דיסקציה, אימונוהיסטוכימיה והרכבה של מוחות זחלים ודרוזופילה בוגרים להדמיית האונה האופטית

אנו מתארים פרוטוקול לניתוח, אימונוסטיין והרכבה של מוחות זחלים ודרוזופילה בוגרים, עם דגש מיוחד על האונות האופטיות. בהתחשב בארגון התלת-ממדי המורכב של האונה האופטית, צפוי כי הפרוטוקול המתואר כאן יספק לחוקרים הבנה טובה יותר של הקשר בין כיוון ההרכבה לבין מבני האונה האופטית המתוארים. פרוטוקול זה מתאר שלוש אסטרטגיות הרכבה הן עבור אונות ראייה זחליות והן עבור אונות אופטיות בוגרות, שכל אחת מהן מספקת זווית אופטימלית לדמיין מבנה ספציפי של האונה האופטית במהלך ההדמיה.

לפני תחילת הנתיחה, מלאו את כל הבארות של צלחת שלוש בארות עם 400 מיקרוליטר PBS לכל באר, והשתמשו במלקחיים כדי לבחור בעדינות 15 זחלי כוכב שלישי נודדים הזוחלים על החלק הפנימי של בקבוקון דרוזופילה או בקבוק. מניחים את כל הזחלים בבאר הראשונה מבין שלוש הבארות, ומעבירים זחל אחד לבאר האמצעית של הצלחת. בעזרת היד הלא דומיננטית, מרסנים את גוף הזחל בבסיס הבאר ומשתמשים ביד הדומיננטית כדי לתפוס בעדינות את וו הפה של הזחל.

משוך את וו הפה הרחק מהגוף כדי להסיר את המוח. לאחר מכן, להסיר את רקמות האביזר, כולל דיסקים דמיוניים. לאחר מכן הכניסו את המוח לבאר השלישית של הצלחת.

לאחר שכל המוחות נותחו, השתמשו בפיפטת P200 כדי להסיר בזהירות את PBS מהבאר השלישית, והשאירו מספיק תמיסה כדי לשמור על המוח שקוע. מוסיפים 500 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע קרה טרייה שהוכנה לבאר. מערבבים בעדינות את התמיסה עם המלקחיים כך שהמוח מסתחרר בצלחת, ומכסים את הבאר במגלשת מיקרוסקופ זכוכית.

לאחר מכן מניחים את המנה על קרח במשך 30 דקות כדי לתקן את הרקמה. שטפו את המוח חמש פעמים עם 400 מיקרוליטר של PBS טרי בתוספת טריטון בכל שטיפה. המוח מוכן כעת לדגירה ראשונית של נוגדנים.

עבור ניתוחי מוח של מבוגרים, יש להרדים 10 עד 15 זבובים בוגרים ולהניח אותם על מגבון מעבדה מעל קרח. השתמש במלקחיים כדי להעביר בעדינות זבוב בוגר אחד על ידי הכנף לתוך באר אחת של צלחת דיסקציה שלוש בארות המכילה 400 מיקרוליטר של PBS. השתמש בזוג מלקחיים ביד הלא דומיננטית כדי להחזיק את בית החזה של הזבוב כנגד בסיס הבאר, והשתמש במלקחיים עדינים במיוחד עם היד הדומיננטית כדי למשוך בעדינות את הראש משאר הגוף.

השליכו את הגוף למעבדה נגבו עם היד הלא דומיננטית והשתמשו ביד הדומיננטית כדי להחזיק את הראש כנגד בסיס הבאר על ידי החוטם. השתמשו בשתי המלקחיים כדי לקלף כל אזור בקוטיקולה שבין העיניים, עד שהמוח נחשף, והסירו את כל רקמות העזר שנותרו מחוברות למוח. הכניסו את המוח הנקי לבאר השלישית ונתחו את המוח הבא כפי שהודגם עד לקבלת 15 מוחות, או עד שיחלפו פרק זמן מקסימלי של 30 דקות.

תקן את המוח עם 500 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ושטוף את המוח חמש פעמים עם PBS בתוספת טריטון, כפי שהודגם . מוחות בוגרים מוכנים כעת לדגירה ראשונית של נוגדנים. החליפו את השטיפה האחרונה בשתי טיפות של מדיום הרכבה בטוח פלואורסצנטי כדי להטביע את המוח, והוסיפו טיפה אחת של מדיום הרכבה למרכז שקופית מיקרוסקופ זכוכית חדשה.

השתמש במלקחיים כדי לתפוס כל מוח זחל על ידי חוט העצב הגחוני להעברה על המגלשה. כדי לדמיין אבות ונוירונים מהאזור המרכזי של מרכז ההתפשטות החיצוני, Lamina או פקק לובולה, ודא כי חוט העצב הגחוני מקרין החוצה על האונות, מקם את מוחות הזחל על המגלשה עם הצד הקדמי של הרקמה פונה כלפי מעלה. כדי לדמיין תאים השייכים לקצות מרכזי ההתפשטות החיצוניים או הפנימיים, ודא שחוט העצב הגחוני מקרין החוצה מתחת לאונות.

הניחו את מוחות הזחלים על המגלשה כשהצד האחורי של הרקמה פונה כלפי מעלה. כדי לדמיין את הסהר של נוירונים ממרכזי ההתפשטות הפנימיים והחיצוניים הן בציר הגחוני הגבי והן בציר הלטרלי המדיאלי, השתמש בזוג מלקחיים חדים או במחט טונגסטן כדי לפצל את אונות המוח למטה דרך חוט העצב הגחוני, החל מנקודת המחשוף בין האונות. כוונו מחדש כל אונה כאשר הצד הצידי פונה כלפי מעלה.

כאשר מוחות הזחלים מכוונים כראוי, הניחו טיפה קטנה של אמצעי הרכבה משני צדי המוח. הניחו החלקת כיסוי אחת על כל טיפה, והניחו החלקת כיסוי אחרונה על המוח, כך שהקצה הימני והשמאלי מונחים על שני החלקות הכיסוי האחרות, ויוצרים גשר החלקה. לאחר מכן השתמשי בלק כדי לאטום את הקצוות של גשר החלקת הכיסוי כדי לאבטח את המוח המותקן.

לאחר שטיפת הנוגדנים המשנית האחרונה, בצע שטיפה סופית עם 400 מיקרוליטר PBS. החלף את PBS בשלוש טיפות של מדיום הרכבה בטוח פלואורסצנטי כדי להטביע את המוח. הוסף טיפה של מדיית הרכבה לשליש השמאלי והימני של שקופית מיקרוסקופ זכוכית.

הניחו החלקת כיסוי מעל כל טיפה כדי לבנות גשר החלקה לכיסוי. אטמו את הקצוות החיצוניים של הכריכה הימנית, החליקו בלק והוסיפו טיפה אחת של מדיית הרכבה בין החלקות הכיסוי. באמצעות מלקחיים, העבירו בעדינות את המוח למגלשה בזהירות יתרה כדי למנוע פגיעה באונות הראייה.

כדי לדמיין את גופי התא של נוירוני הלמינה והמדולה, השתמש במחט טונגסטן כדי לכוון את המוח במצב קדמי עם אונות האנטנה הבולטות כלפי חוץ. כדי לדמיין נוירונים של קומפלקס לובולה, לכוון את המוח האחורי עם אונות אנטנה פונה כלפי מטה נגד מיקום החלקה. כדי לדמיין את כל הנוירואישונים של האונה האופטית במישור אחד, כוונו את המוחות במצב אופקי, סדרו את המוחות בתושבת קדמית, ואז השתמשו במחט טונגסטן כדי לסובב כל מוח ב-90 מעלות כלפי מעלה כך שהוא יושב על הצד הגחוני שלו, מונח על קצה החלקת הכיסוי.

כאשר המוחות הבוגרים מכוונים כראוי, הניחו את החלקת הכיסוי האחרונה מעל המוחות כך שהקצה הימני והשמאלי יחפפו לשני החלקות הכיסוי האחרות כדי ליצור גשר, אטמו את המגלשה עם לק. הנה תמונה של אונה אופטית זחל בכיוון הרכבה קדמית. בכיוון ההרכבה הקדמי, האפיתל של מרכז ההתפשטות המרכזי בקול רם יותר, נוירובלסט מדולה ונוירוני למינה מופיעים על פני השטח כרצועות של תאים העוטפות את המוח.

עמוק יותר לתוך המוח, באמצע ערימת Z, ניתן לראות את האפיתל הראשי של מרכז ההתפשטות החיצוני ואת הנוירובלסט והנוירונים המתאימים לו. בנוסף, האפיתל של מרכז ההתפשטות הפנימי והנוירונים של תקע הלובולה נראים בפרוסות ביניים אלה. פרוסות Z העמוקות ביותר מתארות את הצד השני של המוח, היכן שממוקמים הקצוות האחוריים של מרכז ההתפשטות החיצוני.

הקצה השטחי של מרכז ההתפשטות הפנימי נוכח גם הוא. שימו לב שאלה יהיו המבנים הראשונים הנראים לעין אם האונה האופטית תורכב אחורית. הנה תמונה מאונה אופטית המותקנת על צידה.

על פני השטח של הר לרוחב סהר למינה גלוי וסהר תקע לובולה ממוקם בין זרועותיו. הסהר העצבי של מדולה מופיע במיקום Z מעט עמוק יותר. הנה תמונה של אונה אופטית בוגרת רכובה בכיוון קדמי.

מכיוון שהמדולה ממוקמת על פני השטח של ההר הקדמי, קליפת המוח של המדולה נראית מיד. גופי תאים בקליפת המוח משליכים את הארבוריזציה שלהם לתוך הנוירופיל, אשר ניתן לדמיין בעמדת ביניים Z. הלובולה מופיעה גם ברמה זו, מכוונת בניצב למדולה.

במיקום Z העמוק ביותר, הנוירופיל הסופי של האונה האופטית, לוחית הלובולה גלויה. שימו לב שלוח הלובולה יהיה המבנה הראשון הנראה בתושבת אחורית. הנה תמונה של אונה אופטית בוגרת רכובה בכיוון אופקי.

כאשר המוח הופך 90 מעלות על צדו למצב אופקי, כל הנוירופישונים וקליפת המוח של האונה האופטית נראים במישור אחד. בעת ביצוע פרוטוקול זה, הדבר החשוב ביותר לזכור הוא לשמור על רקמת המוח שקועה בתמיסה לאורך כל הפרוטוקול. אם המוח נחשף לאוויר, איכות הכתם, ולכן, התמונות הסופיות יופחתו באופן משמעותי.

הבנה של האופן שבו כיוון ההרכבה משפיע על הדמיית האונה האופטית חשובה להדמיה חיה. ניתן לגדל בתרבית ולדמיין מוחות של זחלים ובוגרים במשך מספר ימים כדי לעקוב אחר חלוקות תאים או שינויים במורפולוגיה שלכם. כאן, כיוון ההרכבה הוא קריטי, מכיוון שסוגי התאים המעניינים חייבים להיות קרובים לחלקת הכיסוי לזיהוי אופטימלי של האות הפלואורסצנטי in vivo.