עבודה זו נתמכה ביוזמת גרלנד חזון, מכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית (CIRM; מענקים DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616, TG2-01151), קרן קהילתית ורמונט, קרן בארס, ו קרן הלחימה עיוורון וויין-Gund המחקר Translational האצת התוכנית.

1. הכנה של ריאגנטים עבור יום 0 14 יום של הפרוטוקול <ol><li>להכין בינוני הרכיבים הבאים: <ol><li>להפוך 100 מ של בידול ברשתית בינוני (RDM) על-ידי הוספת 1 מ"ל של 100 x N2 תוספת, 2 מ ל x B27 תוספת 50, ו 1 מ"ל של 100 x חומצת אמינו שאינן הכרחיות (NEAA) עד 96 מ"ל של Dulbecco &#39; s ששינה בינוני/מזין חיוני תערובת F12 9 (DMEM/F12).</li>
		<li>להפוך 10 מיליליטר nicotinamide 1 מ' (NIC) על ידי המסת g 1.221 של ה-NIC ב 8 מ של מים סטריליים, vortexing להביא את אמצעי האחסון 10 מ"ל מים סטריליים. סטרילי לסנן את הפתרון.</li>
	</ol></li> <li>להכין מולקולות קטנות וגורמי צמיחה הבאים: <ol><li>לשקם הראש העכבר רקומביננטי, מעכב מסלול איתות של האדם dickkopf ונ ט 1 (DKK-1), ו- IGF-1 עד 100 µg/מ"ל כל אחד ב- 0.1% אלבומין שור (BSA) בתמיסה באגירה פוספט (PBS). Aliquot כנדרש וחנות ב-20 ° C עד 3 חודשים.</li>
		<li>לשקם FGF-basic 10 µg/mL, רקומביננטי האדם/עכבר/עכברוש Activin A µg/מ ל כל אחד ב- 0.1% BSA ב- PBS. Aliquot כנדרש וחנות ב-80 מעלות צלזיוס עד 1 שנה.</li>
		<li>סו לשקם 5402 (FGF ספציפיים קולטן טירוזין קינאז מעכב) ו- CHIR99021 (גליקוגן סינתאז קינאז 3, GSK-3β, מעכב) ל 10 מ מ כל דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). Aliquot וחנות ב-20 ° C עד 1 שנה או 6 חודשים, בהתאמה.</li>
	</ol></li> <li>להשיג את הפריטים הבאים עבור יום 0 ו/או יום 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון (0.2 גרם EDTA לכל 1 ליטר ל- PBS), PBS X 1- / - (PBS ללא סידן או מגנזיום, pH 7.4), 1 x כמו טריפסין דיסוציאציה אנזים (TDE), DPBS (Dulbecco &#39; s PBS), RPE תמיכה בינונית (RSM), Y-27632 (שימוש ב- 10 מיקרומטר) dihydrochloride.</li>
</ol> 2. יום 0: יום של מעבר לתאי גזע Pluripotent עבור בידול <ol><li>לגדול מושבות תאי גזע בתנאים ללא מזין, ללא סרום כדי כ- 80% הנהרות לפני passaging. 
	הערה: ראה דיון לפרטים על אופטימיזציה שלב זה.</li>
	<li>מעיל צלחת 12-ובכן עם חוץ-תאית מבוססת-מטריקס הידרוג (ECMH) בהתאם להמלצות היצרן. מאפשרים להגדיר עבור 1 h בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>Aliquot כמות RDM ואת PBS- / - זקוק ליום 0 וחם באמבט מים עד 37 ° C לפני הוספת גורמי גדילה. להביא EDTA בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להוסיף את גורמי גדילה הדרושים ליום 0 RDM ומחוממת עם 10 מ מ NIC, 50 ng/mL הראש, 10 ng/mL DKK-1, ו- 10 ננוגרם למ"ל IGF-1. מן המניות שמתואר בשלב 1.2, להוסיף 100 µL-nic, 5 µl של הראש, µL 1 של DKK-1 ו- 1 µL של IGF-1 עד 10 מ"ל של RDM.</li>
	<li>לבחור להסיר את כל מושבות הבדיל בהתבסס על מורפולוגיה מתאי גזע כי passaged עבור בידול. השתמש טיפ pipet P10 כדי להסיר באופן ידני את התאים הבדיל. 
	הערה: תאים Fibroblastic בין מושבות, כמו גם את התאים האטומים בתוך המושבות לציין תאים יוסרו. ראה דיון לקבלת פרטים אודות תאים.</li>
	<li>בקטע טוב יחיד של צלחת 6-ובכן לתוך בארות 4 של צלחת 12-טוב (1:4). 
	הערה: ראה דיון לפרטים על passaging תאי גזע בשלב זה.
	<ol><li>תשאף המדיום תאי גזע מתאי גזע. ולשטוף את הבארות פעם אחת עם 2 מ של PBS מראש ומחוממת- / --</li>
		<li>תשאף PBS- / - ולאחר מכן לשטוף כל שלוש פעמים עם 1 מ"ל של EDTA לכל טוב של צלחת 6-ובכן.</li>
		<li>בעדינות להטות את הצלחת, וארוקן את EDTA. לא להתסיס את הצלחת בכל דרך להימנע בטרם עת מרימים את התאים.</li>
		<li>לאחר לשטוף את השלישי, להוסיף 1 מ"ל של EDTA, דגירה בטמפרטורת החדר בשכונה למשך 3-5 דקות. נא לא להפריע את הצלחת במהלך הדגירה הזה.</li>
		<li>וארוקן את EDTA ולהוסיף 1 מ"ל של RDM לכל זה להיות נזרע עם 0.5 מיליליטר בינונית נוספת. לדוגמה, לשטוף 1 טוב של צלחת 6-ובכן עם 4.5 מ ל RDM לצלחת על 4 בארות של צלחת 12-ובכן.</li>
		<li>להשתמש במגרדת תא לנתק בעדינות את התאים. לאסוף את כל התאים צינור חרוטי, triturate התאים RDM על-ידי pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים. מביצועם גושים גדולים של תאים, אך לא triturate אל תא בודד ההשעיה. להפיץ את התאים בשכבה אחידה pipet. להשלים שלב זה במהירות כדי למנוע reattachment לצלחת.</li>
		<li>זרע תאים על לוחות 12-ובכן מצופים ECM (1 מ"ל של השעיה תא לכל באר).</li>
		<li>להטות את הצלחת אחורה וקדימה להפיץ את התאים באופן שווה לאורך כל הבארות. הנח בעדינות בתוך חממה תרבות תא-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 עד בינוני השינוי הבא.</li>
		<li>שימו לב הזמן המדויק. שינוי בינוני באותו זמן בכל יום.</li>
	</ol></li></ol> 3. יום 1-14: תוספת של גורמי גדילה <ol><li>יום 1: לשנות את המדיום על כל בארות (1 מ"ל לכל טוב) באמצעות RDM עם ההרכב פקטורי גדילה ליום 0 (ראה שלב 2.4).</li>
	<li>יום 2: לשנות את המדיום באמצעות RDM (1 מ"ל לכל טוב) עם 10 מ מ NIC, 5 ננוגרם למ"ל FGF-basic, הראש ng/mL 10, 10 ננוגרם למ"ל DKK-1 ו- 10 ננוגרם למ"ל IGF-1. מן המניות שמתואר בשלב 1.2, להוסיף 100 µL של ה-NIC, 5 µL של FGF-basic, 1 µL של הראש, 1 µL של DKK1 µL 1 של IGF1 10 מ"ל של RDM.</li>
	<li>יום 4: לשנות את המדיום באמצעות RDM (1 מ"ל לכל טוב) עם 100 ננוגרם למ"ל activin A, 10 ננוגרם למ"ל DKK-1 ו- 10 ננוגרם למ"ל IGF-1. מן המניות שמתואר בשלב 1.2, להוסיף 10 µL של activin A, 1 µL של DKK1 ו- µL 1 של IGF-1 ל- 10 מ"ל של RDM. 
	הערה: שימו לב כי תאים הם confluent בשלב זה.</li>
	<li>יום 6: שינוי המדיום באמצעות RDM (1 מ"ל לכל טוב) עם 100 ננוגרם למ"ל activin A ו- 10 מיקרומטר סו 5402. מן המניות שמתואר בשלב 1.2, להוסיף 10 µL של activin A ו 10 µL של סו 5402 10 מיליליטר RDM.</li>
	<li>ימים 8, 10 ו- 12: לשנות את המדיום באמצעות RDM (1 מ"ל לכל טוב) עם 100 ננוגרם למ"ל activin A, 10 מיקרומטר סו 5402 מיקרומטר 3 CHIR99021. מן המניות שמתואר בשלב 1.2, להוסיף 10 µL של activin A, µL 10 של סו 5402 ו- 3 µL של CHIR99021 10 מ"ל של RDM.</li>
</ol> 4. יום של העשרה עד חלוף RPE 0 <ol><li>מעיל צלחת 6-ובכן בפקטור גדילה מופחת ECMH בהתאם להמלצות היצרן. מאפשרים להגדיר עבור 1 h בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>Aliquot את עוצמת הקול של DPBS צריך ו 1 מ"ל של RDM לכל טוב של העשרה וחמים באמבט מים כדי 37 ° C. הביאו TDE בטמפרטורת החדר וחמים הצורך באמצעי אחסון של RSM, ריאגנט מיקרוביאלית ו Y-27632 ל 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הוספת ריאגנט מיקרוביאלית, Y-27632 קבלת 0.5 x ו- 10 מיקרומטר בקומפוזיציות בהתאמה RSM. להשתמש בינוני במשך הימים הראשונים 4-7 כדי לשפר את הקובץ המצורף.</li>
	<li>וביופסיה בינוני בילה כל בארות ולהוסיף 1 מ"ל לכל טוב של RDM ומחוממת מראש (אין צורך גורמי גדילה).</li>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ ויבתר, לנתח באופן ידני, לגרד משם כל התאים הלא-RPE באמצעות טיפ pipet P10. 
	הערה: עיין בסעיף התוצאות נציג דוגמאות.</li>
	<li>לאחר ניתוח, תשאף RDM וסלולרי כל פסולת. תשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של DPBS מראש ומחוממת לכל טוב.</li>
	<li>להוסיף 0.5 מיליליטר TDE לכל טוב של צלחת 12-ובכן, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להשתמש במגרדת התא כדי להסיר בעדינות את התאים מהצלחת. השתמש pipet P1000 כדי בעדינות triturate התליה תא/TDE על-ידי pipetting למעלה ולמטה 3 - 4 פעמים כדי ליצור השעיה אחיד.</li>
	<li>לדלל התליה תא/TDE 1:10 ב RSM ומחוממת מראש, בלי Y-27632. צנטריפוגה תא ההשעיה-g x 173 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>תשאף האמצעי בגדר תא, resuspend התאים RSM עם 10 מיקרומטר Y-27632 (1 מ"ל לכל מועשר היטב).</li>
	<li>זן התאים באמצעות מסננת תא רשת ניילון עם 40 µm נקבוביות. לספור את מספר התאים באמצעי אחסון שצוין באמצעות hemocytometer ולחשב את הריכוז של תאים בהפתרון מאומצות.</li>
	<li>תאי זרע על הגורם צמיחה מופחתת צלחות מצופה ECM-עונה 1 פרק 10 5 תאים/cm 2 ב 4 מיליליטר RSM עם 10 מיקרומטר Y-27632.</li>
	<li>להחליף את RSM 10 מיקרומטר Y-27632 48 שעות לאחר זריעה תא ולהמשיך להחליף מדיה כל 3-4 ימים (למשל בימי שני וחמישי). לא יחליפו את 10 מיקרומטר Y-27632 לאחר 4-7 ימים-</li>
	<li>מאפשרים לתאים בוגרים 28 עד 35 ימים-CO 37 ° C ו- 5% 2. להמשיך להחליף את RSM כל 3-4 ימים (למשל בימי שני וחמישי).</li>
</ol> 5. ההבשלה: המעבר 1 ו- 2 RPE הערה: אמצעי אחסון מצוינים עבור 1 טוב של צלחת 6-ובכן או בקבוקון T75 כמצוין על-ידי סוגריים.
<ol><li>בין יום 28 עד 35 מעבר 0, מעיל 6-ובכן צלחת (T75 הבקבוק) עם ECMH לפי המלצות היצרן.</li>
	<li>Aliquot עוצמת הקול של DPBS ו- RSM הדרושים וחם באמבט מים כדי 37 ° ג TDE להביא לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>וביופסיה בילה בינונית בארות, לשטוף היטב פעמיים עם 2 מיליליטר (מ"ל) מראש ומחוממת DPBS. 
	הערה: אין להשתמש 10 מיקרומטר Y-27632.</li>
	<li>DPBS תשאף ולהוסיף 1 מ"ל (5 מ ל) של TDE. מקום חממה ב CO של 37 ° C ו- 5%-2 למשך 5 דקות. לאחר דגירה, תצוגה תאים במיקרוסקופ הפוך כדי לאשר את התאים הם קבלנות וניתוק.</li>
	<li>בעדינות באמצעות המגרד של תאים בגודל מתאים, להסיר התאים לתחתית הבאר או הבקבוק.</li>
	<li>השתמש טיפ P1000 (10 מ"ל סרולוגית pipet) כדי בעדינות triturate התליה תא/TDE למעלה ולמטה 3 - 4 פעמים כדי ליצור השעיה אחיד.</li>
	<li>לדלל תא ההשעיה 1:10 ב RSM. להזמין 2 מ"ל (5 מ ל) של RSM כדי לשטוף את הבקבוק/היטב ולהוסיף התליה תא מדולל. 
	הערה: אל תאפשר זמן החשיפה אנזים לחרוג מינימלית 25</li>
	<li>Centrifuge התליה תא ב g x 173 למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>האחות האמצעי בגדר תא, resuspend תאי 1 מ"ל (5 מ ל) של RSM</li>
	<li>זן התאים באמצעות מסננת תא רשת ניילון עם 40 µm נקבוביות. לספור את מספר התאים באמצעי אחסון שצוין באמצעות hemocytometer ולחשב את הריכוז של תאים בהפתרון מאומצות.</li>
	<li>זרע תאים על הלוחות מצופים ECMH-עונה 1 פרק 10 5 תאים/cm 2 ב 4 מ ל (15 מ ל) של RSM.</li>
	<li>לאפשר את התאים להבשיל במשך 30 יום. להמשיך לשנות את RSM כל 3-4 ימים.</li>
	<li>חוזר את ההליך הנ ל (שלב 5.2-5.11) ביום 30 כדי מעבר תאים מן המעבר 1-2-</li>
</ol> 6. יצירה של הבנק תא ביניים: הקפאה קריוגנית של המעבר 2 יום 3-5 RPE הערה: Cryopreserve תאים בזמן שהם נמצאים subconfluent (~ 50%) לא המלווה אותם פיגמנט.
<ol><li>בהתבסס על מספר התאים, לחשב את עוצמת הקול של הקפאה קריוגנית בינוני עם 10% דימתיל סולפוקסיד צריך resuspend את התאים-ריכוז של 3 x 10 6 תאים למ"ל.</li>
	<li>השלבים הבאים 5.2 ל 5.8. Resuspend בגדר תא במדיום הקפאה קריוגנית עם 10% דימתיל סולפוקסיד 3 x 10 6 תאים/מ ל ולהעביר 1 מ"ל של התליה תא בקבוקונים קריוגני 1.2 מ ל.</li>
	<li>מניחים צלוחיות קריוגני במיכל ההקפאה שנועדה מגניב ב-1 ° C/דקה ומניחים ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. להעביר חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך- 
	הערה: תאים אלה יהיה מעבר 3 על מפשיר. התרבות התאים עוד 30 יום לפני אפיון. זרעים המעבר RPE 3-1.5 x 10 הוא 5 ס מ 2 על מפשיר. 2 , 4 , 6 , 7</li></ol>

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Making+Stem+Cells+Retinal:+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+With+Ocular+Disease.">Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+Stem+Cell-Based+Therapies+in+Combination+with+Substrate+for+the+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration.">Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).</li><li>Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium.">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li><li>Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Pigment+Epithelial+Cells:+Development+In+Vivo+and+Derivation+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+In+Vitro+for+Treatment+of+Age-Related+Macular+Degeneration.">Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration.</a> Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).</li><li>Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical/&#946;-catenin+Wnt+pathway+activation+improves+retinal+pigmented+epithelium+derivation+from+human+embryonic+stem+cells.">Canonical/&#946;-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+culture+of+human+embryonic+stem+cells+and+xeno-free+derivation+of+retinal+pigmented+epithelial+cells+on+a+novel,+synthetic+substrate.">Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate.</a> Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).</li><li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium:+A+Comparative+Study+Between+Cell+Lines+and+Differentiation+Methods.">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).</li><li>Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells.">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).</li><li>Choudhary, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+Toward+Retinal+Pigment+Epithelium+Lineage.">Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage.</a> Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).</li><li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-directed,+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li><li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+efficient+retinal+pigment+epithelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+spontaneous+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells.</a> J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).</li><li>Kent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+Maintenance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells.</a> J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).</li><li>Croze, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+Inhibition+Extends+Passage+of+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigmented+Epithelium.">ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium.</a> Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).</li></ol>

ד ר קלג הוא שותף ומייסד משובי תיקון טכנולוגיות בע מ.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע pluripotent. השיטה הייתה אופטימיזציה באמצעות שני האדם עובריים ו המושרה גזע pluripotent מכל שיטה ללא מזין, סרום ללא תרבות. מאז הבידוד הראשונית של תאי גזע עובריים בשנת 1998 ההטיה של תאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) ב- 2007, שפע של התרבות תאי גזע שיטות כבר פיתח14,15,16, 17. שיטות אלה אמורה להספיק לייצור תאי גזע המושבות כי הם רגישים שונות זו. ישנם ללא המגבלות המוכרות את הישימות של שיטה זו לתאי גזע pluripotent נגזר ומתוחזק כראוי.
השלבים הקריטיים ביותר הם passaging של תאי גזע ליום 0 של בידול (שלב 2.5) והצורך פוטנציאליים לנתיחה ידנית ביום 14 של התהליך (שלב 4.5). כאשר בוחרים כדי להסיר תאים מן המושבות תאי גזע, עיין התמונות בקנט18. כמצוין, התאים fibroblastic בין מושבות תאים אטומים בתוך המושבות לציין תאים זה צורך להסיר לפני תחילת פרוטוקול זה18. צריך להיות passaged מושבות מובחן, אציקלוביר רק עם קצוות מוגדרים עבור בידול.
מספר תאי גזע נזרע לכל טוב (שלב 2.6.7), זה מורכב על ידי העובדה כי תאי גזע לא יכול להיות triturated להשעיה תא בודד על המעבר לא במדויק ולעמוד על שימוש של hemocytometer. קירוב של תאי גזע confluent 80% הוא הצביע עבור 1 passaging טוב של צלחת 6-ובכן לתוך בארות 4 של צלחת 12-. טוב. ההבדלים בין שורות תאי הגזע, כגון קצב צמיחה, יכול להשפיע על מה מהר ילדותי RPE להגיע למפגש בין 0 עד 4 ימים. תאי גזע יפיקו RPE בין הנהרות מדויק, אבל התשואה תא יושפעו באופן שלילי אם התאים נמצאים דליל מדי בשלב זה. תאי RPE ילדותי צריך להיות כ- 40-50% confluent על יום 1, כמעט 100% confluent על ידי יום 4. אם התאים לא מייצרים טפט confluent ביום 4 או 6, הפרוטוקול יש לחזור על צפיפות גבוהה יותר זריעה ביום 0. לדוגמה, אם 1 טוב של צלחת 6-ובכן היה passaged ל 4 בארות של צלחת 12-ובכן ביום 0 ילדותי RPE אינם 100% confluent-יום ד', להפחית את seeding כדי קטע 1:3 או 1:2 ביום 0 או לאפשר את תאי הגזע להיות יותר confluent לפני passaging. חיוני להקים צפיפות זריעה עקבית בעת השוואה בין שורות תאים מרובים.
השלב חיתוך ידני ביום 14 נחוץ רק כאשר תאי RPE שאינם קיימים בתרבות (איור 2C). מאז התוספת של CHIR99021 לפרוטוקול, שורות רבות של תאי גזע pluripotent דורשים הקטן לנתיחה ידנית ללא. כמה הכנות יש שכיחות גבוהה יותר של מדבקות עצבית וזה קריטי כדי להסיר תאים אלה. אם RPE אינם קיימא-מעבר 0 דרך המעבר 3, זה אפשרי לחזור על פרוטוקול בידול לוקח זמן מספיק כדי להסיר את כל התאים הלא-RPE. זה לא קורה לעתים קרובות, אבל זה הזכיר כאן לציין כי הצעד לנתיחה ביום 14 ניתן למטב בעת הצורך.
ישנם מגוון של פרוטוקולים של בידול RPE נבדלים עלות, כמו גם שיטות, יעילות, כימות, הערכה תפקודית, שהאחרון שבהם היה נבדקו ביסודיות2. אנו מעדיפים את השיטה 14 יום מפורט כאן בגלל היעילות שלה, הסתגלות, ישימות למגוון רחב של התא קווים4,7,8. הצעד הקפאה קריוגנית פרוטוקול זה מספק גם יתרון גדול ביצירת של הבנק תא ביניים לשימוש עתידי, הימנעות ולשונות רבות-אל-הרבה בניסויים. החל מ- 4 בארות של צלחת 12-. ובכן, זה אפשרי להרחיב לתוך צלחות 6-ובכן-המעבר 0, מבחנות T75-קטע 1 ו- 2. -מעבר 2 יום 3-5, כאשר התאים עדיין subconfluent, לא המלווה אותם פיגמנט, זה אפשרי cryopreserve עשרות מיליוני תאים ולאחר מכן להפשיר את RPE בוגרת, איזור המעבר 3 יום 30, כדי לבדוק ביטוי RNA, ביטוי חלבונים, גורם גידול הפרשת, phagocytosis, וכו '. הקמנו גם פרוטוקולים להרחיב RPE עבור עד 13 קטעים 19.
. מצפה בקוצר רוח, שיטה זו יהיה שימושי עבור iPSC מידול של מחלה עינית, דור של RPE לתרפיה תאית. לגבי מידול המחלה iPSC, פרוטוקול זה כיום משמש במעבדה כדי לייצר RPE משורות CRISPR-מתוקן עם פקדים שאינם תוקנו מן המטופל באותו. יתר על כן, הפרוטוקול לסגלה סובסטרטים סינתטי ועל תנאים נטול קסנו שימושיים עבור שמירה על שיטות הייצור טוב נדרש טיפול הסלולר.

אפיתל הפיגמנט ברשתית הוא טפט של תאי פיגמנט מספק תמיכה מכרעת עבור photoreceptors. בתאי אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) יש פונקציות רבות בחיזיון, לרבות קליטת האור, תחבורה מזין, יון, retinoid רכיבה על אופניים, קולט אור phagocytosis קטע החיצוני, ואת הגידול גורם הפרשת1. ישנם מגוון של dystrophies ברשתית המשפיעות על הפונקציה RPE ולהוביל לאובדן הראייה, כולל הקשורות לגיל ניוון מקולרי, רטיניטיס פיגמנטוזה. דור של RPE מתאי גזע pluripotent עשוי להקל על מחקר כדי להבין את אלה מחלות עיניים, והוא יכול לספק מקור מוגבל של RPE עבור טיפולים תא2. למעשה, מחקרים קליניים מרובים לדרך משתמש RPE שמקורם בתאי גזע pluripotent3.
פרוטוקול בידול זה תוארה לראשונה על ידי בוכהולץ4 , התבססה על שיטת שפורסמו בעבר קלג5. ההליך מחקה נורמלי ויוו התהליך ההתפתחותי לכוון תאי גזע pluripotent מובחן לקראת גורל RPE באמצעות מניפולציה של גורמי גדילה אינסולין (IGF), בסיסי פיברובלסט גורם גידול (FGF-2; FGF-basic), הפיכת גורם הגדילה בטא (TGF-β), וחגיגת מסלולים4,5. הפרוטוקול היה משופר באופן משמעותי על ידי תוספת של אגוניסט מסלול ונ ט מאוחר בפרוטוקול, אשר הניב 97.77% ± 0.1% חלבון (PMEL) טרום-melanosome תאים חיוביים, הותאם ל תנאים נטול קסנו6,7. RPE וכתוצאה מכך הוכחו אקספרס RPE סמני ברמות התעתיק וחלבון, מפרישים גורמי גדילה RPE ידוע עם קוטביות המתאים, ולבצע phagocytosis של מקטעי החיצוני קולט אור8. פרוטוקול זה היא מהירה ואמינה יותר מאשר "ספונטנית" הפרוטוקולים של בידול המערבות הסרה פשוטה של בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה8. יתר על כן, רצפי RNA הנתונים מראים כי RPE להשיג באמצעות פרוטוקול זה הם דומים מאוד לאלו שהושגו באמצעות גישה ספונטנית נפוץ יותר8. השיטה 14 יום יוצר RPE שמתאימים 5 ה-פ' של"שהוזכרו על ידי Mazzoni9 (פיגמנט, מקוטב, phagocytic, שלאחר mitotic, מצולע)9. בזמן הליך זה הוכיח להיות לשחזור במעבדות מרובים, אנו מאחלים להכיר מספר שיטות התמיינות מכוונת נוספים שפורסמו בשנים האחרונות10,11,12 , 13.

<table><tbody><tr><td>SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet</td><td>Baker</td><td>model: SG603A-HE, type: A2, class: 2</td><td>6&#039; Baker laminar flow biosafety cabinet</td></tr><tr><td>Dissection Hood</td><td>Labconco</td><td>Model 3970405</td><td>laminar flow bench top</td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td>heated stage</td></tr><tr><td>air-jacketed CO2 incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td>37 oC and 5% CO2</td></tr><tr><td>inverted phase contrast microscope</td><td>Olympus</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth Factors and Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse noggin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>1967-NG-025</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human DKK-1</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>5439-DK-010</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant IGF-1</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>291-G1-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human/mouse/rat Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>SU5402 FGF inhibitor</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-204308</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Substrates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>growth factor reduced ECMH</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Versene (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (no calcium, no magnesium)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE)</td><td>Gibco</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 (RPE supporting medium)</td><td>Lonza</td><td>BW04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>12-541-0 (1254)</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>BioLife Solutions</td><td>210102</td><td>cryopreservation medium</td></tr><tr><td>1.2 mL Cryogenic Vial</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty (freezing container)</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>freezing container</td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-2</td><td>antimicrobial reagent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>12-well culture plate</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td>Used during differentiation.</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Used during RPE maturation.</td></tr><tr><td>6-well culture plate</td><td>Corning</td><td>CLS3513</td><td>Used during RPE maturation.</td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>Corning</td><td>08-771-1A</td><td>Used during passages.</td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Used during passages before cell count.</td></tr></tbody></table>

rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells

אנו מתארים שיטה חזקה לכוון הבידול של גזע pluripotent לתוך הרשתית פיגמנט בתאי אפיתל (RPE). מטרת מתן פרוטוקול מפורט וממצה היא בבירור להדגים כל שלב כדי לבצע זה זמינים חוקרים בתחום. פרוטוקול זה תוצאות שכבה הומוגנית של RPE עם ניתוח מינימלי או ידני לא צריך. השיטה המוצגת כאן הוכח להיות יעיל עבור המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSC), תאי גזע עובריים. בנוסף, אנו מתארים שיטות הקפאה קריוגנית הבנקים תא ביניים המאפשרים אחסון לטווח ארוך. RPE שנוצר באמצעות פרוטוקול זה עשוי להיות שימושי עבור מידול המחלה-ב--תבשיל iPSC או יישום קליני.

שיטה זו גורמת לייצור טפט הומוגנית, פיגמנט, cuboidal של RPE. ציר הזמן באיור 1 מתאים לתמונות מתואר באיור2. כפי שמוצג באיור 2A, המושבות תאי גזע עמוסים באופן הדוק עם קצוות מוגדרים ותאים fibroblastic אין בין מושבות או תאים אטומים בתוך המושבות. איור 2B מספק ייצוג של ילדותי RPE כי הם subconfluent. אם התאים נמצאים confluent כבר בשלב זה, הם לא יכולים להאריך את תחזיות שחיוניים לתהליך הבידול. תאים שהם קשות subconfluent לא יהיו מסוגלים ליצור טפט ויוצרים צמתי צר, האופיינית של האפיתל. פרטים על איך לייעל את הנהרות מתוארים במקטע דיון. איור 2C מראה המורפולוגיה של שני הסוגים הנפוצים ביותר של הלא-RPE שעשויות להתעורר במהלך תהליך בידול זה: תיקוני עצבית או fibroblastic. חשוב לציין כי הטלאים עצבית להופיע אטומה במיוחד על מיקרוסקופ ויבתר, ואילו המדבקות מוגדרים, כמו fibroblastic שקופים כמעט על מיקרוסקופ ויבתר. זה יכול להיות מועיל לסמן אזורים אלה על צלחת תרביות רקמה בעט אתנול-הוכחה המעבדה לזהות אותם יותר בקלות על מתחם מיקרוסקופ אור והן ויבתר מיקרוסקופ. דמויות 2D-F מראים את גבולות בהיר אופייני, מורפולוגיה המרוצף, פיגמנטציה להצביע על תרבות בריא, התבגרות של RPE. איור 3 היא תמונה הגדלה גבוהה יותר להראות את מראה שונה RPE לבגרות מלאה מתואר על ידי ניגודיות שלב מיקרוסקופיית שדה בהיר. -מעבר לשלושה ימים 30, התאים מוכנים האפיון שכבר תואר בפרסומים קודמים, כולל ביטוי RNA, ביטוי חלבון, הפרשת גורם הגדילה של phagocytosis2,4,6 ,7. אפיוני אלה מראים כי התאים ייצג את התמונות האלה הן לא רק פיגמנט וגם cuboidal, אבל phagocytic, שלאחר mitotic, ו מקוטב.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg"> 
איור 1:. ציר זמן עבור התוספת של גורמי גדילה, התבגרות של RPE- גורמי גדילה יתווספו 12-ובכן צלחות מיום 0-14. התבגרות RPE מתורבתים. ובכן 6 צלחות או מבחנות T75 מיום העשרה עד 30 ימים לאחר הפשרה (מעבר לשלושה ימים 30). חיצים מציינים אנזימטי תא passaging. (A-E) להלן צירי הזמן להתאים התמונות באיור2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg"> 
איור 2: זרימה של התבגרות RPE ומורפולוגיה נציג. תאי גזע pluripotent המושרה מיד לפני passaging על בידול (א). לא בוגר subconfluent תאי RPE-יום 2 (B) ולפני פיק-כדי-הסר העשרה ביום 14; תיקונים שאינם-RPE (המסומנים על ידי חצים לבנים) מופיעים כתמים או אטום "סרטים" (C). RPE-המעבר 0, 1 ו- 3 ביום 30 (D, E, ו- F). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg"> 
איור 3: בוגר RPE-מעבר 3: 30 יום מורפולוגיה cuboidal מתואר לעומת שלב (A), פיגמנטציה מתואר בהיר-שדה (B). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתאי גזע pluripotent. השיטה משתמשת בשילוב של גורמי גדילה מולקולות קטנות כדי לכוון את הבידול בתאי גזע לתוך RPE ילדותי בעוד 14 ימים ו- RPE בוגרת, פונקציונלי לאחר שלושה חודשים.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

rapid-directed-differentiation-retinal-pigment-epithelial-cells-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.2K Views.  University of California, Santa Barbara. פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתאי גזע pluripotent. השיטה משתמשת בשילוב של גורמי גדילה מולקולות קטנות כדי לכוון את הבידול בתאי גזע לתוך RPE ילדותי בעוד 14 ימים ו- RPE בוגרת, פונקציונלי לאחר שלושה חודשים.

Video: Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

The objective of this report is to describe the protocols to derive the retinal pigment epithelium (RPE) from induced pluripotent stem (iPS) cells using different sizes of embryoid bodies.

תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms remain elusive mainly due to the lack of a good in vivo model for studying BEST1 and its mutations under physiological conditions. BEST1 encodes an ion channel, namely BESTROPHIN1 (BEST1), which functions in retinal pigment epithelium (RPE); however, the extremely limited accessibility to native human RPE cells represents a major challenge for scientific research. This protocol describes how to generate human RPEs bearing BEST1 disease-causing mutations by induced differentiation from human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs are self-renewable, this approach allows researchers to have a steady source of hPSC-RPEs for various experimental analyses, such as immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp, and thus provides a very powerful disease-in-a-dish model for BEST1-associated retinal conditions. Notably, this strategy can be applied to study RPE (patho)physiology and other genes of interest natively expressed in RPE.

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Here we present a protocol to differentiate retinal pigment epithelium (RPE) cells from human pluripotent stem cells bearing patient-derived mutations. The mutant cell lines may be used for functional analyses including immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp. This disease-in-a-dish approach circumvents the difficulty of obtaining native human RPE cells.

בידול, תחזוקה, וניתוח תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית אנושי: מודל המחלה-ב--תבשיל BEST1 מוטציות

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Genetics

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Medicine

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

התמיינות תלת-ממדית משופרת של הרשתית העצבית מתאי גזע עובריים אנושיים

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

מחבר זרקור: ייצור אורגנואיד פשוט ויעיל ברשתית העצבית למידול מחלות

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid

בידול, תחזוקה, וניתוח תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית אנושי: מודל המחלה-ב--תבשיל BEST1 מוטציות

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים