and compositional analyses. Overall, this protocol provides a helpful starting guide that allows researchers unfamiliar with cyanobacteria to quickly isolate and characterize intact phycobilisome.

The current protocol details the isolation of phycobilisomes from cyanobacteria by centrifugation through a discontinuous sucrose density gradient. The fractions of intact phycobilisomes are confirmed by 77K fluorescent emission spectrum and SDS-PAGE analysis. The resulting phycobilisome fractions are suitable for negative staining of TEM and mass spectrometry analysis.

בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Glycogen Branching Assay to Measure the Degree of Glycogen Branching

Source: Wilson, W. A., <a href="https://app.jove.com/v/63046">Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe a qualitative spectrophotometric assay to determine the extent of branching in a glycogen sample with an uncharacterized structure. Comparing the absorbance maxima of the uncharacterized sample with that of polysaccharides with known branched structures indicates the presence of branching in the uncharacterized sample.

בדיקת הסתעפות גליקוגן למדידת מידת הסתעפות הגליקוגן

Source: Wilson, W. A., Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we describe a ...