אנו להכיר OPPF-UK לסיוע בשיבוט, ג'מה האריס שניה-קניונים, המדענים של beamlines I03, I04 במקור אור יהלום.

הערה: רצף קידוד אשר נמחק את פפטיד אות שוכפל ב וקטור pOPINF בעקבות פרוטוקול תקני ב- fusion; החלבון יליד מבוטאת פיוז'ן שלו-תג בתאים Escherichia coli BL21 רוזטה 28 , 29. selenomethionine עם התווית variant מתבטא בעקבות בשיטות הרגילות על-פי יצרן 30. רקומביננטי SBP מטוהר כאמור תיאר 31 , 32-
 1. איפיון ביוכימי <ol><li>תרמית להעביר assay <ol><li>48 להכין מאגר פתרונות עם pH החל מ- 4.0 9.5 וריכוז NaCl בין 0 ל- 0.5 M, לוותר על 40 µL בצלחת 96-ובכן כפי שמתואר טבלה 1 33.</li> <li>להוסיף לכל µL 5 טוב של הפתרון SBP-ריכוז 1-2 מ"ג/מ"ל.</li>
		<li>להוסיף לכל µL 5 טוב של 20 x הכתם פלורסנט חלבונים (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>לערבב את הפתרונות על ידי pipetting, לאטום את הצלחת באמצעות סרט דביק שקוף וספין למשך 2 דקות ב g x 112 בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להפעיל את הניסוי על מכונת אמת: הגדר רמפה בטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס/דקה 4 99 ° C עם זמן המתנה s 10 ולאחר לקרוא את קרינה פלואורסצנטית כל 0.5 ° C עם עירור ב 483 nm, פליטה-568 nm.</li>
		<li>לנתח את עקומות פליטת קרינה פלואורסצנטית עבור כל תנאי מאגר, זיהוי את טמפרטורת ההיתוך (T m) המינימום של הנגזרת. 
		הערה: הליך זה נותן סימן טוב של הפתרון מאגר הטוב ביותר כדי לסייע לשיפור היציבות חלבון. בחר את טווח pH ריכוז המלחים המבוסס על תנאי מאגר עם ה-T הגבוהה מ' ולהוסיף 2.5% (v/v) גליצרול ו 0.5 מ מ של tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) כדי להגדיר את בופר עבור השלבים הבאים (שניה-מאגר).</li>
	</ol></li> <li>MALS ושל שניה אנליטית <ol><li>לבצע שטיפה כרך שני טורים של העמודה סינון מראש ארז ג'ל עם מים מסוננים degassed (שימוש מגוון רחב משקל מולקולרי 24 mL עמודה).</li>
		<li>להתחבר העמודה הגלאי פיזור אור, equilibrate את העמודה עם המאגר שניה נחוש מ וזמינותו shift תרמי.</li>
		<li>µL להזריק 100 של SBP מטוהרים-5 מ"ג/מ"ל לתוך equilibrated שניה טור וזרימה עמודה אחת נפח שניה-buffer-</li>
		<li>לבדוק את chromatogram • תנאי יחיד או מספר פסגות, לבדוק את נתוני הפיזור באמצעות התוכנה ניתוח, קבלת המסה טוחנת מדד polydispersity עבור כל המינים. 
		הערה: עבור כל שיא המתאימים זן oligomeric, זה מועיל לבדוק את polydispersity אינדקס מחושבת המסה טוחנת משוקלל על מסה מסת/טוחנת משוקלל על מספר מולקולות (Mw/Mn). ערך polydispersity קרוב ל- 1 מציין לשיא monodispersed. 
		הערה: לאחר כל המינים oligomerization מוגדרים, כן הוא שימושי ללמוד תלותם ריכוז חלבון, כמו ריכוז גבוה עשוי להעדיף היווצרות אוליגומר גדול יותר.</li>
		<li>להורג מספר הרצפים שניה אנליטי; להזריק 100 µL של SBP מטוהרים-ריכוז (0.1 - 10 מ"ג/מ"ל) לתוך העמודה סינון ג'ל equilibrated (שימוש עמודה 5 mL מגוון רחב משקל מולקולרי), לזרום אחסון אחד עמודה שניה-מאגר בכל פעם.</li>
		<li>לבדוק את chromatogram • תנאי יחיד או מספר פסגות ולנתח את עוצמות ספיגת ב 280 nm של עקומות המתאים ריכוזים שונים של חלבון המוצא. אם עוצמות היחסי של הפסגות שונים נשארת קבועה, ללא המרה בין בין המינים oligomeric קיים. וריאציה של עוצמות היחסי בריכוזים שונים הן סימן interconversion בין מינים שונים oligomeric התלויים ריכוז חלבון. 
		הערה: שלב אפיון זה היסוד להגדיר אילו זנים מתאימים יותר עבור התגבשות. אכן, מינים נפרדים monodispersed הם נוטים להתגבש אם הם במצב oligomeric יציב-ריכוז מוגדרים.</li>
	</ol></li></ol> 2. התגבשות והכנה של חלבון <ol><li>מפוח שניה <ol><li>לאחר אמצעי אחסון עמודה אחת לשטוף עם מים מסוננים degassed, equilibrate עם שניה-buffer העמודה סינון ג'ל מראש ארז מפוח (מגוון רחב מולקולרית משקל 120 מ ל עמודה).</li>
		<li>להזריק 1-5 מ של SBP מטוהרים ב 5-50 מ"ג/מ"ל לתוך ג'ל equilibrated סינון העמודה ואת זרימת עמודה אחת נפח שניה-buffer-</li>
		<li>לאסוף את העמודה הזרימה דרך 1 מ"ל שברים.</li>
		<li>מאגר שברים המקביל לשיא monodisperse יחיד; ספין המדגם מסננים צנטריפוגה 15 מ"ל ב 1,500 g ולכמת את הריכוז עד הריכוז הרצויה מושגת (בדרך כלל 50-100 mg/mL עבור SP0092).</li>
	</ol></li> <li>התגבשות <ol><li>לקבוע טווח ריכוז אופטימלי עבור הניסוי התגבשות באמצעות בדיקה טרום התגבשות של כפי שתואר על ידי היצרן: <ol><li>Dispense 0.5 - 1.0 מ"ל של כל אחד של המבחן התגבשות ארבע פתרונות מאגר שונים של 24-ובכן יושב זרוק התגבשות צלחת-</li>
			<li>להכין את הטיפות התגבשות על ידי ערבוב 1 µL של חלבון פתרון עם 1 µL של המאגר פתרון לאטום את הצלחת, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לא פחות מ 1 h (תוצאות אמינות יותר מתקבלים לאחר לילה הדגירה).</li>
			<li>לבדוק את האיכות טיפה כל הריכוז באמצעות מיקרוסקופ הגדלה 10 x- 
			הערה: בדיקת ריכוז חלבונים שונים לפחות שלושה: (I) רוב הטיפות שנותרו ברור עולה כי החלבון הוא גם שתדללו על התגבשות; (II) הנוכחות של התמיסה כבד ברוב המכריע של הטיפות מרמז על ריכוז גבוה יתר על המידה; ו- (III) מאוזנת מופע של טיפות ברור והן התמיסה (עדיף אם קל) היא אינדיקציה טובה כי ריכוז שנבדקו היא חיובית על התגבשות.</li>
		</ol></li> <li>להכין המסירה ישיבה 96-ובכן התגבשות צלחות; לוותר על µL 100 של התגבשות מסחרי אחר פתרון כל מאגר טוב 34 , 35 , 36 , 37.</li> <li>100 מדבקות/ברקודים nL חלבון מדגם-ריכוז שהוגדרו בעבר (שלב 1.1.6) בכל התגבשות טיפה הבארות באמצעות מערכת רובוטית התגבשות.</li>
		פתרונות <li>nL 100 מדבקות/ברקודים של המאגר שונה המתאים התגבשויות ירידה בארות לערבב עם חלבון בגליל בשלב 2.2.3. לאטום את הצלחת התגבשות כדי למנוע אידוי ולאפשר את equilibration הירידה התגבשות עם המאגר.</li>
		<li>לבדוק את הטיפות מעת לעת (בתחילה כל 1-2 ימים, לאחר מכן כל שבוע) באמצעות סימן x 10 (לפחות) הגדלה במיקרוסקופ כדי להעריך את קריסטל ההיווצרות והגידול. 
		הערה: מערכת הדמיה אוטומטית התגבשות חלבון יכול לשמש עבור טיפות ויזואליזציה ולכידה.</li>
	</ol></li></ol> 3. איסוף נתונים רנטגן ואפיון קריסטל <ol><li>קריסטל הרכבה <ol><li>להכין את הפתרון cryoprotectant על-ידי הוספת 25% (v/v) גליצרול (ריכוז סופי) לתנאי התגבשות (וכך להחליף 25% מים הראשונית תערובת) 38.</li>
		<li>מלא קצף דיואר עם חנקן נוזלי והמקום החלק מארז מדגם של uni-דיסקוס לתוך דיואר. לאפשר לה להתקרר לטמפרטורת חנקן נוזלי.</li>
		<li>לחתוך ולהסיר אטימה קלטת מהצלחת התגבשות על הירידה שבו נוצרים הקריסטלים.</li>
		<li>מקום ירידה של 1 µL של פתרון cryoprotectant אל coverslide ממוקם בסמיכות הירידה היעד.</li>
		<li>להעביר את הקריסטל שנבחר מהמסירה המקורי לירידה cryoprotectant פתרון באמצעות הקפאה-לולאת ניילון על בסיס סטנדרטית השדרה רכוב על 39 , מטה מגנטי 40.</li>
		<li>העבר במהירות את הקריסטל מהמסירה cryoprotectant חנקן נוזלי, הצבת הלולאה אל המיקום הריק הראשון של בעל מדגם uni-פאק.</li>
		<li>חוזר (מתוך השלב לחתוך סרט איטום) עד כל הקריסטלים הרצויים נמצאים שנקטפו ומאוחסנים בעל מדגם uni-פאק.</li>
		<li>המקום uni-הדיסקוס לבסס על הדיסקית uni באמצעות מטה הדסקית ולקחת את הדיסקית הפרעות לקרן החלקיקים (בתנאים חנקן נוזלי). 
		התראה: מאוד נמוכה טמפרטורת!</li>
		<li>המלקחיים הקפאה ולהשתמש הדיסקית דיואר כלי הטעינה לטעון והאיגוד-puck(s) לתוך הרובוט מחלף מדגם הפרעות לקרן החלקיקים דיואר. בעל מדגם uni-פאק הם ינותקו מן המכסה הבסיס עוזב את בעלי לולאה דגימה זקוף ב הרובוט מדגם דיואר, ולכן חשופים החנקן הנוזלי ונגיש לרובוט מחלף דגימת.</li>
	</ol></li> <li>קריסטל אפיון הערה: אז יכול להיות מוקרן הקריסטלים שנקטפו לאיכות עקיפה באמצעות גם מקור רנטגן מעבדה או מקור רנטגן סינכרוטרון קרינה (SR). Beamlines macromolecular קריסטלוגרפיה (MX) מספקים מקור אנרגיה tunable לנצל עקיפה חריגה מבנה הפתרון. בסעיף הבא, סדרת הוראות עבודה בקו אחד עם היכולות ניסיוני של יהלום אור מקור MX beamlines מוצע, אבל קווים מנחים אלה ניתן גם להתאים beamlines MX-synchrotrons אחרים ברחבי העולם.
	<ol><li>כשלב ראשון, זה שימושי לאשר או לזהות חריגות scatterers בגביש. זה תושג בנוחות על ידי מדידת ספקטרום קרינה פלואורסצנטית רנטגן של הגביש. תחילה ודא אנרגית הרנטגן הפרעות לקרן החלקיקים שוכן גבוה מספיק כדי לעורר כל האלמנטים בדרך כלל צפוי עבור גבישים macromolecular (14 קוו ומעלה).</li>
		<li>להשתמש בתוכנה שליטה הפרעות לקרן החלקיקים כדי לבחור את הדגימה כדי להיות מותקן על ידי הרובוט מחלף מדגם; הלולאה ימורכז אוטומטית בקרן רנטגן, מרכוז קריסטל יכול להיות מאושרות באופן ידני באמצעות תוכנת שליטה הפרעות לקרן החלקיקים.</li>
		<li>שיא של ספקטרום קרינה פלואורסצנטית רנטגן הפרעות לקרן החלקיקים שליטה בתוכנות: המשתמש בוחר את זמן החשיפה של ויוזמת המדידה (הגדרה ספקטרום קרינה פלואורסצנטית/פלורסצנטיות, &#8594; לרוץ, איור 2A). תוכנת שליטה הפרעות לקרן החלקיקים עמדות באופן אוטומטי את תצלום הרנטגן גלאי קרינה פלואורסצנטית ב מקום וקובע את האירוע המינימלי רנטגן השטף כדי לקבל אות הניתן לקריאה על גלאי קרינה פלואורסצנטית. הקשת רכשה ואז ניתוח באופן אוטומטי עם פסגות פליטה מותאם באופן טבעי רכיבים ביולוגיים. רוטינות אלה הינם זמינים במרחק הפרעות לקרן החלקיקים שליטה תוכנה ממשק משתמש גרפי (GUI) - GDA (www.opengda.org) על החברה שלנו ועל synchrotrons ברחבי אירופה 41 , 42.</li>
		<li>אם אלמנטים מתאימים מזוהים זה אפשר לנצל בשביל ניסוי עקיפה חריגה, לבצע בסריקה אנרגיה קצה של ספיגת רנטגן כדי לקבוע את אורך הגל האופטימלי עבור איסוף נתונים עקיפה חריגה מן הגביש: על הפרעות לקרן החלקיקים לשלוט תוכנה, בחר את הרכיב, ליזום את הסריקה (זריחה/זריחה לסרוק הגדרה, &#8594; שם אטום, &#8594; לרוץ, איור 2B). 
		הערה: עבור ניסוי עקיפה חריג יחיד, הפסגה של הקצה הקליטה משמש כדי להגדיל את הפיזור חריגה. ניסיוני שיקולים לביצוע ניסוי עקיפה חריגה גל רב היה בעבר מפורט 43.</li>
		<li>כדי לקבוע את קריסטל יחידת התא בפרמטרים, סימטריה, מגבלת עקיפה, למדוד שלושה דפוסי קרני רנטגן במרווחי 45° בשיטת תנודה (אוסף נתונים/הקרנה &#8594; לרוץ הנוכחי, איור 2C). הפרעות לקרן החלקיקים בקרת התוכנה מספקת למשתמש בחירה של זווית תנודה זמן החשיפה, ואת היכולת להגדיר את השידור אחוז של קרן רנטגן. עבור הקרנה רגיל קריסטל, זווית תנודה של 0.5°, מועד החשיפה של 0.5 s, ו- 5% רנטגן קרן שידור מומלצים. תמונות דיפרקציה נמדד מנותחים באופן אוטומטי על-ידי הצבר עדנה ולחזור ערכה של אסטרטגיות עבור אוסף של נתונים מקיפה 22.</li>
	</ol></li> <li>רנטגן איסוף נתונים הערה: המשתמש יכול לבחור כדי לאסוף נתונים במצב תנודה רגיל או במצב קרן הפוך, המאפשרת פרידל החברים שיירשמו קרוב פעם והמנה רנטגן, ועם כ ההתנהגות הקליטה זהה המאפשר מדידה מדויקת יותר של הבדלים חריגה. האחרון הוא שימושי במיוחד אם צפויים הבדלים קטנים חריגה ו/או הדוגמאות הן קרינה רגיש בעת ביצוע ניסוי עקיפה חריגה. שיקולים על האסטרטגיות אוסף הנתונים הטוב ביותר לשימוש כבר באופן מקיף שנסקרה 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47. <ol><li>באמצעות תוכנת שליטה של הפרעות לקרן החלקיקים, לייבא את הפרמטרים אוסף נתונים כפי שהוצע על-ידי התוכנית אסטרטגיה אשר תספק: א מיקום התחלתי של הציר ω-סיבוב ii. רוחב תנודה ω-ציר הסיבוב זווית עבור כל תמונה עקיפה iii. זמן החשיפה עבור כל תמונה עקיפה הרביעי. מספר תמונות עבור dataset מלאה (הגדרת בעקיפין את זווית הסיבוב של ציר ω הכולל עבור אוסף הנתונים כולה) נ' אחוז הנחתה של קרן רנטגן כדי למנוע נזק חשיפת יתר וקרינה הערה: במוסד שלנו, עבור פועל על איסוף המידע, הצינורות תוכנה לעיבוד אוטומטי של הנתונים שנאספו מבוססים היטב: (i) עקיפה נתונים מופחתים (אינדקס משולב, שקנה המידה שלה השתנה) על-ידי הצבר xia2, אשר יוצרת קבצים mtz השתקפות של המשתמש כקלט עבור פתרון/עידון בהדרגה ומבנה 48. (ii) כאשר אות חריגה משמעותית ומתגלה במהלך ניתוח נתונים, הראשון מבנה אוטומטית מהירה פתרון צינור (fast_ep) באמצעות SHELX מנסה לפתור את המבנה התחתי אטום כבד על ידי ניסיוני בהדרגה, מתן מפת צפיפות אלקטרונים מדורג איפה ריאלי. צינור השני מבנה מקיף יותר פתרון מתחייב באופן אוטומטי ניסיונות לפתור ולבנות את structure באמצעות תוכנה עצמאיים סוויטות 49 , 50 , 51 , 52; במקרים בהם זה מוצלח, המשתמש תסופק עם מפת צפיפות הראשונית של מודל, אלקטרונים. זה מספק את הבסיס עבור המשתמש להשלים עידון ולאימות הדגם עם הסוויטות התוכנה לחקר הגבישים של בחירה-</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בנייר זה, אנו מתארים ולאמת פרוטוקול משולב פלואורסנציה פחמימות SBPs עם דגש ספציפי על חלבונים מ ס pneumoniaeהביוכימי ומבניים. עם זאת, ניתן להשתמש בתור תהליך סטנדרטי לניתוח של אחרים SBPs של אורגניזמים שונים, אפילו חלבונים מסיסים שאינם קשורים אחרים.
החלק הראשון של הפרוטוקול מתמקדת המספקים מידע ביוכימי על מבנה רבעוני, אשר אפשר לנצל כהכנה החלבון דוגמאות של התגבשות והיציבות של חלבון. במקטע מבחני shift תרמי, נתאר רק את ה-pH ווריאציות NaCl ריכוז כדי לשמור על האופי הכללי של הליך זה. למרות זאת, תנאים מאגר רבים אחרים יכול להיבדק באופן דומה, לדוגמה, כולל כל תרכובת כימית משמשים תוסף המייצב: בפרט ligand(s) בפועל זה לאגד SBP ספציפי עובדים בצורה ניכרת להגדיל את ה-Tm על ידי מעלות צלזיוס מספר31. במקרים מסוימים, עקומות denaturing ניתן להגדיר בצורה גרועה עקב אות נמוכה או רקע זריחה גבוהה, אשר נגרמת על ידי צבירת חלבון או התגלגלות חלקית. כדי למנוע זאת, ניתן לבצע טיטור חלבון: צבע כדי למטב את עקומות denaturing לא ברור. אם אין שיפור מתקבל, הקרנת תוספים שונים יכולים לשפר את היציבות של החלבון מומלץ, מסכי מתאים היה שתואר לעיל54.
בדרך כלל, רוב SBPs monomeric בסביבתם הטבעית, אך כפי שמוצג כאן multimerization יכול להתרחש בריכוזים גבוהים המשמשים התגבשות ניסויים, ובכך אפיון התנהגות oligomerization שסופקו על-ידי MALS ושל שניה זה חיוני כדי להעריך את המדינה oligomerization monodisperse יציב מאהדה ביותר עבור התגבשות עם זאת, קשה לחזות את השפעת כימיקלים שונים הכלולים במצב של התגבשות ההתנהגות oligomerization של החלבונים. אם בבדיקה שניה ו- MALS מציגה את מצבור נרחב של המדגם חלבון, היינו ממליצים הבאות כדי להפחית את הסבירות של התרחשות מעין זו: להשתמש במדגם חלבון טרי (לא להקפיא-הקרת) ולהרחיב את הניתוח מייצב לבצע תרמית מבחני shift, בדיקות תוספי אפשרי, דטרגנטים קלים כמוצא אחרון, כדי למזער את מצבור. בנייר זה, אנו מציגים הנחיות בסיסיות התגבשות באמצעות הקרנה מסחרית התגבשות מטריצה דלילה תפוקה גבוהה כדי לשמור על האופי הכללי של פרוטוקול זה. עם זאת, קבלת גבישי חלבונים ברזולוציה גבוהה רנטגן עקיפה ייתכן שיהיה עליך כוונון עדין האיטראטיבי לייעל את התנאים התגבשות ביחס ריכוז precipitant, pH, תוספת של תוספים כימיים, טמפרטורות שונות, ו גורמים אחרים המשתנים dynamics שיווי משקל בין קריסטל טיפה, מאגר16,17.
החלק השני של הפרוטוקול מתאר את האפיון של הקריסטלים חלבון על מנת להגדיר את האסטרטגיה האופטימלית עבור איסוף נתונים של קרני רנטגן עם דגש ספציפי על רכישת נתונים חריגה עבור בהדרגה עצוב. גם אם SBPs לשמור על ארכיטקטורת כללי דומה (ישנם מבנים תלת-ממד הופקדו רבות שעשויות להיות שימושיות כמתחילה מודלים), בהדרגה החלבונים האלה בשיטת החלפת מולקולרית אינה תמיד פשוטה בגלל ההשתנות של רכיבי מבנה שניוני, הגמישות מהותי של חלבונים אלו. לפיכך, אנו מציעה שיטת עצוב, להדגיש כי חלבונים אלה עשויים כבר ממהותם אוחזים מתכות או איגוד אכן לא ספציפית של מתכות מן התנאים מאגר התגבשות, אשר יכול לספק מגוון רחב של רכיבים diffracting חריגה שלב רגיל בפרוטוקול הכללית שלנו.
לסיכום, פרוטוקול זה מגדיר זרימת עבודה מודרכת סטנדרטי של נהלים המאפשרים את תיאור מפורט של התכונות הביוכימי ומבניים של SBPs שעלולים להיות מנוצלים לרעה כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של נחישות המבנה, כמו גם להאיץ אפיון מבניים של SBPs באופן כללי.

ס pneumoniae (pneumococcus) הוא חיידק גראם חיוביים המתגוררים asymptomatically את דרכי הנשימה העליונות של מערכת הנשימה האנושית עם היכולת להגר נישות סטרילי בדרך כלל גורם ספטיסמיה אלח-דם, דלקת ריאות, דלקת אוזניים, דלקת קרום המוח1,2. יתר על כן, זיהום pneumococcal הוא הגורם המוביל של דלקת ריאות שנרכשה בקהילה, אשר תורמת נטל קלינית וכלכלית ברחבי העולם3,4. זנים עמידים לאנטיביוטיקה של ס' pneumoniae התפשטו ברחבי העולם, למרות של שבע-עמודים ולנטיין ו 13-האהבה, בדיקת החלבון המצומד pneumococcal תרכיב חיסון סייעו להקטין את הקצב של עמידות מיקרוביאלית, החלפת זנים של השימוש בחיסון הופיעו, הובילו מוגברת למחקר לתוך לפיתוח טיפולים חדשים עבור המחלה pneumococcal5,6,7,8.
Pneumococcus תלוי סוכרים מיובאים מהמחשב המארח פחמן מקור9,10; אכן זה מקדיש שלושים אחוז שלה מכונות ייבוא להעברה של 32 פחמימות שונים11,12,13. יבואנים אלה כוללים ABC-מובילי לפחות שמונה13. ב- ABC מובילים, SBPs חוץ-תאית לשחק תפקיד מהותי בקביעת יחודיות עבור ליגנד והצגתו המשגר ממברנלי אינטגרלי עבור ספיגת בתא. SBPs מייצגים תקף מטרות על עיצוב האתר של חיסונים חדשים, antimicrobials כי הם פני שטח חלבונים ותפקידם חיוני תהליכים תאיים.
תיאור מפורט של תכונות מבניות, כמו כיסים ליגנד וגמישות עיבד, ואפיון של חלבונים היעד לספק כלי שימושי עבור תרופה המבוססת על מבנה עיצוב14,15. קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן היא שיטת הבחירה אפיון מבניים של חלבונים-קרוב ברזולוציה אטומית, אך תהליך התגבשות הוא בלתי צפוי, גוזלת זמן, לא תמיד מוצלח. שיטות שיטתית השתפרו שיעור ההצלחה והם גורמים חשובים הדגימה איכות ויציבות. שיעור ההצלחה של התגבשות מושפעת חלבון הכימיות ומתודולוגיה הכנת המדגם. ההשפעה של אלה יכול להיות מוערך, הודיע על ידי איפיון ביוכימי16,17.
סיבוך נוסף לעיצוב מבוסס על מבנה הבעיה שלב לחקר הגבישים, אשר יש להתייחס. כמו מבנים חלבונים נוספים הפכו זמינים, מבנים רבים יכולים להיפתר על ידי שיטת החלפת מולקולרית, המחייב של מבנה הומולוגי18. כפי SBPs להציג מבנה תחום גמיש, החלפת מולקולרית יוכיח גם מאתגר19. אם מודל מבנית דומה מספיק חלבון המטרה אינה זמינה, מספר טכניקות ניתן להשיג את phasing ניסיוני20. בין אלה, שיטת הפיזור חריג יחיד באורך הגל (SAD) התפתחה הטכניקה העיקרית, נעשה שימוש נרחב כדי לפתור את הבעיה של שלב21. השימוש בשיטת עצוב כבר מתקדמים עוד יותר עם שיפורים בחומרה, תוכנה, כמו גם אסטרטגיות אוסף נתונים כדי לאפשר את איתור ושימוש של אותות כמשוגעת חלש עבור בהדרגה22,23, 24. יתר על כן, מקדמות שיטות ישירות עבור פתרון מבנים של מקרומולקולות, שבעבר נדרש עקיפה נתונים ברזולוציה אטומית, יכול עכשיו להיות מנוצל על ידי שילוב הידע סטריאוכימיים לדוגמה, כפי ליישם את התוכנית ARCIMOLDO25. סקירה שימושית של שיטות לפתרון בעיית הפאזה ב קריסטלוגרפיה ניתנת על ידי טיילור26.
כאן אנו מציגים פרוטוקול rationalized עבור אפיון התעבורה פחמימות SBP, SP0092 של ס' pneumoniae, שילוב טכניקות הביוכימי ומבניים (איור 1). פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק מקרה מבחן דוגמא שימושית של אסטרטגיות כדי לשפר את שיעור ההצלחה של מחקרים מבניים על SBPs באופן כללי, אשר נמצאות כל הממלכות של החיים. בפרט, הפרוטוקול מדגיש את החשיבות של אפיון המדינה היציבה ביותר oligomeric של החלבון בתמיסה בשיטת מהיר ויעיל, ומאפשרת זיהוי המין הטוב ביותר לעקוב אחר לניסויים התגבשות. למרות שיש מעל 500 מבנים SBP דיווח של בנק מידע החלבונים27, החלפת מולקולרית עשויה להיות מאתגרת בשל אופיו גמיש הטבועה של שתי α/β קבוצות המחשבים, אשר מחוברים באמצעות אזור ציר19. לפיכך, החלק השני של הפרוטוקול מתאר שימוש בשיטת עצוב עבור בהדרגה ממאוגד יונים מתכתיים, אשר נפוץ ב SBPs, כמו גם שילוב של selenomethionine ושימוש של סלניום (Se) בהדרגה עצוב.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SelenoMethionine Medium Complete</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-500</td>
			<td>Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306737</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems&#174; 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Orange</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S6651</td>
			<td>SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4362143</td>
			<td>The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 increase 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN HELEOS II</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td></td>
			<td>DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 5/150 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28906561</td>
			<td>Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the &#34;increase&#34; version but this model is ideal for the standard day by day use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well &#34;Big&#34; Sitting Drop Crystallization Plate</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td>The 24 well &#34;big&#34; crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Pre-Crystallization Test</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR2-140</td>
			<td>The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6098xx</td>
			<td>Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td>The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Foam Dewar</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-35</td>
			<td>5.7&#34; diameter by 2.8&#34; deep. 800mL capacity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-955</td>
			<td>Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes&#8482; that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puck dewar loading tool</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td>This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092

פיתוח חדש antimicrobials חיסונים עבור pneumoniae סטרפטוקוקוס (pneumococcus) נחוצים לעצור את העלייה המהירה של זנים עמידים בפני מרובות. פחמימות המצע מחייב חלבונים (SBPs) מייצגים קיימא מטרות פיתוח חיסונים מבוססי חלבונים ו- antimicrobials חדש בגלל לוקליזציה חוץ-תאית שלהם ואת מרכזיותה של פחמימות ייבוא לחילוף החומרים pneumococcal, בהתאמה. המתוארים כאן הוא פרוטוקול משולב rationalized לבצע אפיון מקיף של SP0092, אשר ניתן להרחיב פחמימות אחרות, SBPs את pneumococcus, חיידקים אחרים. הליך זה יכול לסייע העיצוב מבוסס על מבנה של מעכבי עבור מחלקה זו של חלבונים. שהוצגו בחלק הראשון של כתב יד זה הפרוטוקולים עבור ניתוח הביוכימי לפי משמרת תרמי assay, ריבוי זווית פיזור אור (MALS), גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות), אשר למטב את היציבות, למזהים ייחודיים של הומוגניות של המדגם התגבשות ניסויים, וכך לשפר את ההסתברות להצלחה. החלק השני של הליך זה מתאר את האפיון של הקריסטלים SBP באמצעות של אורך גל tunable עקיפה חריגה סינכרוטרון הפרעות לקרן החלקיקים ופרוטוקולי אוסף נתונים עבור נתוני מדידה יכול לשמש כדי לפתור את החלבון מגובשת מבנה.

פרוטוקול משולב זה הוכח להיות מוצלח עם ארבעה (שניים לאור, שניים שלא פורסמו מבנים) של פחמימות 6 מחייב חלבון מטרות מן pneumococcus נותחו עד היום32,53. בחלק זה, אנו מציגים את אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 כתוצאה מכך נציג להנחות מחקרים מבנית של SBPs באופן כללי.
לאחר כבר הביע SP0092 SBP, מטוהרים כפי שהוגדר בעבר32, חלבון מטוהרים נותחו ליציבות מאגר שימוש assay shift תרמי: SP0092 תערוכות של מוגברת Tm ב- pH 6.5 ובפני NaCl 0 - 0.2 מ' טווח ריכוז (איור 3 א). לאור זאת, הפתרון מאגר עבור השלבים הבאים מוגדר כ: ז 0.02 נקודות MES pH 6.5, 0.2 מ' NaCl, 2.5% (v/v) גליצרול, 0.5 מ מ TCEP. המסה טוחנת מוחלטת של ארצות oligomerization שונים של SP0092 נמדדה על ידי MALS מצמידים שניה מדידת משקל מולקולרי של 187.2, 140.8, 97.0 49.4 kDa, המתאים tetrameric, trimeric, dimeric ו monomeric מינים, בהתאמה ( איור 3B). ניתוח הנתונים של הפרופיל שניה-חלבונים שונים דילולים גילה כי oligomerization המופעלת על-ידי ריכוז חלבון מוגברת, רומז כי oligomers גדולים יותר הם יציבים יותר בריכוזים גבוהים מאשר המשמש בדרך כלל התגבשות. אכן, המין oligomeric גדול מטוהרים למזהים ייחודיים של התגבשות ניסויים, חלבון המיוצר בהצלחה קריסטלים תוך מונומר של מינים לא.
הקריסטלים ממוטבת המתקבל הילידים, שכותרתו צורות של SP0092 Se-מתיונין התאפיינו קרני רנטגן. מדידה של פלואורסצנציה רנטגן של גבישים אלו חשף בשני המקרים פליטת פסגות עבור Zn המחויבות החלבון, בעוד Se זוהה רק עבור הקריסטלים Se-מתיונין כצפוי. מאוחר יותר, סריקות של הקליטה רנטגן בקצוות Se ו- Zn בוצעו, אשר סיפק מידע ניסויית ישירה לכוון את אורך הגל רנטגן התקרית לקצוות הקליטה רנטגן בהתאמה של Zn או Se נוכח הקריסטלים כדי למקסם את אות חריג השגה מתוך נתוני מערכת תוצאות (איור 4A–B).
לאחר מדידה שלוש תבניות עקיפה שידור נמוכה, ערכת נתונים חריגה מלאה הושג באמצעות איסוף נתונים האסטרטגיה שהוצעה על ידי עדנה (איור 4C). האות חריגה הנוכחי מעורר את הצינור phasing אוטומטיות-הפרעות לקרן החלקיקים לקבוע את מבנה תת, בהתבסס על שלבי הניסוי הראשוני נגזר, מפיק ראשי תיבות מפות ודגמים, אשר לאחר מכן ניתן מעודן לאמת (איור 4D ).
לסיכום, מוקשים פוטנציאליים של הטכניקה מרוכזים בעיקר על איכות וזמינות של קריסטל. אופטימיזציה של התנאים המאגר כדי לשפר את יציבות חלבון, כמו גם זיהוי של המדינה oligomeric המתאימים ביותר של החלבון לשימוש, כאשר אחד או יותר אוליגומר מזוהה בפתרון, יכולים להפחית את הסיכון של כשל ב התגבשויות שלב. ניצול השימוש מאוגד יונים מתכתיים לזהות בשלב מוקדם יכול להאיץ את מבנה הפתרון ולהימנע ייצור מיותרות של selenomethionine הנקרא חלבון כאשר שיטות מולקולרית החלפת נכשלים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
איור 1. תרשים של זרימת עבודה עבור איפיון ביוכימי ומבניים של פחמימות SBPs. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
באיור 2. אפיון קריסטל ב- GDA. צילום מסך של הכרטיסיה בקרת קרינה פלואורסצנטית רנטגן של תוכנת שליטה GDA הפרעות לקרן החלקיקים (A). צילום מסך של הכרטיסייה בקרת קצה-סריקה של אנרגיה קרני רנטגן ב- GDA (B). צילום מסך של הכרטיסיה ההקרנה קריסטל של אוסף נתונים ב- GDA (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
איור 3. איפיון ביוכימי של SP009239-491. (א) גרף תלת-ממד-פני התוויית את טמפרטורת ההיתוך של SP009239-491 כ פונקציה של רמת ה-pH וריכוז NaCl של הפתרון מאגר. תוצאות שניה (B) ו- MALS SP009239-491. הקליטה ב- 280 ננומטר מוצג בצבע כחול. ההמונים טוחנת של המדינות oligomerization שונים מוצגים באדום. לוח (B) שונה מ-32. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
באיור 4. אפיון מבניים של SP009239-491. (א) (B) רנטגן ספיגת אנרגיה לסרוק בקצה Zn ו- Se עבור גבישים39-491 SP0092. קרינה פלואורסצנטית נמדד Zn, Se המכיל קריסטלים מוצג כחול, תכלת, האותיות המחושבים ' ו- f "פיזור חריגה שברים הם ירוק ואדום, בהתאמה. (ג) דוגמאות של קרני רנטגן דפוסי אסף מקריסטלים39-491 SP0092. (ד) קריקטורה ייצוג של מבנה דיימר39-491 SP0092. Protomer אחד בצבע אחר מגנטה (שאריות 39-366) ואת ויולט (שאריות 367-491), האטומים פיזור חריגה מוצגים כדורים כחולים, ציאן Zn, Se, בהתאמה. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.1 M חומצה ציטרית pH 4.0</td>
			<td>0.1 M חומצה ציטרית pH 4.5</td>
			<td>0.1 M פוספט pH 5.0</td>
			<td>0.1 M ציטראט pH 5.5</td>
			<td>0.1 M Bis-טריס pH 6</td>
			<td>0.1 מ' עדה pH 6.5</td>
			<td>0.1 M MOPS pH 7</td>
			<td>0.1 M HEPES pH 7.5</td>
			<td>0.1 M Imidazole pH 8.0</td>
			<td>0.1 M טריס pH 8.5</td>
			<td>0.1 pH צ'ז M 9</td>
			<td>0.1 M צ'ז pH 9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl 0.1 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.2 מ'</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.5 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
	

טבלה 1. מאגר הרכב עבור shift תרמי וזמינותו.

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092 at JoVE.com

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

פרוטוקול יעילה לביצוע הביוכימי ומבניים נרחב של איפיון פרוטאין מחייב המצע פחמימות של סטרפטוקוקוס pneumoniae מוצג.

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

biochemical-structural-characterization-carbohydrate-transport

Research

JoVE Journal

Biochemistry

29.7K Views.  Harwell Science & Innovation Campus. פרוטוקול יעילה לביצוע הביוכימי ומבניים נרחב של איפיון פרוטאין מחייב המצע פחמימות של סטרפטוקוקוס pneumoniae מוצג.

Video: Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural information, typically obtained by crystallography; however MPs are difficult to crystallize. Recent progress in MP structural determination has benefited greatly from the development of lipidic cubic phase (LCP) crystallization methods, which typically yield well-diffracting, but often small crystals that suffer from radiation damage during traditional crystallographic data collection at synchrotron sources. The development of new-generation X-ray free-electron laser (XFEL) sources that produce extremely bright femtosecond pulses has enabled room temperature data collection from microcrystals with no or negligible radiation damage. Our recent efforts in combining LCP technology with serial femtosecond crystallography (LCP-SFX) have resulted in high-resolution structures of several human G protein-coupled receptors, which represent a notoriously difficult target for structure determination. In the LCP-SFX technique, LCP is recruited as a matrix for both growth and delivery of MP microcrystals to the intersection of the injector stream with an XFEL beam for crystallographic data collection. It has been demonstrated that LCP-SFX can substantially improve the diffraction resolution when only sub-10 &#181;m crystals are available, or when the use of smaller crystals at room temperature can overcome various problems associated with larger cryocooled crystals, such as accumulation of defects, high mosaicity and cryocooling artifacts. Future advancements in X-ray sources and detector technologies should make serial crystallography highly attractive and practicable for implementation not only at XFELs, but also at more accessible synchrotron beamlines. Here we present detailed visual protocols for the preparation, characterization and delivery of microcrystals in LCP for serial crystallography experiments. These protocols include methods for conducting crystallization experiments in syringes, detecting and characterizing the crystal samples, optimizing crystal density, loading microcrystal laden LCP into the injector device and delivering the sample to the beam for data collection.

We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in human pathology and other biochemical contexts. In order to perform characterization of protein deamidation, we have recently developed a novel long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method which can separate the glutamine (Gln) and asparagine (Asn) isoform products of deamidation from model compounds to highly complex biological samples. LERLIC-MS/MS is, therefore, the first shotgun proteomics strategy for the separation and quantification of Gln deamidation isoforms. We also demonstrate, as a novelty, that the sample processing protocol outlined here stabilizes the succinimide intermediate allowing its characterization by LERLIC-MS/MS. Application of LERLIC-MS/MS as shown in this video article can help to elucidate the currently unknown molecular arrays of protein deamidation. Additionally, LERLIC-MS/MS provides further understanding of the enzymatic reactions that encompass deamidation in distinct biological backgrounds.

Here we present a step-by-step protocol of the long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method. This is a novel methodology that enables for the first time quantification and characterization of the glutamine and asparagine deamidation isoforms by shotgun proteomics.

LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts of purified material. Here, we describe a simple method for gaining detailed polysaccharide structural information, including resolution of structural isomers. For polysaccharide analysis by gel electrophoresis (PACE), plant cell wall material is hydrolyzed with glycosyl hydrolases specific to the polysaccharide of interest (e.g., mannanases for mannan). Large format polyacrylamide gels are then used to separate the released oligosaccharides, which have been fluorescently labeled. Gels can be visualized with a modified gel imaging system (see Table of Materials). The resulting oligosaccharide fingerprint can either be compared qualitatively or, with replication, quantitatively. Linkage and branching information can be established using additional glycosyl hydrolases (e.g., mannosidases and galactosidases). Whilst this protocol describes a method for analyzing glucomannan structure, it can be applied to any polysaccharide for which characterized glycosyl hydrolases exist. Alternatively, it can be used to characterize novel glycosyl hydrolases using defined polysaccharide substrates.

A protocol for the structural analysis of polysaccharides by gel electrophoresis (PACE), using mannan as an example, is described.

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for even the most challenging projects in structural biology. However, most facilities still require the presence of a scientist on site to perform the experiments. A new generation of automated beamlines dedicated to the fully automatic characterization of, and data collection from, crystals of biological macromolecules has recently been developed. These beamlines represent a new tool for structural biologists to screen the results of initial crystallization trials and/or the collection of large numbers of diffraction data sets, without users having to control the beamline themselves. Here we show how to set up an experiment for automatic screening and data collection, how an experiment is performed at the beamline, how the resulting data sets are processed, and how, when possible, the crystal structure of the biological macromolecule is solved.

Here, we describe how to use the automated screening and data collection options available at some synchrotron beamlines. Scientists send cryocooled samples to the synchrotron, and the diffraction properties are screened, the data sets are collected and processed and, where possible, a structure solution is carried out&#8212;all without human intervention.

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination of the high-specificity separation technique IEX with the accurate molar mass analysis achieved by MALS allows the characterization of heterogeneous protein samples, including mixtures of oligomeric forms or protein populations, even with very similar molar masses. Therefore, IEX-MALS provides an additional level of protein characterization and is complementary to the standard size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) technique.
Here we describe a protocol for a basic IEX-MALS experiment and demonstrate this method on bovine serum albumin (BSA). IEX separates BSA to its oligomeric forms allowing a molar mass analysis by MALS of each individual form. Optimization of an IEX-MALS experiment is also presented and demonstrated on BSA, achieving excellent separation between BSA monomers and larger oligomers. IEX-MALS is a valuable technique for protein quality assessment since it provides both fine separation and molar mass determination of multiple protein species that exist in a sample.

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

This protocol describes the use of high-specificity ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering for an accurate molar mass determination of proteins, protein complexes, and peptides in a heterogeneous sample. This method is valuable for quality assessment, as well as for the characterization of native oligomers, charge variants, and mixed-protein samples.

יונים כרומטוגרפיה (IEX) מצמידים מרובה זווית פיזור אור (MALS) עבור חלבון הפרדה ואפיון

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The identification and characterization of these biomolecules can improve knowledge about their secretion pathways and help to manipulate them. Furthermore, some of these biomolecules are also interesting in terms of biotechnological applications. Described here are two protocols for easy and rapid isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins. The method for isolation of released carbohydrate polymers is based on conventional precipitation techniques of polysaccharides in aqueous solutions using organic solvents. This method preserves the characteristics of the polymer and simultaneously avoids the presence of contaminants from cell debris and culture medium. At the end of the process, the lyophilized polymer is ready to be used or characterized or can be subjected to further rounds of purification, depending on the final intended use. Regarding the isolation of the cyanobacterial exoproteome, the technique is based on the concentration of the cell-free medium after removal of the major contaminants by centrifugation and filtration. This strategy allows for reliable isolation of proteins that reach the extracellular milieu via membrane transporters or outer membrane vesicles. These proteins can be subsequently identified using standard mass spectrometry techniques. The protocols presented here can be applied not only to a wide range of cyanobacteria, but also to other bacterial strains. Furthermore, these procedures can be easily tailored according to the final use of the products, purity degree required, and bacterial strain.

Here, protocols for the isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and isolation of their exoproteomes are described. Both procedures embody key steps to obtain polymers or proteins with high purity degrees that can be used for further analysis or applications. They can also be easily adapted according to specific user needs.

מבט כלפי חוץ: בידוד של Cyanobacterial שוחרר פולימרים פחמימות וחלבונים

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...