この作品は、生薬 (CIRM; TG2 01151、FA1 00616 TB1 01177 CL1 00521 DR1 01444 の補助金)、バーモント州コミュニティ財団、財団ブローのビジョン、カリフォルニア工科大学のガーランド イニシアチブによって支えられたと、財団失明ウィン ・ ガンド橋渡し研究加速プログラムとの戦い。

1 プロトコルの日 14 日 0 の試薬の準備 <ol><li>次のメディア コンポーネントの準備: 100 x N2 サプリメント、2 mL の 1 mL を追加することによって <ol><li>網膜の分化の作る 100 mL 中 (RDM)。50 x B27 サプリメント、ダルベッコの 96 mL に非必須アミノ酸 (NEAA) x 100 の 1 mL &#39; s 変更必須培地/栄養混合物 F12 9 (DMEM/F12).</li>
		1 M ニコチン酸アミド (NIC) 8 mL の滅菌水、ボルテックス、ボリュームを 10 mL の滅菌水にもたらすに NIC の溶解 1.221 g の <li>を作る 10 mL。無菌フィルター ソリューションです</li>。
	</ol></li> <li>次成長因子および小さい分子の準備: <ol><li>西川遺伝子組換えマウスの頭、人間 dickkopf WNT シグナル伝達経路阻害剤 1 (デンマーク クローネ-1) と 100 μ g/ml ごとに 0.1% ウシ血清アルブミン IGF-1(BSA) リン酸緩衝液 (PBS) で。必要に応じての約数と最大 3 カ月の-20 ° C でストア</li>。
		<li>は、10 μ G/ml と組換えヒト ・ マウス ・ ラット アクチビン A 100 μ g/ml 各に PBS で 0.1 %bsa に FGF basic を再構成します。必要に応じて因数と 1 年間-80 ° c ストア</li>。
		<li>再構成 SU 5402 (FGF 受容体のチロシンキナーゼ阻害剤) と CHIR99021 (グリコーゲン合成酵素キナーゼ 3、GSK-3 β 阻害剤) ジメチルスルホキシド (DMSO) で 10 mm。約数と最大 1 年間または 6 ヶ月の-20 ° C でストアそれぞれ</li>。
	</ol></li> <li>0 日目や日 14:1 x ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA) 溶液 (0.2 g PBS の 1 L あたり EDTA)-/- 1x PBS の次を取得 (カルシウムやマグネシウム、pH 7.4 PBS)、1 x 解離トリプシン様酵素 (TDE) DPBS (ダルベッコ &#39; s PBS)、Y-27632 (RSM)、中小企業を支援する RPE 二塩酸塩 (10 μ M で使用します).</li>
</ol> 2。: 日 0 分化多能性幹細胞の通路の 継前におよそ 80% 合流するフィーダー フリー、無血清条件 <ol><li>成長幹細胞コロニー 。
	注: この手順の最適化に関する詳細については議論を参照してください</li>。
	<li>は、メーカーの推奨事項に従って細胞外マトリックスによるハイドロゲル (ECMH) と 12 ウェル プレートをコートします。4、または一晩室温で 1 時間を設定できるように ° C</li>
	<li>因数 RDM と PBS-/- 成長因子を追加する前に 0、37 ° c の水浴は暖かい日の必要量。部屋の温度に EDTA をもたらすします</li>。
	<li>は、暖められた RDM 10 mM NIC、50 ng/mL 頭、10 ng/mL デンマーク クローネ-1 および 10 ng/mL IGF-1 の 0 日の必要な成長因子を追加します。手順 1.2 株から RDM の 10 mL に NIC の 100 μ L、5 μ l の頭のデンマーク クローネ-1 の 1 μ L、IGF-1 の 1 μ L を追加します</li>。
	<li>は、差別化のため継代するが幹細胞からの形態に基づいてすべての差別化された植民地を削除する選択します。P10 ピペット先端部を使って、分化した細胞を手動で削除します 。
	注: コロニーとコロニー内で不透明な細胞間の線維芽細胞は、分化した細胞を削除するを示します。分化した細胞の詳細についての議論を参照してください</li>。
	<li>12 ウェル プレート (1:4) の 4 の井戸に 6 ウェル プレートの単一の井戸を通路 。
	注: この段階で幹細胞を継詳細についての議論を参照します。
	<ol><li>幹細胞から幹細胞の培地を吸引し、予め温めておいた PBS-/- の 2 mL で一度洗浄します</li>。
		<li>吸引 PBS-/- と各 3 回も EDTA 6 ウェル プレートのウェルあたり 1 mL でリンスします</li>。
		<li>は軽くプレートを傾け、EDTA を吸引します。途中でセルを持ち上げることを避ける方法でプレートを揺り動かしてはいけない</li>。
		<li>第 3 洗浄後 EDTA の 1 mL を追加し、3-5 分のためのフードに室温で孵化させなさい。この潜伏中にプレートを邪魔しないでください</li>。
		<li>は、EDTA を吸引し、余分な媒体の 0.5 mL とシードがよくあたり RDM の 1 mL を追加します。たとえば、4 の井戸 12 ウェル プレートにプレートに RDM の 4.5 ml 6 ウェル プレートの 1 を洗うです</li>。
		<li>は、注意深く取り外しますセルにセル スクレーパーを使用します。円錐管のすべてのセルを収集し、上下に 5 回ピペッティングによる RDM のセルをカップ刻んだ。細胞の大きな塊を解離がない単一細胞懸濁液をカップ刻んだか。均等にピペットで細胞を配布します。プレートへの再付着を防ぐためにすぐにこの手順を完了します</li>。
		<li>細胞外マトリックス コート 12 ウェル プレート (ウェルあたり細胞懸濁液の 1 mL) のセルをシードします</li>。
		<li>プレートを井戸全体に均等に細胞を配布する前後に傾け。次の媒体の変更まで 37 ° C、5% CO 2 で細胞文化のインキュベーターをそっと置きします</li>。
		<li>では、正確な時間を注意してください。毎日同じ時刻に変更中です</li>。
	</ol></li></ol> 3。1 に 14 日目: 成長因子添加 <ol><li>日 1: すべての井戸 (ウェルあたり 1 mL) に媒体を変更 (手順 2.4 参照) 0 日目の成長因子配合で RDM を使用します</li>。
	<li>日 2: 10 ng/mL IGF-1、10 ng/mL デンマーク クローネ-1 10 ng/mL 頭 5 ng/mL FGF basic RDM (ウェルあたり 1 mL) 10 mm NIC を使用してメディアを変更します。手順 1.2 株から RDM の 10 mL に NIC、FGF basic の 5 μ L、1 μ L の頭の 1 μ L の DKK1、IGF1 の 1 μ L の 100 μ L を追加します</li>。
	<li>日 4: 100 ng/mL アクチビン A, 10 ng/mL デンマーク クローネ-1 10 ng/mL IGF-1 と RDM (ウェルあたり 1 mL) を使用してメディアを変更します。手順 1.2 株から RDM の 10 mL にアクチビン A、1 μ L の DKK1、IGF-1 の 1 μ L の 10 μ L を追加します 。
	注意: この段階で細胞が合流するに従ってください</li>。
	<li>日 6: 5402 100 ng/mL アクチビン A と 10 μ M SU RDM (ウェルあたり 1 mL) を使用してメディアを変更します。手順 1.2 株からアクチビン A の 10 μ L と SU の 10 μ L の RDM 5402 に 10 mL を追加します</li>。
	<li>日 12、10、8: 3 μ M、10 μ M SU 5402、100 ng/mL アクチビン A RDM (ウェルあたり 1 mL) を使用してメディアを変更 CHIR99021。手順 1.2 株から RDM の 10 mL にアクチビン A、SU 5402 10 μ CHIR99021 の 3 μ L の 10 μ L を追加します</li>。
</ol> 4。日の濃縮の RPE の通過 0 <ol><li>コート成長因子 6 ウェル プレートは、製造元の推奨事項に従って ECMH を削減します。4、または一晩室温で 1 時間を設定できるように ° C</li>
	<li>因数 DPBS 必要のボリュームと RDM の濃縮と 37 に水浴の暖かい井戸ごとに 1 ミリリットル ° C. 持参部屋の温度と暖かい必要なボリュームに RSM、抗菌剤、Y-27632 の 37 に TDE ° C</li>
	<li>追加抗菌試薬と Y-27632 0.5 倍と RSM をそれぞれ 10 μ M の組成を得るします。最初の 4-7 日添付ファイルを改善するためにこのメディアを使用します</li>。
	<li>すべてから培地を使った吸引井戸し、予め温めておいた RDM (成長因子は必要) の井戸あたり 1 mL を追加します</li>。
	<li>解剖顕微鏡を使用して、手動で分析し、P10 のピペット チップを使用してすべての非網膜色素上皮細胞を削りします 。
	メモ: は、代表的な結果については、例を参照してください</li>。
	<li>郭清後、吸引 RDM とすべてのセルの残骸。予め温めておいた DPBS ウェルあたりの 1 つの mL で 2 回洗浄します</li>。
	<li>は、TDE 12 ウェル プレートのウェルあたり 0.5 mL を加えるし、5 分優しくプレートからセルを削除する使用細胞スクレーパーの 37 ° C で孵化させなさい。優しく上下に 3-4 回をピペッティングにより細胞/TDE サスペンションをカップ刻んだ P1000 ピペットを使用して均一な懸濁液を作成します</li>。
	<li>は 1:10 Y-27632 せず、予め温めておいた RSM でセル/TDE の懸濁液を希釈します。室温で 5 分間 173 x g で細胞を懸濁液を遠心します</li>。
	<li>細胞ペレットから培地を吸引し、RSM で 10 μ m の細胞を再懸濁します Y-27632 (1 mL あたり濃縮井戸).</li>
	<li>は、40 μ m の孔を持つナイロン メッシュの携帯ストレーナを使用してセルを痛めます。診断を使用して、指定したボリュームのセルの数を数えるし、緊張したソリューション内のセルの濃度を計算します</li>。
	<li>シード細胞成長因子の減少 1 × 10 5 セル/cm 2 4 mL RSM の 10 μ m で細胞外マトリックス コート プレート Y-27632</li>。
	<li>は、10 μ m、RSM を置き換える Y-27632 細胞播種後 48 時間ごとに 3-4 日 (例えば 月曜日と木曜日) メディアの交換を続けると。10 μ M を交換しないでください 4-7 日後 Y-27632</li>。
	<li>は、37 ° C および 5% の CO 2 の 28 から 35 日で成熟するセルを許可します。RSM を交換して 3-4 日おき (例えば 月曜日と木曜日) 続けます</li>。
</ol> 5。成熟: 通路 1 と RPE の 2 注: かっこで示されているように、ボリュームは 1 6 ウェル プレートや T75 フラスコのよく示されます。
<ol><li>0 の通路の 28 に 35 日間コートの製造元の推奨事項に従って ECMH と 6 ウェル プレート (T75 フラスコ).</li>
	<li>因数 DPBS と RSM 必要と 37 に水浴の暖かいボリューム部屋の温度 ° c. をもたらす TDE</li>。
	<li>吸引井戸から媒体および洗浄の各も二度と一緒に過ごした 2 mL (10 mL) に予め温めておいた DPBS 。
	注: は、10 μ M を使用しないでください Y-27632</li>。
	<li>吸引 DPBS TDE の 1 mL (5 mL) を追加。5 分で 37 ° C、5% CO 2 インキュベーターに配置します。インキュベーション後、セルを確認する倒立顕微鏡上のビューのセルを契約およびデタッチします</li>。
	<li>井戸やフラスコの底から細胞を取り除く適切に大きさで分類された細胞スクレーパーを使用して優しく</li>。
	<li>P1000 tip (10 mL の血清ピペット) を使用して優しくカップ刻んだセル/TDE サスペンション上下に 3-4 回に均一な懸濁液を作成します</li>。
	<li>は、細胞懸濁液 1:10 RSM で希釈します。まあ/フラスコを洗浄し、希薄化後の細胞懸濁液を加える RSM の 2 mL (5 mL) を予約します 。
	注: こと酵素露光時間 25 分を超えることはできません</li>
	<li>室温で 5 分間 173 x g で細胞懸濁液を遠心します</li>。
	<li>細胞ペレットから培地を吸引し RSM の 1 mL (5 mL) に細胞を再懸濁します</li>
	<li>は、40 μ m の孔を持つナイロン メッシュの携帯ストレーナを使用してセルを痛めます。診断を使用して、指定したボリュームのセルの数を数えるし、緊張したソリューション内のセルの濃度を計算します</li>。
	<li>種子 1 x 10-5 セル/cm 2 RSM の 4 mL (15 mL) ECMH コーティング プレート上のセル</li>。
	<li>は、30 日間成熟するセルを許可します。RSM を変更するごとに 3-4 日間続ける</li>。
	<li>2 に 1 の通路から細胞を通路に 30 日 (ステップ 5.2 5.11) の上記の手順を繰り返します</li>。
</ol> 6。中間の細胞バンクの作成: 凍結の通路 2 日 3-5 RPE 注: 10mj/cm ^2 (50%)、顔料を取り戻していない間に細胞を凍結します。
<ol><li>3 × 10 6 セル/mL の濃度で細胞を再懸濁しますに必要な 10 %dmso を凍結保存培地量を計算するセルの数に基づいて、.</li>
	<li>手順 5.2 に 5.8。3 x 10 6 セル/mL に 10 %dmso を凍結保存培地で細胞ペレットを再懸濁します、1.2 mL セラム チューブに細胞懸濁液の 1 mL を転送します</li>。
	<li>は-1 ° C/分で冷却し、一晩-80 ° C で設計された冷凍コンテナーにセラム チューブを配置します。長期保存用液体窒素に転送します 。
	注: これらの細胞は、融解時に通路 3 になります。評価の前に 30 日以上の培養します。シード通過 1.5 x 10 で 3 網膜色素上皮融解時に cm 2 あたり 5。 2, 4, 6, 7</li></ol>

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+Review:+Making+Stem+Cells+Retinal:+Methods+for+Deriving+Retinal+Pigment+Epithelium+and+Implications+for+Patients+With+Ocular+Disease.">Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. 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博士クレッグは再生パッチの技術 LLC の共同創設者です。

このプロトコルでは、多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞を生成する方法について説明します。メソッドはフィーダー フリー、無血清培養法から両方人間の胚および誘導多能性幹細胞を使用して最適化されていました。1998 年にヒトの胚性幹細胞の初期の分離、2007 年に誘導多能性幹細胞 (iPSC) の導出方法がされている幹細胞文化の多数開発14,15,16、 17。これらのメソッドは、この分化に影響を受けている幹細胞コロニーを生成するために十分なはずです。適切に派生し、維持された多能性幹細胞にこのメソッドの適用性への既知の制限があります。
最も重要な手順は、幹細胞の分化 (ステップ 2.5) の 0 日目へのプロセス (手順 4.5) の 14 日で手動の郭清の必要性継です。幹細胞のコロニーから分化した細胞を削除するを選択、ケントの18の画像を参照します。示されるように、コロニーとコロニー内で不透明な細胞と線維芽細胞は分化した細胞はこのプロトコル18を開始する前に削除する必要があるを示します。定義されたエッジを持つ未分化、堅く詰められたコロニーだけは、差別化のため継代する必要があります。
幹細胞/ウェル (ステップ 2.6.7) シードの数は幹細胞通過時に単一細胞懸濁液に物できない診断を使用して正確に数えることができないという事実によって複雑になります。80% コンフルエントの細胞の近似 6 ウェル プレートの継 1 12 ウェル プレートの 4 井戸に適応があります。成長率などの幹細胞ラインの違いは、どのように迅速に未熟な網膜色素上皮に到達 0 に 4 日間合流に及ぼします。幹細胞は正確な合流点に関係なく RPE を生成しますが、この段階であまりにもスパース セルになる場合に、細胞収率は否定的影響を。未熟な網膜色素上皮細胞は、1 日目でほぼ 100% 合流 4 日目で約 40-50% の合流をする必要があります。セルは、4 または 6 日コンフルエント単層を生産されていません、プロトコルは 0 日で, 播種密度が高いで繰り返してください。たとえば、6 ウェル プレートの 1 は 0 日目で 12 ウェル プレートの 4 の井戸に継代、未熟な網膜色素上皮が 4 日目で 100% 合流、日 0 1:3、1:2 通路にシードを減らすかより合流になる幹細胞を許可します。前継。複数のセルの行を比較するときに一貫した播種密度を確立する重要です。
14 日で手動の解剖手順は、非網膜色素上皮細胞が文化 (図 2) に存在する場合にのみ必要です。プロトコル CHIR99021 のに加えて、以来多くの多能性幹細胞ラインほとんどない手動の郭清が必要です。いくつかの準備がある神経のパッチの発症率が高いと、それらのセルを削除することが重要。RPE 通路 3 通過 0 で実行可能な場合は、すべて非網膜色素上皮細胞を削除するための十分な時間を割いて分化プロトコルを繰り返すことは不可能です。これは多くの場合、発生しませんが、それは必要なときに 14 日目に解剖手順を最適化できることに注意してくださいにここに記載されています。
様々 な網膜色素上皮分化プロトコルのコストと同様に培養法、効率、定量化、相違があるし、されている後者の機能の評価は2を徹底的に見直します。我々 はここでの詳細な有効性、適応性、およびセル行4,7,8の広い範囲への適用性のため 14 日方法を好みます。このプロトコルでは凍結保存手順はまた実験でロットごとに変動を回避する将来の使用のための中間細胞バンクの作成の主要な利点を提供します。12 ウェル プレートのだけ 4 井戸、通路 0 6 ウェル プレート、1 と 2 の通路で T75 フラスコに拡大する可能性があります。通路 2 日 3-5、セルはまだ 10mj/cm ^2 して顔料を取り戻していないときに、セルの数千万を凍結し、3 日間 30 通路を指定、成熟 RPE を解凍、RNA 発現、タンパク質発現、成長因子をチェックすることが可能です。分泌、貪食など。最大 13 の通路19の RPE を展開するプロトコルを定めています。
楽しみにして、このメソッドは、iPSC 眼疾患のモデル化と世代 RPE の細胞療法のための役に立つでしょう。IPSC 疾患モデリングに関してこのプロトコルは、現在使用されているラボで CRISPR 修正行同じ患者から非修正コントロールから RPE を生成します。さらに、このプロトコルは、合成基質と細胞療法に必要な優れた製造基準を遵守するために役立つ無料の xeno の条件に適応されます。

網膜色素上皮は色素細胞の単層感光体の重要なサポートを提供します。網膜色素上皮細胞 (RPE) ビジョン、光吸収、栄養とイオン輸送、サイクリング、レチノイドを含む視細胞外節貪食に多数の機能があるし、成長因子の分泌1。RPE とビジョン、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症などの損失の結果の機能に影響を与える網膜ジストロフィーのさまざまながあります。多能性幹細胞から RPE の世代はこれらの目の病気を理解するための研究を促進するかもしれないし、細胞療法2RPE の無制限のソースを提供することができます。実際には、複数の臨床試験は進行中 RPE 由来の多能性幹細胞3を使用しています。
この分化プロトコル ブッフホルツ4によって記述されていた、クレッグ5から以前に公開された方法に基づいていた。プロシージャを模倣塩基性繊維芽細胞成長因子 (FGF-2; インスリン成長因子 (IGF) の操作を介して RPE 運命に向かって未分化の多能性幹細胞を直接に通常体内の発達過程FGF-basic)、成長因子 β (TGF-β) および wnt シグナル経路4,5に変換します。プロトコルは、97.77% ± 0.1% 前色素タンパク質 (ブイデータ) 肯定的な細胞が得られたし、xeno 無料条件6,7に適応されているプロトコル後半 WNT 経路アゴニストの添加により向上します。結果 RPE は、適切な極性で知られている網膜色素上皮成長因子を分泌して、視細胞外側セグメント8の貪食能を遂行する成績証明書および蛋白質レベルでの RPE マーカーを表現するために示されています。このプロトコルより迅速かつ信頼性の高い塩基性繊維芽細胞成長因子8の簡単な除去を伴う分化の「自然な」プロトコルよりもです。さらに、RNA 塩基配列解読 RPE は、このプロトコルを使用して取得したデータを示してより一般的な自発的なアプローチ8を使用して得られたものに似ています。14 日メソッドは、マッツォーニ9 (色素性、偏光、貪食、分裂、多角形)9によって述べられる"5 P の"に合った RPE を生成します。この手順は、複数のラボで再現可能なことを証明して中を近年10、11,12に掲載されているいくつかの追加の分化方法を認めることを願う,13。

<table><tbody><tr><td>SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet</td><td>Baker</td><td>model: SG603A-HE, type: A2, class: 2</td><td>6&#039; Baker laminar flow biosafety cabinet</td></tr><tr><td>Dissection Hood</td><td>Labconco</td><td>Model 3970405</td><td>laminar flow bench top</td></tr><tr><td>dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1500</td><td>heated stage</td></tr><tr><td>air-jacketed CO2 incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td>37 oC and 5% CO2</td></tr><tr><td>inverted phase contrast microscope</td><td>Olympus</td><td>IX53</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth Factors and Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse noggin</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>1967-NG-025</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human DKK-1</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>5439-DK-010</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant IGF-1</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>291-G1-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human/mouse/rat Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>SU5402 FGF inhibitor</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-204308</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Substrates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>growth factor reduced ECMH</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Versene (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (no calcium, no magnesium)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE)</td><td>Gibco</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 (RPE supporting medium)</td><td>Lonza</td><td>BW04-743Q</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>12-541-0 (1254)</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>BioLife Solutions</td><td>210102</td><td>cryopreservation medium</td></tr><tr><td>1.2 mL Cryogenic Vial</td><td>Corning</td><td>430487</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty (freezing container)</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>freezing container</td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-2</td><td>antimicrobial reagent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>12-well culture plate</td><td>Corning</td><td>CLS3516</td><td>Used during differentiation.</td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Used during RPE maturation.</td></tr><tr><td>6-well culture plate</td><td>Corning</td><td>CLS3513</td><td>Used during RPE maturation.</td></tr><tr><td>cell scraper</td><td>Corning</td><td>08-771-1A</td><td>Used during passages.</td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Used during passages before cell count.</td></tr></tbody></table>

rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells

分化多能性幹細胞の網膜色素上皮細胞 (RPE) を直接する手法について述べる.詳細かつ徹底的なプロトコルを提供する目的は、各ステップを明確に示すことと、分野の研究者が容易に閲覧できるようにします。このプロトコルは、必要最小限のまたは手動の郭清を伴う RPE の均質な層の結果します。ここで紹介した方法のため有効であることが示されている誘導多能性幹細胞 (iPSC) とヒト胚性幹細胞。さらに、長期保管を許可する銀行や中間細胞の凍結保存法について述べる。このプロトコルを使用して生成された RPE は iPSC 皿での疾患モデリングまたは臨床アプリケーションの役に立つかもしれない。

このメソッドは、RPE の均一、色素、および立方単分子膜の生産の結果します。図 1のタイムラインは、図 2に示されている画像に対応します。図 2 aのように、幹細胞のコロニーは定義されたエッジとコロニーとコロニー内で不透明な細胞も線維芽細胞きつくパックされました。図 2 bは、10mj/cm ^2 は、未熟な RPE の表現を提供します。セルは、この段階ですでに合流場合、彼らは分化過程に重要な予測を拡張できません。厳しく 10mj/cm ^2 のセルは単分子層を確立し、タイトな接合、上皮の特徴を形成することができません。この合流点を最適化する方法の詳細については、ディスカッション セクションで概説されます。図 2は、この分化過程中に生じる可能性のある非 RPE の 2 つの最も一般的なタイプの形態を示しています: 神経または線維芽パッチ。定義、芽のようなパッチが管の内径にほぼ半透明に対しこれらの神経のパッチが解剖顕微鏡で特に不透明な表示されることに注意してくださいすることが重要です。それはより簡単に化合物の光学顕微鏡と解剖顕微鏡の両方でそれらを識別するためにエタノール実証ラボ ペンで組織培養プレート上のこれらの領域をマークすることができます。図 2 D-Fを示す特徴的な明るい罫線、石畳の形態、RPE の健全な成熟文化を示す色素沈着。図 3は、位相差顕微鏡および明るいフィールド顕微鏡によって描かれた完全に成熟 RPE の別の外観を表示する高倍率の画像です。通路で 3 日間 30、セルが RNA、貪食2,4,6 や成長因子の分泌蛋白質の表現式を含む以前の出版物に記載されている評価の準備ができて ,7。これらの特徴づけは、これらの画像で表されるセルがだけでなく色素立方、しかしも貪食後分裂と、偏光であることを示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig1.jpg"> 
図 1: します。成長因子添加と網膜色素上皮の成熟のためのタイムライン。成長因子は 0-14 日目から 12 ウェル プレートに追加されます。成熟 RPE 6 ウェル プレートや濃縮の日から 30 日間解凍後 (3 日間 30 の通路) に T75 フラスコで培養しています。矢印を示す酵素細胞継します。(A ~ E) の下のタイムラインが図 2の画像に対応します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig2.jpg"> 
図 2: 代表的な形態と成熟 RPE の合流します。誘導多能性幹細胞分化 (A) の通過の直前に。未熟な RPE 細胞サブコンフルエント日 2 (B) で、14; の日にピックアップを削除する濃縮前に、非 RPE パッチ (白い矢印で示されます) は、パッチまたは不透明な「リボン」(C) として表示されます。RPE 0、1、および 3 日 30 通路 (D、E、およびF)。スケール バー = 200 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56274/56274fig3.jpg"> 
図 3: 3 の通路で RPE を成熟: 日 30位相コントラスト (A) に描かれている立方形態と色素沈着明るいフィールド (B) に描かれています。スケールバー = 50 μ m.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56274/56274fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

このプロトコルでは、多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞 (RPE) を生成する方法について説明します。メソッドは、分化誘導細胞の未熟な網膜色素上皮に 14 日で成熟し、機能的な RPE 3 ヵ月後に成長因子および小さい分子の組み合わせを使用します。

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

rapid-directed-differentiation-retinal-pigment-epithelial-cells-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.2K ビュー.  University of California, Santa Barbara. このプロトコルでは、多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞 (RPE) を生成する方法について説明します。メソッドは、分化誘導細胞の未熟な網膜色素上皮に 14 日で成熟し、機能的な RPE 3 ヵ月後に成長因子および小さい分子の組み合わせを使用します。

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Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

発生生物学

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

The objective of this report is to describe the protocols to derive the retinal pigment epithelium (RPE) from induced pluripotent stem (iPS) cells using different sizes of embryoid bodies.

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms remain elusive mainly due to the lack of a good in vivo model for studying BEST1 and its mutations under physiological conditions. BEST1 encodes an ion channel, namely BESTROPHIN1 (BEST1), which functions in retinal pigment epithelium (RPE); however, the extremely limited accessibility to native human RPE cells represents a major challenge for scientific research. This protocol describes how to generate human RPEs bearing BEST1 disease-causing mutations by induced differentiation from human pluripotent stem cells (hPSCs). As hPSCs are self-renewable, this approach allows researchers to have a steady source of hPSC-RPEs for various experimental analyses, such as immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp, and thus provides a very powerful disease-in-a-dish model for BEST1-associated retinal conditions. Notably, this strategy can be applied to study RPE (patho)physiology and other genes of interest natively expressed in RPE.

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Here we present a protocol to differentiate retinal pigment epithelium (RPE) cells from human pluripotent stem cells bearing patient-derived mutations. The mutant cell lines may be used for functional analyses including immunoblotting, immunofluorescence, and patch clamp. This disease-in-a-dish approach circumvents the difficulty of obtaining native human RPE cells.

差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

遺伝学

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

医学

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

ヒト胚性幹細胞からの3D神経網膜分化の促進

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

著者スポットライト:疾患モデリングのためのシンプルで効率的な神経網膜オルガノイド生産

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

要約

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この動画の章

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデルフィーダーフリー培養条件

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニアリング

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

要約

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幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

差別化、保守、および人間の網膜色素上皮細胞の解析: BEST1変異の皿での疾患モデル

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデルフィーダーフリー培養条件

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニアリング