ברצוננו להודות Changhui פאק Alysia Vrailas מורטימר להוראת בתחילה SMK טכניקת ניתוח מוח. אנו מודים גם חברי קבוצת המעבדה של קן Moberg, במיוחד כריס סיבובים, עבור אנושות לקרוא את כתב היד. נוגדנים זיהוי Fas2 (1D 4), chaoptin (24B10) התקבלו מהבנק ליפידים של מחקרים התפתחותיים. נוגדנים 24B10 ועליהן כדי DSHB סימור Benzer ו Nansi Colley24,60,61, נוגדן 1D 4 נמצא כדי DSHB על קורי גודמן 22,23,56. מניות לטוס התקבלו ממרכז מניות בבלומינגטון. . גם אני רוצה להודות את המחקר החקלאי אוהיו ומרכז פיתוח מרכז (OARDC) MCIC הדמיה לשימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי לשיקוף המוחות בכל איור 4A וב' SMK נתמך על ידי מענק של NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

דיסקציה והדמיה השיטה המתוארת לעיל ניתן להשתמש במגוון רחב של immunostaining, גרה יישומי הדמיה. אנו המחולקות פרוטוקול immunostaining כללי, הדגישו דרך אחת שבה MARCM יכול לשמש כדי להמחיש עצב מורפולוגיה של נוירונים בודדים הגוף פטריות. בנוסף, נהלים כלליים אלה יכול לשמש גם עבור הדמיה אחרים אזורים במוח בקבועה או מבוגר טרי ביתור המוח48,65. הדמיה חיה עשוי לספק גישה יעילה יותר בעת ניתוח דפוסי ביטוי של מלכודות משפר, כתב גנים או לחקות קווים66, לדוגמה. כדי למנוע לכידת ממצאים מוות של תאים במהלך הדמיה חיה של GFP ברקמת מבולבל, המוח צריך להיות גזור 1 x מדיה פוספט Buffered מלוחים (PBS) או HL348רכוב על גשר שקופיות 1 x PBS (או HL3), עם תמונה של פחות מ 15-20 דקות טיפול צריך גם להתייחס כדי להסיר את קנה הנשימה רב ככל האפשר של המוח גזור לפני הדמיה, מאז זה יכול להפריע ויזואליזציה של זריחה GFP.
ואילו תנאים מכתימים להערכת המורפולוגיה של נוירונים הגוף, קולט אור פטריות61,יחסית ומבוססת24,67, הלוקליזציה של חלבון ספציפי עניין באלה תא סוגי עשויים לדרוש פתרון מקיף ואופטימיזציה. בפרט, צריך להיות מוטבת מספר שלבים קריטיים, כולל דילול נוגדן, מאגר רכיב ריכוז חסימה של יציבות, כדי להפיק את התוצאות ביותר לשחזור ואמין. ראשית, צריך להיקבע ריכוז אופטימלי של נוגדן ראשוני. למרות נוגדנים זמינים מסחרית יש לעתים קרובות לדילול המוצע (אנחנו לעיתים קרובות בתחילה להפעיל באמצעות הריכוז הזה), ערכים אלה רחוקות נקבעים מדעית על רקמות דרוזופילה . לכן, בדיקה של סדרת דילולים נוגדן ראשוני כי טווח מעל ומתחת החל הצעה היצרן לעתים קרובות התוצאות מכתים יותר ספציפי. בעוד נוגדן ראשוני דילול יכולה להיות השפעה משמעותית על צביעת דיוק בדיוק ייקבע, שכל הזמן מודגרת ב נוגדן ראשוני המכיל פתרונות יכול להשתנות במידה ניכרת עם השפעה קטנה על התוצאה הכוללת. לדוגמה, הבחנו תוצאות דומות כאשר המקננת גזור מוחות עם הנוגדן העיקרי של נוגדן Fas2. בשביל שניים, שלושה, או אפילו ארבעה ימים ב- 4 מעלות צלזיוס. אמנם אנו ממליצים לפחות שני לילות, יש גם מודגרות המוח בפתרון נוגדן ראשוני לילה יחיד ואנו שהושג מכתים לשחזור. חשוב, להגביל את כמות הזמן המוח מודגרת ב הנוגדן משני ל-3 שעות בטמפרטורת החדר (או לילה אחד ב 4 ° C) מסייעת מגבלת איגוד שאינם ספציפיים של נוגדנים משניים רקמת המוח.
שנית, ייתכן צורך להשתמש נוספים ריאגנטים "חסימה" לחסל את האות הרקע הבלתי רצויים. האפשרויות כוללות הגדלת ריכוז המיתרים ~ 10%, הוספת 1-10% שור אלבומין (BSA) חסימה, ראשי/משני פתרונות נוגדן או טרום ספיחה של נוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 ° C עם עוברי דרוזופילה (ראה התייחסות68, סעיף 2.9, שלב 3).
בזמן שכתבנו בפרוטוקול לעיל באמצעות ניידת כמו המאגר המוצע עבור כל קיבעון, לשטוף, נוגדן הדגירה צעדים, קיבוע הרקמה במאגרי אחרים (כגון פיפ ו- PEM, נמצאת טבלת חומרים) עלול לגרום עמוקה הבדלים עוצמת אות. לדוגמה, מחקרים קודמים הדגימו כי Cyclin E הוא לא ניתן לזיהוי בשנת דיסקים דמותי זחל כאשר רקמות המתוקנים ב- paraformaldehyde 4% מסורתיים מדולל ב- PBS, אבל הוא נראה בבירור כאשר רקמות קבועים במאגר פיפ (Moberg קן, אישי תקשורת, ו הפניה69). בנוסף שינויים במאגר רכיבים, משנים את זמן וטמפרטורה עבור קיבוע הרקמה יכול גם להשפיע באופן משמעותי על immunofluorescent מכתים, יכול להיקבע מדעית במידת הצורך. בדרך כלל, קיבוע זמן צריך להיות ארוך מספיק כדי לאפשר crosslinking מספיקות של רכיבי הסלולר, תחזוקה לטווח הארוך של מורפולוגיה הסלולר בסך הכל בעת היותו מוגבל מספיק כדי למנוע נגמר-crosslinking "לקבור" של חלבון epitopes. לכן, כאשר בתחילה מיטוב מכתימים תנאים נוגדן ראשי החדשים שנרכשו, אנו בדרך כלל להגביל את זמן קיבעון כ 20 דקות, לעתים קרובות יהיה לתקן את הרקמות בטמפרטורה קרירה.
מספר פקדים צריכים להיכלל בכל ניסוי immunofluorescence לחקור יחודיות של נוגדנים ראשיים ומשניים, כמו גם את השפעת הרקע הגנטי/transgenes על פנוטיפ שנצפה. לבירור אם הנוגדן העיקרי בשימוש במיוחד מזהה את החלבון עניין, רקמות מהזבובים חסר זה חלבון ו/או רקמות overexpressing החלבון צריך להיות כלול כפקדים. התוספת של אנטיגן מטוהרים עודף חלבון יכולים להיכלל גם כדי לקבוע אם הנוגדן ראשי מזהה אחרים epitopes במוח לעוף. לבסוף, כל אות ניאון נוכח כאשר נוגדנים העיקרי מושמטים מייצג הרמה של איגוד לא ספציפית על ידי הנוגדנים משני שנבחרו.
יש גם לכלול מספר פקדים חשוב להעריך את התרומה של הרקע הגנטי או הנוכחות של transgenes עוצמת מכתימים או מורפולוגיה עצביים. לדוגמה, הזבובים בשימוש הניסוי MARCM באיור 5 להכיל מספר transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, האמבטיה &#62; GAL80, OK107-GAL4), שכל אחד מהם צריך להיות מנותח בנפרד על ההשפעות על הגוף פטריות מורפולוגיה. ב מורפולוגיה מאוד מינימלי, פטריות גוף של הזבובים המכיל OK107-GAL4 והן UAS-CD8-GFP צריך להיות מנותח. זה יכול להיות גם צורך להעריך את ההשפעה של הלם חום ומפליגה Flp הפקה recombinase על פיתוח גוף פטריות על-ידי ניתוח המכילים הן hsFLP והן FRT82B. למרות MARCM יכול לספק תובנה משמעותית אם חלבון נתון שולט באופן עצמאי הדרכה עצב, מספר פקדים נדרש לבצע במדויק מסקנה זו יכול להיות מגבלה מינור של טכניקה זו. בניסויים פחות מסובך, פקדים דומים חלים גם. לדוגמה, קח ניסוי שבו מערכת GAL4/UAS משמש בשילוב עם transgene RNAi לביטוי תמונות ציפורים של חלבון של עניין כל הנוירונים. בניסוי זה, לפחות שני transgenes להיות נוכחים: נהג GAL4 פאן עצבית, כגון elav-GAL4, את transgene UAS-RNAi . המורפולוגיה של הגוף פטריות נוירונים בזבובים המכילים כל אחד מהם את transgenes האלה לבד צריך להיחקר בנוסף התנאי ניסיוני איפה זבובים הנמל בשני transgenes בתוך הזבוב אותו.
לבסוף, כדי לקבוע אם החלבון עניין מתבטאת נוירונים הגוף פטריות יש בדרך כלל צורך המוח הכתם שיתוף עם נוגדנים Fas2. לחלופין, פלורסנט חלבונים כמו GFP, RFP, או הקרום מאוגדים CD8-GFP יכול להתבטא גם באמצעות מערכת GAL4/UAS , בשילוב עם נוגדנים זיהוי החלבון עניין. Fas2 מזהה רק fasciculated האקסונים המהווים האונות α וβ הגוף פטריות, השימוש של CD8-GFP, מונחי-GAL4 ממברנה מכורך מאז שימושי במיוחד עבור סימון הגוף פטריות נוירונים.
פגמים הדרכה עצב לעתים קרובות לא 100% penetrant, אפילו המוח גנוטיפ באותה עשויים להראות כמה השתנות. לכן, כאשר ניתוח החדש שנוצר אללים mutant פגמים הגוף פטריות או קולט אור pathfinding, שילוב של אללים שונים וגישות צריך להיות מנוצל. רוב המחקרים בספרות להשתמש מספר גישות שונות כדי לחקור אם חלבון ממלאת תפקיד התא-אוטונומי שליטה הדרכה עצב: אני) ניתוח של pathfinding פגמים homozygous זבובים null (רצוי באמצעות nu שוניםll אללים), ii) ניתוח של pathfinding פגמים זבובים חסר החלבון עניין רק בנוירונים (בדרך כלל באמצעות RNAi), השלישי) ניתוח MARCM של פגמים pathfinding, ו- iv) להציל את הניסויים איפה הגן מחדש מתבטאות הנוירונים של homozygous null זבובים. באופן אידיאלי, כמה עשרות המוח לכל גנוטיפ צריך להיות מנותח על פגמים מורפולוגיה עצביים.
למרות הפרוטוקול המתוארים כאן מתמקדת בעיקר על לוקליזציה immunofluorescent של חלבונים בתוך רקמת קבועה, מספר יישומים עתידיים של טכניקה זו מפותחים לרקמות מוח חי תמונה. ברגע שכל הם גזור (בדרך כלל בתקשורת התרבות התא), ואז ניתן בתרבית במשך מספר ימים ב 25 º C. השיטות שמחוץ culturing שפותחו במטרה לחקור מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כגון פעילות החלבון לקידום התחדשות האקסון בעקבות פציעה70,71, תאיים דינמיקה איתות72, ההתפתחות העצבית73.

מערכת העצבים דרוזופילה אמנם קטן יותר מזה של בני אדם, מכרסמים, המורכבות שלה מספק מודל חזק, נגיש כדי להבין טוב יותר את עמיתיהם חוליות. במקרים רבים, הגנום של חולייתנים וזבובים לקודד חלבונים דומים מאוד המכתיבים את מנגנוני התפתחות מערכת העצבים. למעשה, רבים של הגנים הדרושים להתפתחות העצבית גולגולת יש orthologs בזבובים, כולל אלה מעורבים איתות המסלולים את השליטה המתבנת, נוירוג'נסיס ו הדרכה עצב1,2,3 4, ,5. לדוגמה, netrin היא ליגנד הנדרש להדרכה עצב יונקים ו melanogaster ד6,7,8. בעוד netrin הופרדה במקור רקמת המוח צ'יק עובריים6, מחקרים מאוחרים יותר גילו ש-netrin הזה משחק תפקיד שנשמרת במהלך הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית עובריים (CNS) דרוזופילה8. מחקרים אחרים השתמשו מסכי גנטית עובריים דרוזופילה CNS כדי לזהות קולטנים הדרושים עבור pathfinding גם דרוזופילה וגם בעלי חוליות9של ליגנדים שנשמרת.
בעוד הזבוב עובריים CNS שימש בהרחבה בעבר כדי לזהות ליגנדים קולטנים, חלבוני איתות תאיים הדרושים עבור הדרכה עצב8,9, עבודה האחרונות חקרה את הדרכים, אשר של חלבונים אלה גם לשלוט pathfinding החלטות במהלך בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות. באופן ספציפי, חקירה של הגוף פטריות (MB) ופיתוח נוירון קולט אור ברשתית (איור 1) סיפקה תובנה המנגנון הזה pathfinding שליטה, היווצרות סינפסה, גיזום האקסון, מספר היבטים אחרים של עצביים פיתוח10,11,12,13,14,15,16,17. קולט אור נוירונים להתחבר הרשתית לעוף לאזורים במוח למבוגרים שנקרא הנדן, לשד הם קריטיים עבור מסירת מידע חזותי למוח (נבדקה על ידי18,19), בעוד הגוף פטריות הנוירונים הם מרכזי ממוקם במוח לעוף, נדרשים עבור20,של למידה וזיכרון -21. נוירונים קולט אור והן את הנוירונים מהותי של הגופים פטריות, המכונים תאים קניון, לנצל מנגנוני שנשמרת אבולוציונית diffusible תלויי-הקשר עצב והדרכה כדי למצוא את המטרות הפוסט-סינפטית. בנוסף להיותו גלוי הזבוב הבוגר, קולט אור, נוירונים MB גם להיות ישירות visualized הזחלים, גלמי עם נוגדנים או כתב גנים22,23,24,25. היכולת בקלות לדמיין אלו שתי קבוצות של נוירונים בנקודות זמן שונות התפתחותית קידם את השימוש בהם כמו דגמים מעולים עבור היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.
בנוסף נעשה שימוש כמודל להבין את המנגנונים של התפתחות מערכת העצבים נורמלי, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי זבובים יכול לשמש גם מודלים מדויק של מגוון רחב של מחלות האדם, לרבות שביר X תסמונת (FXS)26 , נכות אינטלקטואלית (ID)27,28,29,30,31, ואחרים32. לדוגמה, כדי ללמוד את הפונקציה מולקולרית של ZC3H14, גן לאחרונה לקשר אנושי מוגבלות שכלית, יצרנו מודל לעוף של מזהה משתמש של אלל null של הזבוב ZC3H14 ortholog, שנקרא Nab230. זבובים חסר Nab2 יש ליקויי הזיכרון חמורה, מורחב poly(A) זנבות, recapitulating מה נצפית בחולים אנושיים או החולה נגזר תא קווים33,34. חשוב לציין, זבובים חסר Nab2 גם להציג מוחית חמורה מורפולוגיה פגמים שלהם גופות פטריות למבוגרים34, הדומה תצפית בזבובים חסר הגן תסמונת FXS, FMR135. לפיכך, זבובים יכול לשמש אורגניזם מודל חשוב ללמוד גם התפתחות המוח נורמלי וגם מחלות לשבש את זה.
לבסוף, הנגישות של תפוקה גבוהה שיטות לעקוב אחר התנהגות, בשילוב עם המערך העצום של כלים גנטיים זמין, להפוך דרוזופילה אורגניזם מודל של בחירה עבור זיהוי האזורים במוח השולטים התנהגויות מורכבות, כגון למידה, זיכרון, שינה, חיזור, הצמא ואחרים36,-37,-38,-39. כלי שימושי במיוחד נמצא במרכז של גנטיקאי לעוף "ארגז הכלים" היא מערכת GAL4/UAS (איור 2). זו מערכת40,41 משתמש ביטוי ספציפי רקמות activator תעתיק Gal4 כדי להגדיל את הביטוי של גנים או transgenes במורד הזרם של במעלה הפעלת רצף (UAS). שינויים של מערכת זו מאפשרת לחוקרים, לדוגמה, הבקרה בדיוק את דעתנית של נוירונים ספציפיים42,43, overexpress או דפיקה למטה גנים ספציפיים של עניין44, 45, לנתח את הדינמיקה ויווסידן בזמן אמת46ו אקספרס גנים כתב לסימון שושלות עצביים41. השילוב של מערכת GAL4/UAS עם רקומבינציה mitotic אפשרו גם את היצירה של הניתוח פסיפס עם12,מערכת סמן תא Repressible (MARCM)47. MARCM כבר בשימוש נרחב נוירון בודד העקיבה כדי לזהות את מרכיבי התא איתות הדרושים עבור הדרכה עצב12,47. למרות אלה וטכניקות אחרות סיפק מספר תובנות על המנגנונים הסלולר הנדרשות לתפקוד מערכת העצבים, דורשות המוח דרוזופילה קודם להיות שפרופסור; הסרת זהיר של המוח הוא נדרש לשמור תבניות מורפולוגיה וחיבור מוח הנכון בין אזורי המוח. להלן כללי התנהגות משתמש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות כמודוגמה אוכלוסיות עצביים כמו זה מנחה אותך דרך הקרע, המוח דרוזופילה immunofluorescent מכתים של מבוגר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

פיתוח מערכת העצבים כרוכה בביצוע סידרת אירועים שפעילותם מתואמת על ידי מספר איתות המסלולים, רשתות בקרה רגולטריות רציפים. רבים מן החלבונים המעורבים המסלולים הללו אבולוציונית נשמרים בין יונקים אחרים פרוקריוטים, כגון זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster, רומז כי עקרונות ארגון דומה קיים במהלך הפיתוח של אלה אורגניזמים. חשוב לציין, דרוזופילה שימש בהרחבה כדי לזהות מנגנונים תאית ומולקולרית ויסות תהליכים הנדרשים אצל יונקים לרבות נוירוג'נסיס, בידול, הדרכה עצב synaptogenesis. זבובים שימשו גם בהצלחה לדגם מגוון רחב של מחלות התפתחותיות אנושי. כאן נתאר פרוטוקול עבור microdissection שלב אחר שלב, קיבוע, לוקליזציה immunofluorescent של חלבונים בתוך המוח דרוזופילה למבוגרים. פרוטוקול זה מתמקד שתי האוכלוסיות עצביים דוגמה, הגוף פטריות נוירונים, photoreceptors ברשתית, וכוללת שלבים אופציונליים כדי לעקוב אחר נוירונים בודדים הגוף פטריות באמצעות ניתוח פסיפס עם טכניקה סמן תא Repressible (MARCM). נתונים לדוגמה המוח פראי-סוג והן מוטציה מוצגים עם תיאור קצר של קריטריון הבקיע עבור הדרכה עצב פגמים. פרוטוקול זה מדגיש שני נוגדנים ומבוססת על חקירת המורפולוגיה של הגוף פטריות ואילו נוירונים קולט אור, אחרים אזורים במוח דרוזופילה , הלוקליזציה של חלבונים בתוך אזורים אחרים במוח יכול להיות גם חקר באמצעות פרוטוקול זה.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains at JoVE.com

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים רבים של ההתפתחות העצבית.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

19.1K Views.  The College of Wooster. פרוטוקול זה מתאר את הקרע של immunostaining של המבוגרים דרוזופילה melanogaster רקמות המוח. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מדגיש את השימוש נוירונים הגוף, קולט אור פטריות דרוזופילה בתור דוגמה עצביים קבוצות משנה יכול לשמש באופן מדויק לחשוף את עקרונות כלליים שבבסיס היבטים ר...

Video: Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

גידול זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתנאי Axenic ו Gnotobiotic

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

דיסקציה, אימונוהיסטוכימיה והרכבה של מוחות זחלים ודרוזופילה בוגרים להדמיית האונה האופטית

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...