אנו מודים לד&quot;ר טיירי Pourcher על שאפשר לנו להשתמש בספקטרומטר הקרינה ועל עזרתו. המעבדה ממומנת על ידי Ligue Nationale Contre le הסרטן (labellisée Equipe), האיגוד לשפוך la משוכלל ונדיר contre le סרטן, המכון הלאומי du הסרטן (Inca), Nationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר, METOXIA (תכנית האיחוד האירופי FP7), המרכז א Lacassagne, המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique, Institut National de la סנטה et de la משוכלל ונדיר Médicale ואוניברסיטת ניס <a href="http://www.unice.fr/isdbc/" target="_blank">(http://www.unice.fr/isdbc/).</a> אנו מודים לד&quot;ר M כריסטיאן Brahimi-הורן לקריאה ביקורתית ועריכת תיקון.

כותרות ביוכימית של גליקוגן 1. תמוגה תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע בריכוז של 0.5-2 x 10 6 לכל 100 צלחת בקוטר מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול: דגירה תאים 24, 48, או 72 שעות בריכוז הנמוך של חמצן (היפוקסיה) בתחנת באג-Box אנאירובי עבודה (הטכנולוגיה Biotrace Plc Ruskinn הבינלאומי, Bridgend, בריטניה) נקבעה על 1% או 0.1% O 2, 94% או 94.9% N 2, ו 5% CO 2. במקביל, תאי דגירה בnormoxia (21% O 2, CO 2 של 5%). שנה בינונית (מדיום המכיל גלוקוז 25 מ&quot;מ) בכל שעה 24 כדי למזער את השינויים בריכוז הגלוקוז בתקופת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיפול, תאים לשטוף 2X עם PBS להסיר עקבות של גלוקוז ממדיום לתרבות. לגרד את התאים בקור PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון ב1,000 סל&quot;ד במשך 5 דקות, לבטל את supernatant לשטוף את הכדור פעם אחת עם PBS. גלולה יכולה להיות קפוא ב -20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך הלאה.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור במים מזוקקים 100 μl. הוספה של גליקוגן הידרוליזה הצפת 100 μl מסופק עם גליקוגן ערכת Assay (Abcam). מרתיחים את lysate ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית אנזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס ו צנטריפוגות lysate ב13,000 סל&quot;ד 10 דקות כדי להסיר את המוצרים לא מסיסים. שמור את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל רמות הגליקוגן לתכולת החלבון בין דגימות, כימות של חלבונים ניתן לעשות עם 25-35 μl של supernatant באמצעות assay Bicinchoninic חומצה (BCA-Interchim). </li></ol> חלק מlysate ניתן להשתמש כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז החופשי בתוך התאים. 2. הידרוליזה של גליקוגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 50 μl של supernatant (שלב 1) עם 1 μl של הידרוליזה אנזים המיקס. תערובת זו מכילה glucoamylase. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עקומת הכיול על ידי דילול גליקוגן הסטנדרטי (2 מ&quot;ג / מיליליטר) שלupplied עם הערכה לפתרון של 10 מיקרוגרם / מיליליטר במאגר הידרוליזה. בשלב הבא, להכין שישה צינורות נפרדים עם 0, 4, 8, 12, 16, ו20 μl של 10 מיקרוגרם / מיליליטר סטנדרטי ולהתאים את כל צינור לנפח סופי של μl 50 עם חיץ הידרוליזה לתת ריכוז של גליקוגן של 0, 0.04 , 0.08, 0.12, 0.16, ו0.2 מיקרוגרם / מיליליטר. הוסף 1 μl של הידרוליזה אנזים מיקס בסטנדרטים ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol> ריכוז הגלוקוז ברקע של הקו הסלולרי, שניתן על ידי ערך עבור ריכוז גלוקוז החופשי, זה חייב להיות מופחת הערך לריכוז המוחלט גלוקוז (גלוקוז מהידרוליזה גליקוגן + חופשי גלוקוז) כדי לקבוע את הרמה של גליקוגן בתאים. 3. פיתוח וקריאה של הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תנאי, להכין צינור אחד (צינור 1) כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז חופשי ושני צינורות (צינורות 2 ו -3) כדי למדוד את ריכוז הגלוקוז בסך הכל (כל שנינות צינורחה נפח שונה של גליקוגן שעבר הידרוליזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 μl של supernatant שחולץ בסופו של שלב 1 בצינור 1. הוסף 35 μl של חיץ הידרוליזה כדי להשלים לנפח סופי של μl 50. הקרינה המתקבלת תיתן את הריכוז הגלוקוז בחינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת μl X של גליקוגן שעבר הידרוליזה (שהושג בשלב 2) בצינור 2. להסתגל לנפח סופי של μl 50. נפח דגימה (X μl) צריך להיות מותאם על פי צפיפות תאים ו / או סוג תא על מנת לקבל ערכי הקרינה שאינם מעבר לריכוזים של עקומת הכיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl X של גליקוגן שעבר הידרוליזה בצינור 3. להסתגל לנפח סופי של μl 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פיתוח לדגימות ולתקנים על ידי ערבוב לכל צינור 48.7 μl של פיתוח מאגר, μl 1 של פיתוח אנזים מיקס ו0.3 μl של OxiRed Probe (מסופק בערכת Assay גליקוגן). לדוגמא, עבור 2 תנאים, להכין תערובת לצינור 12s (6 לסטנדרטים, 2 לגלוקוז חופשי ו4 לסך הקרינה גלוקוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של תערובת זו על צינור אחד ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הקרינה באורך גל עירור של 535 ננומטר, אורך גל פליטה של ​​587 ננומטר כפי שהומלץ, וחריץ של 3 ננומטר לעירור ופליטה. </li></ol>

<ol>
	<li>Pelletier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+Synthesis+is+Induced+in+Hypoxia+by+the+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Promotes+Cancer+Cell+Survival.">Glycogen Synthesis is Induced in Hypoxia by the Hypoxia-Inducible Factor and Promotes Cancer Cell Survival.</a> Front Oncol. 2, (2012).</li><li>Alonso, M. D., Lomako, J., Lomako, W. M., Whelan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+biogenesis+of+glycogen.">A new look at the biogenesis of glycogen.</a> FASEB J. 9, 1126-1137 (1995).</li><li>Bollen, M., Keppens, S., Stalmans, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+features+of+glycogen+metabolism+in+the+liver.">Specific features of glycogen metabolism in the liver.</a> Biochem. J. 336 (Pt 1), 19-31 (1998).</li><li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver.">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 811-815 (2007).</li><li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions.">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11, 1094-1100 (2010).</li><li>Chee, N. P., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+liver+glycogen.">The structure of liver glycogen.</a> FEBS Lett. 73, 164-166 (1977).</li><li>Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+and+its+metabolism:+some+new+developments+and+old+themes.">Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes.</a> Biochem. J. 441, 763-787 (2012).</li><li>Moses, S. W., Bashan, N., Gutman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+metabolism+in+the+normal+red+blood+cell.">Glycogen metabolism in the normal red blood cell.</a> Blood. 40, 836-843 (1972).</li><li>Agbanyo, M., Taylor, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+3-deoxy-3-fluoro-D-glucose+into+glycogen+and+trehalose+in+fat+body+and+flight+muscle+in+Locusta+migratoria.">Incorporation of 3-deoxy-3-fluoro-D-glucose into glycogen and trehalose in fat body and flight muscle in Locusta migratoria.</a> Biosci. Rep. 6, 309-316 (1986).</li><li>Louzao, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Fluorescent+glycogen"+formation+with+sensibility+for+in+vivo+and+in+vitro+detection.">"Fluorescent glycogen" formation with sensibility for in vivo and in vitro detection.</a> Glycoconj. J. 25, 503-510 (2008).</li><li>Sheehan, D. C. H., B, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Baba, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+that+recognizes+glycogen+and+its+application+for+immunohistochemistry.">Production of monoclonal antibody that recognizes glycogen and its application for immunohistochemistry.</a> Kokubyo Gakkai Zasshi. 60, 264-287 (1993).</li></ol>

המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.

טיטרציה ביוכימית של גליקוגן במבחנה מאפשרת כימות מדויק של תוכן גליקוגן בתאים. השוואה לכמה טכניקות אחרות (PAS, immunofluorescence עם נוגדן גליקוגן, וכו &#39;.), טיטרציה זו היא ספציפית מאוד, רגישה ושחזור. יתר על כן, השיטה היא נוחה שכן הוא לא דורש רדיואקטיביות אבל ספקטרומטר הק...

גליקוגן הוא פולימר multibranched של שאריות הגלוקוז, אשר שוהה בציטופלסמה של סוגי תאים רבים. זוהי אחת הצורות העיקריות של אחסון אנרגיה בתאים וממלא תפקיד חשוב בחילוף חומרים של הגלוקוז. רוב תאי היונקים מסוגלים לייצר וגליקוגן חנות, אשר יכול להיות מושפל במהירות לגלוקוז כדי לקדם את ייצור גליקוליזה ו-ATP בלחץ מטבולים. Hepatocytes לייצר כמויות מסיביות של גליקוגן כדי לווסת את רמת הסוכר בדם ובכך לספק אספקה ​​רציפה של גלוקוז בגוף. לעומת זאת, הריכוז של גליקוגן בתאים אחרים (שרירים, תאי דם אדומים, וכו &#39;) הוא נמוך יחסית. עם זאת, באופן מקומי, כמויות אלה מספיקות כדי לספק אנרגיה בטווח הקצר, כאשר התאים נחשפים פתאום לסביבה המקופחת של חומרים מזינים. סינתזה של גליקוגן ופירוק גליקוגן כדלקמן את אותם צעדים בכל הרקמות (איור 1). ראשית, גלוקוזנכנס לתאים על ידי מובילי גלוקוז (עודפים), ומומר במהירות מglucose-6-phosphate (G6P) לגלוקוז-1-פוספט (G1P) על ידי phosphoglucomutase. G1P הוא שונה אז לUDP-גלוקוז, וC1 הפחמן של UDP-גלוקוז מחובר לשאריות טירוזין של glycogenin, חלבון העיגון של גליקוגן. מולקולה זו, הנחשבת לפריימר הגליקוגן, הוארכה על ידי צירופה של UDP-גלוקוז לגלוקוז המסוף ידי α (1 → 4) איגרות חוב באמצעות synthase הגליקוגן. לבסוף, כאשר שרשרת ליניארית של מעל 11 שאריות הגלוקוז נוצר, אנזים ההסתעפות מעביר oligosaccharide מסוף היווה ידי מינימום של 6 שאריות גלוקוז לגלוקוז אחר של השרשרת סמוכה באמצעות הצמדת α (1 → 6). חזרה על התהליך הזה נותן מבנה פרקטלית מאסיבי המכיל ענפים היוצרים סליל עם 6.5 גלוקוז בכל תור. הגליקוגן יכול להיות reversely הידרוליזה לגלוקוז על ידי הפעולה מתואמתשל debranching אנזימים שhydrolyze α (1 → 6) מחויב וphosphorylase גליקוגן שhydrolyzes α (1 → 4) glycosidic כבול בין השאריות האחרונות של גלוקוז של סניף ומולקולת גליקוגן. תגובה זו נקראת &quot;גליקוגנוליסיס מופעלת על ידי הגדלת רמות של AMP (המשקף את צריכת ה-ATP), ומעוכבת על ידי גלוקוז ו-ATP 2,3. על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים, מולקולות גליקוגן תוארו בסוגי תאים רבים חלקיקי β כבחינם (או monoparticles גליקוגן) של 15-30 ננומטר בקוטר. בסוגי תאים ספציפיים, כגון hepatocytes, ניתן להרכיב חלקיקי β למורכבים ליצירת רוזטות, הידוע גם בחלקיקים α המשתנות בקוטר מ 80 ננומטר עד למקסימום של 4 200 ננומטר </sup&gt;. דרך חלקיקי β אלה ערובה ליצירת צבירים גדולים יותר של חלקיקי α עדיין לא הובהרה במלואו. כמה ראיות נוטה להוכיח כי יכולים להיות קשורים חלקיקי β ידי מליטה קוולנטיים 5, מליטה מימן, או אפילו דרך אינטראקציות בין חלבונים 6. כמות הגליקוגן מאוחסן בתאים תלויים בפרמטרים רבים: (i) הסכום של glycogenin בתא שיוזם סינתזת הגליקוגן (ii) את הפעילות של synthase הגליקוגן וphosphorylase מוסדר על ידי זירחון חלבון / dephosphorylation; (שלישי) את הריכוז של גלוקוז בתאים, שהוא תלוי במספר פרמטרים כגון אספקת הגלוקוז ממערכת כלי הדם וספיגת הגלוקוז על ידי תאים. מאגרי הגליקוגן מוסדרים בחוזקה על ידי הרגולציה allosteric של הורמוני biosynthetic דרך מטבוליטים ביניים, על ידי הורמונים המסדירים את חילוף חומרים של אנרגיה, ועל ידי מסלולי איתות חישת מזין 7. חשוב להיותמסוגל לכמת גליקוגן בדגימות ביולוגיות כדי להבין את החשיבות של חילוף חומרים של הגליקוגן בגוף כולו והרמה תאית טוב יותר. אנו מתארים כאן ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה בassay חוץ גופית לגליקוגן. טכניקה זו מבוססת על הקרינה גלוקוז הכימות לפני ואחרי הידרוליזה ספציפית של גליקוגן. שיטות אחרות קיימות כדי להעריך את הרמה של גליקוגן בתאים, אבל רובם הם לא כמוני. אחת הטכניקות הראשונות שתוארו לכימות של גליקוגן בתאים התבסס על מדידת התאגדות [14 C]-גלוקוז לגליקוגן 8,9. השימוש בקרינה רדיואקטיבית עושה את התהליך הזה קשה יותר להתמודד אבל יש לו את היתרון של מתן שיעור התאגדות גלוקוז לגליקוגן ולהבחין בין ההפצה של שאריות הגלוקוז על הענפים החיצוניים ובליבה של המולקולה (זה גם דורש β-amyloly נוסףאחותי וצעד chromatographic). טכניקה נוספת שפותחה לאחרונה והוא מבוסס על השילוב של 2-NBDG (2 - {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazol-4-י.ל.] אמינו}-2-deoxyglucose), נגזר 2-deoxyglucose ניאון, לגליקוגן 10. עוצמת הקרינה שנמדדה משקפת את כמות הגליקוגן מיוצרת וניתן למדוד עם קורא הקרינה. הפצה של הקרינה בתא גם יכולה להיות מוערכת על ידי מיקרוסקופיה confocal. בין טכניקות nonquantitative האחרות, מכתים תקופתי חומצה שיף (PAS) הוא אולי הנפוץ ביותר. ניתן להשתמש בו לצורך זיהוי של גליקוגן בתאים קבועים, קטעי רקמה בפרפין או קפואים. צבעי טכניקה היסטולוגית זה לא במיוחד סוכרים, glycolipids, גליקופרוטאינים, תאית וmucins הניטרלי בסגול. הסגוליות של בדיקה זו יכולה להיות מוגבר על ידי טיפול בתאים קבועים או חלקי רקמות עם diastase, שדווקא מעכל גליקוגן. לאחר מכן,רמת הגליקוגן ניתן לאמוד באופן איכותי על ידי השוואת דגימות unhydrolyzed (כל מקרומולקולות הפחמימות שונה) לדגימות שעברו הידרוליזה (פחמימות שונה מקרומולקולות מלבד גליקוגן). צביעת PAS וניתוח מיקרוסקופי, בניגוד למבחנים ביוכימיים של גליקוגן, מספק מידע בנוגע להפצה של גליקוגן בתאים, אשר יכול להיות מפוזרת או מרוכזת בחלק מסוים של התא. עם זאת, אף על פי שהבדלי הערכות צביעת PAS בהצטברות גליקוגן בין תנאים שונים, זה לא כמוני 11. נוגדן חד שבטי עכבר במקור נעשה באמצעות סחוס condylar mandibular כאנטיגן הוכח להגיב בגליקוגן בתאים ועם גליקוגן מטוהר במבחנה 12. כנוגדן זה דווקא מכיר בשרשרות סוכר הקשורות לגליקוגן, זה הוא כלי שימושי לזיהוי של הגליקוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באופן ספציפי יותר מאשר צביעת PAS. </p&gt; במיקרוסקופ אלקטרונים הוא טכניקה נוספת שמאפשרת הדמיה של דגנים של גליקוגן בתאים והערכה של מידת אחסון גליקוגן. למעשה, חלקיקי β גליקוגן הם קל לזיהוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים כגרגרים צפופים אלקטרון 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31966.047</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glycogen Assay Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab65620 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		<tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
	 </tr>
		 <tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence Spectrometer</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>LS 50B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

biochemical titration of glycogen in vitro

גליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בבעלי חיים בעלי חוליות וממלאים תפקיד מכריע בחילוף חומרים בגוף כולו, כמו גם בחילוף חומרים תאיים. שיטות רבות לאיתור גליקוגן כבר קיימות אבל רק מעטים הם כמוני. אנו מתארים כאן שיטת שימוש בערכת assay Abcam גליקוגן, אשר מבוססת על השפלה ספציפית של הגליקוגן לגלוקוז על ידי glucoamylase. גלוקוז אז במיוחד חמצון למוצר שמגיב עם חללית OxiRed לייצר הקרינה. כותרות היא מדויקות, רגישה ויכולות להיות מושגת על תמציות תא או חלקי רקמות. עם זאת, בניגוד לשיטות אחרות, זה לא נותן מידע על ההפצה של גליקוגן בתאים. כדוגמא לטכניקה זו, שאנו מתארים כאן טיטרציה של גליקוגן בשתי שורות תאים, CCL39 פיברובלסטים ריאות אוגר הסיני וLS174 קרצינומה של המעי הגס האנושי, מודגרות בnormoxia (O 21% 2) לעומת היפוקסיה (1% O 2). חוקרים שערנו כי היפוקסיה היא signal שמכין תאים לסנתז וגליקוגן חנות על מנת לשרוד 1.

רמה נמוכה של חמצן (היפוקסיה) באותות גידולים לתאי גידול את הצורך לאחסן אנרגיה כדי להתמודד עם דלדול מזין שלאחר מכן, כדי לשרוד. כגליקוגן הוא הפולימר האנרגטי העיקרי של גלוקוז בתאי יונקים, שחקרנו את ויסות אחסון הגליקוגן בהיפוקסיה. החישוב וסטנדרטיזציה של הריכוז של גליקוגן ...

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical Titration of Glycogen In vitro at JoVE.com

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

אנו מתארים כאן שיטה ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה לטיטרציה של גליקוגן במבחנה. טכניקה זו משתמשת בערכת assay Abcam גליקוגן והוא מבוסס על הידרוליזה רצופה של הגליקוגן לגלוקוז וגלוקוז טיטרציה על ידי הקרינה.

כותרות ביוכימית של גליקוגן<em&gt; במבחנה</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

biochemical-titration-of-glycogen-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

28.2K Views.  University of Nice - Sophia Antipolis.  אנו מתארים כאן שיטה ביוכימית מדויקת, לשחזור ונוחה לטיטרציה של גליקוגן במבחנה. טכניקה זו משתמשת בערכת assay Abcam גליקוגן והוא מבוסס על הידרוליזה רצופה של הגליקוגן לגלוקוז וגלוקוז טיטרציה על ידי הקרינה. 

Video: Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.

In this video, we demonstrate an alternative method for detection and titering of viruses using an enzymatic antigen detection technique known as an immunoperoxidase assay. Here, we will show you how to collect your viral samples, prepare the cells for testing, and finally the immunoperoxidase assay using serial dilutions to determine the viral titer.

טיטרציה של נגיפי קורונה האדם שימוש Assay אימונו

Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

החדר דג הזברה המוח Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Collecting Variable-concentration Isothermal Titration Calorimetry Datasets in Order to Determine Binding Mechanisms

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host macromolecule. ITC has some advantages over common spectroscopic approaches for studying host/ligand interactions. For example, the heat released or absorbed when the two components interact is directly measured and does not require any exogenous reporters. Thus the binding enthalpy and the association constant (Ka) are directly obtained from ITC data, and can be used to compute the entropic contribution. Moreover, the shape of the isotherm is dependent on the c-value and the mechanistic model involved. The c-value is defined as c = n[P]tKa, where [P]t is the protein concentration, and n is the number of ligand binding sites within the host. In many cases, multiple binding sites for a given ligand are non-equivalent and ITC allows the characterization of the thermodynamic binding parameters for each individual binding site. This however requires that the correct binding model be used. This choice can be problematic if different models can fit the same experimental data. We have previously shown that this problem can be circumvented by performing experiments at several c-values. The multiple isotherms obtained at different c-values are fit simultaneously to separate models. The correct model is next identified based on the goodness of fit across the entire variable-c dataset. This process is applied here to the aminoglycoside resistance-causing enzyme aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii). Although our methodology is applicable to any system, the necessity of this strategy is better demonstrated with a macromolecule-ligand system showing allostery or cooperativity, and when different binding models provide essentially identical fits to the same data. To our knowledge, there are no such systems commercially available. AAC(6')-Ii, is a homo-dimer containing two active sites, showing cooperativity between the two subunits. However ITC data obtained at a single c-value can be fit equally well to at least two different models a two-sets-of-sites independent model and a two-site sequential (cooperative) model. Through varying the c-value as explained above, it was established that the correct binding model for AAC(6')-Ii is a two-site sequential binding model. Herein, we describe the steps that must be taken when performing ITC experiments in order to obtain datasets suitable for variable-c analyses.

ITC is a powerful tool for studying the binding of a ligand to its host. In complex systems however, several models may fit the data equally well. The method described here provides a means to elucidate the appropriate binding model for complex systems and extract the corresponding thermodynamic parameters.

איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה

Isothermal titration calorimetry (ITC) is commonly used to determine the thermodynamic parameters associated with the binding of a ligand to a host ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

שמר האפייה קינטיקה גידול אקספוננציאלי בתרבות אצווה כדי לנתח את חילוף החומרים הנשימה ואת Fermentative

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...