Gostaríamos de agradecer Changhui Pak e Jeferson Vrailas Mortimer inicialmente ensinando SMK a técnica de dissecação do cérebro. Agradecemos também a membros do grupo de Ken Moberg laboratório, especialmente Chris rodadas, para ler criticamente o manuscrito. Anticorpos reconhecendo Fas2 (1 4) e chaoptin (24B10) foram obtidos a partir do banco de hibridoma de estudos do desenvolvimento. Anticorpo 24B10 foi depositado para o DSHB por Seymour Benzer e Nansi Colley24,60,,61, anticorpo 1 4 foi depositado para o DSHB por Corey Goodman 22,23,56. Estoques de moscas foram obtidos a partir do centro de estoque de Bloomington. Gostaríamos também de agradecer a Ohio agrícola centro de pesquisa e desenvolvimento centro (OARDC) MCIC Imaging para uso do microscópio confocal a imagem do cérebro na figura 4A e B. SMK é suportado por um fundo de FORMULADORES (1 R15 HD084241-01A1).

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

O método de dissecação e visualização descrito acima pode ser usado em uma ampla variedade de imunocoloração e vive aplicativos de imagem. Nós esboçamos um protocolo geral imunocoloração e evidenciaram uma maneira em que MARCM pode ser usado para visualizar axonal morfologia de neurônios individuais corpo cogumelo. Além disso, estes procedimentos gerais também podem ser usados para outras regiões do cérebro em fixo de imagem ou adulto recém dissecado cérebros48,65. Imagem ao vivo pode fornecer uma abordagem mais eficiente quando analisar padrões de expressão de armadilhas potenciador, genes repórter ou imitar linhas66, por exemplo. Para evitar a captura artefatos de morte celular durante a imagem latente ao vivo de GFP em tecido não fixado, cérebro deve ser dissecado em 1 x fosfato tamponado salino (PBS) ou HL3 mídia48, montado em lâminas de ponte em 1X PBS (ou HL3) e fotografado em menos de 15-20 min. cuidados também deve ser tomado para remover tanto a traqueia quanto possível do cérebro dissecado antes da imagem latente, uma vez que isso pode interferir na visualização da fluorescência de GFP.
Enquanto a coloração condições para avaliar a morfologia de neurônios corpo e fotoreceptor cogumelos são relativamente bem estabelecidos24,61,67, a localização de uma proteína específica de interesse destas células tipos podem exigir extensa de solução de problemas e otimização. Em particular, várias etapas críticas, incluindo diluição de anticorpo, bloqueio reserva componente concentração e fixação, devem ser otimizadas para gerar os resultados mais reprodutíveis e confiáveis. Em primeiro lugar, deve ser determinada a concentração ideal do anticorpo primário. Embora anticorpos comercialmente disponíveis têm frequentemente uma diluição sugerida (e muitas vezes inicialmente começamos usando essa concentração), esses valores raramente são determinados empiricamente sobre os tecidos da drosófila . Portanto, testando uma série de diluições de anticorpo primário que escala acima e abaixo a sugestão inicial do fabricante muitas vezes resulta em coloração mais específico. Enquanto a diluição do anticorpo primário pode ter um efeito significativo na coloração de precisão e deve ser precisamente determinada, o cérebro de tempo é incubado no anticorpo primário contendo soluções podem variar consideravelmente com pouco efeito sobre o resultado geral. Por exemplo, observamos resultados semelhantes quando incubando dissecou cérebros com o anticorpo primário do anticorpo Fas2 para dois, três, ou quatro dias a 4 ° C. Embora recomendamos pelo menos duas noites, temos também incubados cérebros em solução de anticorpo primário por uma noite e obteve coloração reprodutíveis. Importante, limitando a quantidade de tempo que cérebros são incubados no anticorpo secundário para 3h em temperatura ambiente (ou uma noite a 4 ° C) ajuda limite inespecificas de anticorpos secundários ao tecido cerebral.
Em segundo lugar, pode ser necessário usar reagentes adicionais de "bloqueio" para eliminar o sinal de fundo indesejado. Opções incluem o aumento da concentração de NGS para ~ 10%, a adição de 1-10% albumina de soro bovino (BSA) para o bloqueio e primário/secundário soluções do anticorpo ou pre-adsorção de anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, com embriões da drosófila (ver referência68, seção 2.9, passo 3).
Enquanto escrevemos o protocolo acima usando PTN como o buffer sugerido para a fixação de todas, a lavagem e as etapas de incubação do anticorpo, fixação de tecidos em outros buffers (como PLP e PEM, listados na Tabela de materiais) pode resultar em profundas diferenças em a força do sinal. Por exemplo, estudos anteriores demonstraram que Cyclin E é indetectável em discos imaginária larvas, quando os tecidos são fixos no tradicional paraformaldeído 4%, diluído em PBS, mas é claramente visível quando os tecidos são fixos no buffer PLP (Ken Moberg, pessoal comunicação e referência69). Além das alterações no buffer de componentes, alterando o tempo e a temperatura, para fixação de tecido pode afetar também significativamente imunofluorescência mancha e pode ser determinados empiricamente, se necessário. Geralmente, tempo de fixação deve ser tempo suficiente para permitir a reticulação suficiente de componentes celulares, e a manutenção a longo prazo da morfologia geral celular estando limitado o suficiente para impedir over-reticulação e "enterrar" de epitopos de proteína. Portanto, quando inicialmente otimizando coloração condições para um anticorpo primário recém-adquiridas, geralmente limitar o tempo de fixação de aproximadamente 20 min e muitas vezes irá corrigir os tecidos em temperaturas mais frias.
Vários controles devem ser incluídos em qualquer experimento de imunofluorescência para investigar a especificidade dos anticorpos primários e secundários, bem como o efeito de transgenes/genético sobre o fenótipo observado. Para verificar se o anticorpo primário sendo usado especificamente reconhece a proteína de interesse, tecido de moscas falta desta proteína ou tecido superexpressão da proteína deve ser incluído como controles. A adição de proteína antígeno purificado em excesso também pode ser incluída para determinar se o anticorpo primário reconhece outros resumos no cérebro voar. Finalmente, qualquer sinal fluorescente presente quando os anticorpos primários são omitidos representa o nível de ligação não-específica pelos anticorpos secundários selecionados.
Vários controles importantes também devem ser incluídos para avaliar a contribuição do fundo genético ou a presença de transgenes para coloração de intensidade ou morfologia neuronal. Por exemplo, as moscas usadas no experimento MARCM na Figura 5 contêm múltiplos transgenes (hsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, banheira &#62; GAL80 e OK107-GAL4), cada um dos quais deve ser analisado separadamente para efeitos na morfologia do corpo cogumelo. Em uma morfologia muito mínimo, cogumelo corpo de moscas contendo OK107-GAL4 e UAS-CD8-GFP deve ser analisada. Também pode ser necessário avaliar o efeito do choque térmico e produção de recombinase Flp no desenvolvimento do cogumelo corpo analisando voa contendo hsFLP e FRT82B. Embora MARCM pode fornecer informações sobre significativo se uma proteína dada forma autônoma controla a orientação axonal, o número de controles necessários para fazer com precisão esta conclusão pode ser uma limitação menor desta técnica. Em experiências menos complicadas, controles similares também são aplicáveis. Por exemplo, tome um experimento onde o sistema de GAL4/UAS está sendo usado em combinação com um transgene RNAi para "knockdown" expressão de uma proteína de interesse em todos os neurônios. Neste experimento, pelo menos dois transgenes estará presentes: um driver de GAL4 pan-neuronal, como DrosÃ-GAL4 e o transgene UAS-RNAi . A morfologia de neurônios do corpo cogumelo em moscas, contendo cada uma destas transgenes sozinhos deve ser investigada para além da condição experimental onde moscas abrigam ambos os transgenes na mosca da mesma.
Finalmente, para determinar se a proteína de interesse é expressa em neurônios do corpo cogumelo é geralmente necessário cérebros co mancha com anticorpos para Fas2. Alternativamente, proteínas fluorescentes, tais como a GFP, RFP ou a membrana vinculado CD8-GFP também podem ser expressas usando o sistema de GAL4/UAS e usado em combinação com anticorpos reconhecendo a proteína de interesse. Desde que Fas2 só reconhece os fasciculado axônios que formam os lóbulos de cogumelo corpo α e β, o uso de GAL4-driven, membrana-limite CD8-GFP tem sido particularmente útil para a marcação de cogumelo corpo neurônios.
Defeitos na orientação axonal muitas vezes não são 100% penetrante e até mesmo o cérebro com o mesmo genótipo pode mostrar alguma variabilidade. Portanto, quando analisando recém gerado alelos mutantes para defeitos no corpo cogumelo ou pathfinding fotoreceptor, deve ser utilizada uma combinação de abordagens e diferentes alelos. A maioria dos estudos na literatura usar várias abordagens diferentes para investigar se uma proteína desempenha um papel célula autónomos em controlar a orientação axonal: eu) análise de pathfinding defeitos em homozigotos moscas nulos (de preferência usando diferente nualelos de ll), ii) análise de pathfinding defeitos em moscas falta da proteína de interesse somente nos neurônios (geralmente via RNAi), iii) análise MARCM de pathfinding defeitos e iv) resgatar experiências onde o gene é re-expressado nos neurônios homozigotos NULL moscas. Idealmente, várias dezenas de cérebros por genótipo devem ser analisados para defeitos na morfologia neuronal.
Embora o protocolo descrito aqui centra-se principalmente na imunofluorescência localização das proteínas dentro do tecido fixo, várias aplicações futuras desta técnica estão sendo desenvolvidas para o tecido do cérebro ao vivo de imagem. Uma vez que os cérebros são dissecados (geralmente em meios de cultura de células), então podem ser cultivadas durante vários dias a 25 ° C. Esses ex vivo métodos de cultivo estão sendo desenvolvidos a fim de investigar uma ampla variedade de processos biológicos, tais como a atividade de proteína que promove a regeneração do axônio após lesão70,71, intracelular sinalização dinâmica72e desenvolvimento neuronal73.

Embora o sistema nervoso de Drosophila é menor do que os seres humanos e roedores, sua complexidade fornece um modelo poderoso, acessível para entender melhor suas contrapartes de vertebrados. Em muitos casos, os genomas de vertebrados e moscas codificam proteínas muito similares que ditam os mecanismos do desenvolvimento do sistema nervoso. Na verdade, muitos dos genes necessários para desenvolvimento neuronal em vertebrados orthologs em moscas, incluindo aqueles envolveram nas vias de sinalização que controle a padronização, neurogênese e orientação axonal1,2,3 ,4,5. Por exemplo, netrin é um ligante necessário para orientação axonal em mamíferos e d. melanogaster6,7,8. Embora netrin foi originalmente isolado de tecido de cérebro embrionário garota6, estudos posteriores revelaram que netrin desempenha um papel conservado durante o desenvolvimento embrionário sistema nervoso central (CNS) em Drosophila8. Outros estudos têm usado telas genéticas no embrionário Drosophila CNS para identificar conservadas ligantes e receptores necessários para pathfinding em ambos Drosophila e vertebrados9.
Enquanto a mosca embrionária CNS tem sido amplamente utilizada no passado para identificar ligantes, receptores e proteínas de sinalização intracelulares obrigatório para orientação axonal8,9, trabalho recente investigou as maneiras em que muitos de Estas proteínas também controlam as decisões pathfinding durante os estágios posteriores de desenvolvimento. Especificamente, investigação do corpo cogumelo (MB) e desenvolvimento de neurônio fotorreceptoras da retina (Figura 1) forneceu insights sobre os mecanismos que controle pathfinding, formação de sinapse, poda de axônio e vários outros aspectos da neuronal desenvolvimento de10,11,12,13,14,15,16,17. Neurônios fotorreceptoras conectem a retina voar para regiões do cérebro adulto chamado a lâmina e medula e são crítico para veicular a informação visual ao cérebro (revisto por18,,19), enquanto os neurônios de cogumelo corpo são Centralmente localizado no cérebro voar e são necessários para aprendizagem e memória de20,21. Tanto os neurônios fotoreceptor e os neurônios intrínsecos dos corpos cogumelos, chamados células de Kenyon, utilizam mecanismos evolutivamente conservada contato-dependente e diffusible axonal orientação para encontrar os alvos pós-sinápticos. Além de ser visível em moscas adultas, fotorreceptoras e neurônios MB podem também ser diretamente visualizados em larvas e pupas com anticorpos ou repórter genes22,23,24,25. A capacidade de facilmente visualizar estes dois conjuntos de neurônios em pontos diferentes do desenvolvimento tempo promoveu sua utilização como excelentes modelos para muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.
Além de ser usado como um modelo para entender os mecanismos do desenvolvimento normal do sistema nervoso, estudos recentes têm demonstrado que moscas também podem servir como modelos precisos de uma grande variedade de doenças humanas, incluindo a síndrome de X frágil (FXS)26 , Deficiência intelectual (ID)27,28,29,30,31e outros32. Por exemplo, para estudar a função molecular de ZC3H14, um gene recentemente ligado à deficiência intelectual humana, criamos um modelo mosca de ID usando um alelo nulo da mosca ZC3H14 ortholog, chamado Nab230. Moscas, falta Nab2 têm deficiências graves de memória e estendidas caudas poli (a), sintetizando o que é observado em pacientes humanos ou paciente derivada de célula linhas33,34. Importante, moscas falta Nab2 também exibem defeitos de morfologia cerebral grave em seus corpos cogumelo adulto34, semelhante ao que é observado em moscas, falta o gene da síndrome FXS, FMR135. Assim, moscas podem servir como um organismo modelo importante para estudar tanto o desenvolvimento normal do cérebro e doenças que interrompem-lo.
Finalmente, a acessibilidade dos métodos de alto throughput para monitorar o comportamento, combinado com a vasta gama de ferramentas disponíveis e genéticas, fazer drosófila um organismo modelo de escolha para identificar as regiões do cérebro que controlam comportamentos complexos, tais como aprendizagem e memória, sono, namoro, sede e outros36,37,38,39. Uma ferramenta particularmente útil é o centro da "toolbox" mosca do geneticista é o sistema de GAL4/UAS (Figura 2). Este sistema de40,41 usa expressão específica de tecido do Gal4 ativador transcricional para aumentar a expressão de genes ou transgenes a jusante de um Upstream ativando sequência (UAS). Modificações deste sistema tem permitido aos pesquisadores, por exemplo, controlar com precisão a excitabilidade dos neurônios específicos42,43, overexpress ou batida para baixo genes específicos de interesse44, 45, analisar a dinâmica em tempo real de cálcio na vivo46e expressar genes repórter para marcar linhagens neuronal41. A combinação do sistema GAL4/UAS com recombinação mitótica também permitida a criação da análise de mosaico com um marcador de célula Repressible (MARCM) sistema12,47. MARCM tem sido amplamente utilizado no rastreamento único neurônio para identificar os componentes de sinalização celulares necessários para orientação axonal12,47. Embora estas e outras técnicas apresentaram uma série de informações valiosas sobre os mecanismos celulares necessários para o funcionamento do sistema nervoso, a maioria exige que o cérebro de Drosophila primeiro ser dissecado; remoção cuidadosa do cérebro é necessária para manter o cérebro correto padrões morfologia e conexão entre regiões do cérebro. O seguinte protocolo usa cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios comopopulações neuronal de exemplo como ela orienta a dissecação e cérebros de Drosophila imunofluorescência de coloração de adulto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microdissection forceps/tweezers</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>505-NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard dishes</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-50-S-BLK</td>
			<td>Available from amazon.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fas2 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chaoptin Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>24B10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Antibody</td>
			<td>Aves Lab</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488 goat anti-chicken secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa647 goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscope Services</td>
			<td>RT15713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>99-910-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-553-454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Phosphate Buffer monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na phosphate Buffer dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fingernail polish</td>
			<td>Electron Microscope Services (EMS)</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica S6D with KL300 LED light source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well dish (spot plate)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutator/rocker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-152 or 88-861-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-366-794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potential Fixation Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTN Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLP buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% paraformaldehyde, 0.01M NaI04, 0.075M Lysine, 0.037M NaPO4, pH 7.2, Dissolve 0.36 g lysine in 10 ml H2O + 7.5 ml 0.1 M NaH2PO4 pH 7.2 + 2.5 ml 0.1 M Na2HPO4 on ice. Immediately before use, mix 15 ml of this buffered lysine solution with 50 mg NaIO4 (sodium periodate) + 2ml of the 20% high grade paraformaldehyde (EMS) + 3ml H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1M PIPES pH 7.0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, This buffer can be conveniently made as a 2x stock and diluted with 8% paraformaldehyde (PFA) to give a final concentration of 4% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Stocks available from Bloomington</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elav (c155)-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL458</td>
			<td>Pan-neuronal GAL4 driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*;;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 854</td>
			<td>GAL4 driver for all mushroom body neurons (OK107-GAL4 insertion is on the 4th chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 7362</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64305</td>
			<td>GAL4 driver for alpha and beta lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; 201Y-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 4440</td>
			<td>GAL4 driver for primarily the gamma lobes of mushroom body (on 2nd chromosome)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 64296</td>
			<td>GAL4 driver for mushroom body gamma lobes, also contains UAS-CD8-GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&#62;Gal80/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5145</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL5146</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP, pan-neuronal GAL4, and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&#62;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44408</td>
			<td>MARCM stock for flipping 3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&#62;GAL80;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL44406</td>
			<td>MARCM stock for flipping 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*, hsFLP, tub&#62;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td>
			<td></td>
			<td>BL 44407</td>
			<td>MARCM stock for flipping X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 5137</td>
			<td>GFP labels cell surface (CD8 is a transmembrane protein)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td>
			<td></td>
			<td>BL 5139</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and CD8-GFP on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td>
			<td></td>
			<td>BL 28832</td>
			<td>MARCM stock, contains hsFLP and CD8-GFP on X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w*; FRTG13, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5140</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&#62;GAL80</td>
			<td></td>
			<td>BL 5135</td>
			<td>MARCM stock, contains FRT site and GAL80 on 3rd chromosome</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult drosophila melanogaster brains

Desenvolvimento de sistema nervoso envolve uma série sequencial de eventos que são coordenados por diversas vias de sinalização e redes reguladoras. Muitas das proteínas envolvidas nestes caminhos são conservadas evolutivamente entre mamíferos e outras eucariotas, como a mosca de fruta Drosophila melanogaster, sugerindo que princípios organizadores semelhantes existem durante o desenvolvimento destes organismos. Importante, Drosophila tem sido amplamente utilizado para identificar mecanismos celulares e moleculares que regulam processos que são necessários em mamíferos, incluindo a neurogênese, diferenciação, orientação axonal e sinaptogênese. Moscas também têm sido utilizadas com sucesso para modelar uma variedade de doenças do desenvolvimento neurológico humano. Aqui descrevemos um protocolo para o passo a passo microdissection, fixação e imunofluorescência localização das proteínas dentro do cérebro adulto de Drosophila . Este protocolo centra-se em duas populações neuronal de exemplo, os neurônios do corpo cogumelo e fotorreceptores da retina e inclui etapas opcionais para rastrear os neurônios individuais corpo cogumelo usando análise de mosaico com uma técnica de marcador de célula Repressible (MARCM). Dados de exemplo do tipo selvagem e mutantes cérebros são mostrados juntamente com uma breve descrição dos critérios de Pontuação para orientação axonal defeitos. Enquanto este protocolo destaca dois anticorpos bem estabelecidos para investigar a morfologia do corpo cogumelo e neurônios fotoreceptor, outras regiões do cérebro de Drosophila e a localização de proteínas dentro de outras regiões do cérebro também podem ser investigada utilizando este protocolo.

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Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

19.2K visualizações.  The College of Wooster. Este protocolo descreve a dissecção e imunocoloração de adultos Drosophila melanogaster tecidos do cérebro. Especificamente, este protocolo destaca o uso da Drosophila cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios como subconjuntos neuronal de exemplo que podem ser usados com precisão para descobrir princípios gerais subjacentes a muitos aspectos do desenvolvimento neuronal.

Vídeo: Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ensaiando populações de células do sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Biologia do Desenvolvimento

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Elevando a mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sob axênicas e gnotobióticos Condições

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissecção e cultura do rim embrionário do rato

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Ensaio para a integridade da barreira hematoencefálica na Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

Dissecção, imuno-histoquímica e montagem de cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

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Elevando a mosca da fruta

Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta