Wir erkennen OPPF-UK für Hilfe beim Klonen, Gemma Harris für SEC-MALLS und die Wissenschaftler Beamlines I03 und I04 bei Diamond Light Source.

Hinweis: die kodierende Sequenz, für die das Signalpeptid gelöscht, wird im Anschluss an eine standard-Fusion-Protokoll pOPINF Vektor geklont; das native Protein wird als eine His-Tag-Fusion in Escherichia coli BL21 Rosetta Zellen ausgedrückt 28 , 29. die Variante mit der Bezeichnung Selenomethionin drückt sich nach Standardmethoden laut Hersteller 30. Die rekombinante SBP ist wie zuvor gereinigt beschrieben 31 , 32.
 1. biochemische Charakterisierung <ol><li>thermische Verschiebung Assay <ol><li>bereiten 48 Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 4.0 bis zu 9,5 und NaCl-Konzentration von 0 bis 0,5 M und 40 µL in eine 96-Well-Platte zu verzichten, wie in beschrieben Tabelle 1 33.</li> <li>verleihen jedem gut 5 µL der SBP Lösung in 1-2 mg/mL Konzentration.</li>
		<li>Verleihen jedem gut 5 µL 20 x fluoreszierende Fleck für Proteine (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Mischen die Lösungen durch pipettieren, Dichtplatte mit einer transparenten Klebefolie und spin für 2 min bei 112 X g bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Führen Sie das Experiment auf einer Echtzeit-Maschine: Rampen-Temperatur von 3 ° C/min von 4 bis 99 ° C mit einem 10 s Haltezeit eingestellt, und lesen Sie der Fluoreszenz jeder 0,5 ° C mit Erregung bei 483 nm und Emission bei 568 nm.</li>
		<li>Analysieren die Fluoreszenz-Emission-Kurven für jeden Puffer Zustand, die Schmelztemperatur (T m) als das Minimum der Ableitung zu identifizieren. 
		Hinweis: Diese Prozedur gibt einen guten Überblick über die besten Pufferlösung zur Verbesserung der Proteinstabilität Unterstützung. Wählen Sie den pH-Bereich und die Salzkonzentration auf der Grundlage der Puffer Bedingung mit der höchsten T-m und Hinzufügen von 2,5 % (V/V) Glycerin und 0,5 mM tris(2-carboxyethyl) Phosphin (DÄMMUND) zu definieren, die Pufferlösung für die folgenden Schritte (SEC-Puffer).</li>
	</ol></li> <li>MALS und analytische SEC <ol><li>führen Sie eine zweispaltige Volumen Waschen der abgepackten Gel Filtration Spalte mit entgastem gefiltertes Wasser (verwenden Sie eine breite Palette Molekulargewicht 24 mL Spalte).</li>
		<li>Verbinden Sie die Spalte mit der Lichtstreuung-Detektor und die Spalte mit dem ermittelten SEC-Puffer von der thermischen Shift-Test equilibrate.</li>
		<li>Injizieren 100 µL der gereinigten SBP bei 5 mg/mL in das äquilibriert SEC Spalte und Flow eine Spalte Volumen der SEC-Puffer.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Elution Chromatogramm für einzelne oder mehrere Gipfel und die Streuung Daten mit Hilfe der Analysesoftware, Erlangung der molaren Masse und der Polydispersität Index für alle Tierarten. 
		Hinweis: Für jeden Peak als Oligomere Art entspricht, es ist vorteilhaft für die Polydispersität prüfen Index berechnet als molare Masse auf Masse/molare Masse gewichtete Anzahl der Moleküle (Mw/Mn) gewichtet. Ein Polydispersität Wert nahe bei 1 zeigt einen Prozess Höhepunkt. 
		Hinweis: Sobald die Oligomerisierung Arten definiert werden, es empfiehlt sich, ihre Abhängigkeit von Proteinkonzentration, studieren wie höhere Konzentrationen größer Oligomer Bildung begünstigen könnte.</li>
		<li>Führen Sie mehrere analytische SEC läuft; 100 µL der gereinigten SBP bei steigenden Konzentrationen (0,1 - 10 mg/mL) in die äquilibriert Gel Filtration Spalte (verwenden Sie eine breite Palette Molekulargewicht 5 mL Spalte) zu injizieren und fließen eine Spalte Volumen von SEC-Puffer jedesmal.</li>
		<li>Der Elution Chromatogramm für einzelne oder mehrere Gipfel prüfen und analysieren die Intensitäten der Absorption bei 280 nm der Kurven, verschiedene Start Proteinkonzentrationen entspricht. Wenn die relative Intensität der verschiedenen Peaks konstant bleiben, ist keine inter Konvertierung zwischen den Oligomeren Arten vorhanden. Variation in der relativen Intensitäten bei verschiedenen Konzentrationen ist ein Indiz für den Wechsel zwischen den verschiedenen Oligomeren Spezies, die Konzentration des Proteins abhängig ist. 
		Hinweis: Dieser Schritt Charakterisierung ist von grundlegender Bedeutung zu definieren, welche Arten für Kristallisation besser geeignet sind. In der Tat unterschiedliche Prozess Arten sind anfälliger für kristallisieren, wenn sie in einem stetigen Oligomere Zustand in einer definierten Konzentration sind.</li>
	</ol></li></ol> 2. Protein-Vorbereitung und Kristallisation <ol><li>präparative SEC <ol><li>nach einer Spalte Volumen waschen mit entgastem gefiltertes Wasser, equilibrate mit SEC-Puffer die präparativen vorverpackte Gel Filtration Spalte (zahlreiche molekulare Gewicht 120 mL Spalte).</li>
		<li>Injizieren 1-5 mL gereinigtes SBP bei 5-50 mg/mL in der äquilibriert Gel Filtration Spalte und Strömung eine Spalte Volumen von SEC-Puffer.</li>
		<li>Der Spalte Durchflussverfahren in 1 mL Fraktionen sammeln.</li>
		<li>Bündeln die Fraktionen entsprechend zu einer einzigen Monodisperse Spitze; drehen Sie die Probe in 15 mL Zentrifugation Filter bei 1.500 g und die Konzentration zu quantifizieren, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist (in der Regel 50-100 mg/mL für SP0092).</li>
	</ol></li> <li>Kristallisation <ol><li>bestimmen die optimale Konzentrationsbereich für die Kristallisation Experiment mit der Pre-Kristallisation zu testen, wie vom Hersteller beschrieben: <ol><li>Dispense 0,5 - 1,0 mL eines jeden der vier Kristallisation Test Lösungen in einem anderen Behälter einer 24-Well-Sitzung fallen Kristallisation Platte.</li>
			<li>Bereiten die Kristallisation Tropfen durch das Mischen von 1 µL Proteinlösung mit 1 µL Reservoir-Lösung, die Dichtplatte und Inkubation bei Raumtemperatur für nicht weniger als 1 h (zuverlässigere Ergebnisse nach der Inkubation über Nacht).</li>
			<li>Prüfen Sie die Drop-Qualität für jede Konzentration mit einem 10-fach Vergrößerung Mikroskop. 
			Hinweis: Testen Sie mindestens drei verschiedene Proteinkonzentration: (I) die meisten der verbleibenden klare Tropfen zeigen, dass das Protein zu verdünnen für Kristallisation; (II) die Anwesenheit des schweren Niederschlags in der Mehrzahl der Tropfen impliziert eine übermäßig hohe Konzentration; und (III) eine ausgewogene Auftreten von klaren Tropfen und Niederschlag (besser, wenn das Licht) ist ein guter Indikator, dass die getestete Konzentration günstig für die Kristallisation ist.</li>
		</ol></li> <li>Bereiten die 96-Well-Sitzung Drop Kristallisation Platten; 100 µL der verschiedenen kommerziellen Kristallisation Lösung in jedem Behälter gut 34 , 35 , zu verzichten 36 , 37.</li> <li>verzichten 100 nL Protein Probe bei der zuvor definierten Konzentration (Schritt 1.1.6) in alle Kristallisation Drop Brunnen mit einem Robotersystem Kristallisation.</li>
		<li>Verzichten 100 nL des verschiedenen Reservoirs Lösungen für die entsprechenden Kristallisation fallen Brunnen mit Protein verzichtet in Schritt 2.2.3 mischen. Die Kristallisation Dichtplatte, um Verdunstung zu vermeiden und ermöglichen die Gleichgewichtherstellung der Kristallisation Tropfen mit dem Reservoir.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Tropfen in regelmäßigen Abständen (anfangs alle 1-2 Tage, später wöchentlich) mit einem 10 X (mindestens) Vergrößerung Mikroskop Kristallbildung und Wachstum bewerten. 
		Hinweis: Fällt ein automatisiertes imaging System für Protein Kristallisation verwendet werden, für die kann Visualisierung und Erfassung.</li>
	</ol></li></ol> 3. Kristall-Charakterisierung und Röntgen-Datensammlung <ol><li>Kristall Montage <ol><li>bereiten die Kryoprotektivum Lösung durch Zugabe von 25 % (V/V) Glycerin (Endkonzentration) zur Kristallisation Bedingung (also als Ersatz für 25 % des Wassers in der ersten Gemisch) 38.</li>
		<li>Füllen einen Schaum Dewar mit flüssigem Stickstoff und Gehäuse Musterteil ein Uni-Puck in der Dewar. Flüssigem Stickstoff Temperatur abkühlen lassen.</li>
		<li>Ausschneiden und entfernen die Abdichtung mit Klebeband von der Kristallisation Platte über die Tropfen, wo die Kristalle gebildet werden.</li>
		<li>Geben Sie einen Tropfen von 1 µL Kryoprotektivum Lösung auf eine Coverslide in der Nähe des Ziel-Drop positioniert.</li>
		<li>Übertragen die ausgewählten Kristall aus dem ursprünglichen Drop auf das Kryoprotektivum Lösung Tropfen mit einer Nylon-Cryo-Schleife auf eine Wirbelsäule Standardbasis montiert auf einem magnetischen Zauberstab 39 , 40.</li>
		<li>Den Kristall aus dem Kryoprotektivum Drop schnell zu übertragen, zu flüssigem Stickstoff, indem die Schleife in die erste leere Position von der Uni-Puck-Probenhalter.</li>
		<li>(Von der Abdichtung Band geschnittenen Schritt) zu wiederholen, bis alle gewünschten Kristalle sind geerntet und in der Uni-Puck-Probenhalter gespeichert.</li>
		<li>Ort der Uni-Puck basieren auf den Uni-Puck mit dem Puck Zauberstab und nehmen den Puck in das Strahlrohr (unter flüssigem Stickstoff Bedingungen). 
		Vorsicht: Extrem niedrige Temperatur!</li>
		<li>Verwenden die Cryo-Zange und den Puck Dewar laden Tool der Uni laden-Puck(s) in das Strahlrohr Probe Wechsler Roboter Dewar. Der Uni-Puck-Probenhalter löst sich vom verlassen der Schleife Probenhalter aufrecht in der Probe Roboter Basis Deckel Dewar und damit der flüssige Stickstoff ausgesetzt und der Probe Wechsler Roboter zugänglich.</li>
	</ol></li> <li>Kristall Charakterisierung Hinweis: die geernteten Kristalle können dann gesiebt, Beugung Qualität verwenden entweder eine Labor Röntgenquelle oder eine Röntgenquelle Synchrotronstrahlung (SR). Makromolekularen Kristallographie (MX) Beamlines bieten eine einstellbaren Energiequelle um anomale Beugung für Struktur-Lösung zu nutzen. Im folgenden Abschnitt eine Reihe von Arbeitsanweisungen in Übereinstimmung mit den experimentellen Fähigkeiten von Diamond Light Source MX Beamlines vorgeschlagen, aber diese Richtlinien können auch MX Beamlines an anderen Synchrotrone weltweit angepasst werden.
	<ol><li>Als ein erster Schritt ist es sinnvoll, entweder bestätigen oder anomalen Streusignal im Kristall zu identifizieren. Dies kann bequem erreicht werden, durch die Messung eine Fluoreszenz Röntgenspektrum aus Kristall. Zunächst sicherstellen, dass die Röntgenenergie das Strahlrohr ist hoch genug, um alle Elemente in der Regel erwartet für makromolekulare Kristalle begeistern eingestellt (14 keV oder höher).</li>
		<li>Verwenden die Strahlrohr-Steuerungs-Software, die Stichprobe der Probe Wechsler Roboter montiert werden; die Schleife wird automatisch zentriert in der Röntgenstrahl und Zentrierung der Kristall kann manuell über die Steuerungssoftware Strahlrohr bestätigt werden.</li>
		<li>Aufzeichnen ein Röntgenspektrum Fluoreszenz mit dem Strahlrohr-Steuerungs-Software: der Benutzer wählt eine Belichtungszeit und initiiert die Messung (Fluoreszenz/Fluoreszenz-Spektrum-Einstellung, &#8594; laufen, Abb. 2A). Die Steuerungssoftware Strahlrohr positioniert automatisch das Röntgen Fluoreszenz-Detektor im Ort und bestimmt die minimale Vorfall x-ray Flux um eine lesbare Signal auf der Fluoreszenz-Detektor zu erhalten. Das erworbene Spektrum wird dann analysiert in einer automatisierten Weise mit Emission Spitzen ausgestattet, um natürlich vorkommende biologische Elemente. Diese Routinen sind in das Strahlrohr Control Software grafische Benutzeroberfläche (GUI) - GDA (www.opengda.org) an unserer Firma und an Synchrotrons in ganz Europa 41 , 42.</li>
		<li>, Wenn geeignete Elemente identifiziert werden, die für eine anomale Beugung Experiment ausgenutzt werden kann, führen Sie einen x-ray Absorption Rand Energie Scan ermitteln die optimale Wellenlänge für anomale Beugung Datenerhebung aus dem Crystal: auf das Strahlrohr Steuerungs-Software, wählen Sie das Element und den Scan zu initiieren (Fluoreszenz/Fluoreszenz-Scan-Einstellung, &#8594; Atom Namen &#8594; laufen, Abb. 2 b). 
		Hinweis: Für ein einzelnes anomale Beugung-Experiment, dem Höhepunkt der Absorptionskante dient die anomale Streuung zu maximieren. Experimentelle Überlegungen zur Durchführung einer Multi-Wellenlänge anomale Beugung Experiments wurden bereits detaillierte 43.</li>
		<li>Zu bestimmen, die Kristall-Einheit Zellenparameter, die Symmetrie und die Beugungsgrenze, Messen drei x-ray Diffraction Muster in 45° Abständen mit der Oszillation-Methode (Data Collection/Screening &#8594; laufen aktuelle, Abbildung 2). Die Strahlrohr-Steuerungs-Software bietet dem Anwender mit einer Auswahl der Oszillation Winkel und Belichtungszeit und die Möglichkeit, die prozentuale Übertragung der Röntgenstrahl festzulegen. Ein standard-Quarz-Screening Oszillation Winkel von 0,5 °, eine Belichtungszeit von 0,5 s und 5 % Röntgentransmission Strahl empfohlen. Die gemessenen Beugung-Bilder werden automatisch analysiert, indem die EDNA-Pipeline und wieder eine Reihe von Strategien für die Sammlung von einem vollständigen Datensatz 22.</li>
	</ol></li> <li>X-ray Datensammlung Hinweis: der Benutzer kann auswählen, sammeln Daten im standard Oszillation oder inverse Strahl Modus, wodurch Friedel Kumpels schließen in Zeit und Strahlendosis und mit etwa der gleichen Absorptionsverhalten aufgezeichnet werden ermöglicht eine genauere Messung der anomalen Unterschiede. Letzteres ist nützlich, besonders wenn kleine anomale Unterschiede dürften und/oder die Proben Strahlung empfindlich sind bei der Durchführung einer anomalen Beugung-Experiment. Überlegungen über die besten Daten-Sammlung-Strategien verwenden wurden umfassend überarbeitete 22 , 23 , 44 , 45 , 46 , 47. <ol><li>mit dem Strahlrohr Steuerungssoftware importieren Daten Auflistung Parameter wie das Strategieprogramm, das zur Verfügung stellt: i. Startposition der ω-Drehachse Ii. Oszillation Breite der ω-Achse Drehung Winkel für jedes Bild Beugung Iii. Belichtungszeit für jedes Bild Beugung iv. Anzahl der Bilder für ein komplettes Dataset (indirekt Definition des gesamten ω-Achse Drehwinkels für die gesamte Datensammlung) v. Prozentsatz der Dämpfung der Röntgenstrahl auf Überbelichtung und Strahlung Schäden zu vermeiden Hinweis: an unserem Institut für ausgeführt wird die Datensammlung, die Software-Pipelines für die automatisierte Verarbeitung der gesammelten Daten etabliert sind: (i) die Beugung Daten sinken (indiziert, integrierte und skalierte) von der xia2-Pipeline, erzeugt die Reflexion Mtz-Dateien für den Benutzer als Input für Ausstieg und Struktur Lösung/Verfeinerung 48. (Ii) Wenn ein signifikantes anomales Signal erkannt wird während der Datenanalyse, eine erste schnelle automatisierte Struktur Lösung Pipeline (Fast_ep) mit SHELX Versuche, die die schweren Atom-Unterkonstruktion durch experimentelle Ausstieg, eine stufenweise Elektron Dichte Karte soweit möglich. Eine zweite umfassendere Struktur Lösung Pipeline verpflichtet sich automatisch versuchen zu lösen und die Structu bauenRe mit unabhängigen Software-Suiten 49 , 50 , 51 , 52; in Fällen, wo dies erfolgreich ist, wird der Benutzer mit einer anfänglichen Modell und Elektron Dichtekarte bereitgestellt werden. Dies bildet die Grundlage für den Benutzer Verfeinerung und bestätigen das Modell mit der kristallographischen Softwarepakete Wahl.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Papier wir beschreiben und eine integrierte Protokoll für biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat SBPs mit besonderem Schwerpunkt auf Proteine von S. Pneumoniaezu validieren. Dennoch kann dies als Standardverfahren für die Analyse von anderen SBPs von verschiedenen Organismen und auch andere unabhängige lösliche Proteine verwendet werden.
Der erste Teil des Protokolls konzentriert sich auf die biochemischen Informationen über Proteinstabilität und quartäre Struktur, die bei der Vorbereitung der Proteinproben für Kristallisation ausgenutzt werden können. Im Bereich thermische Verschiebung Assays beschreiben wir nur den pH-Wert und NaCl-Konzentration-Variationen zu den allgemeinen Charakter dieses Verfahrens zu erhalten. Trotz dieser, viele andere Pufferbedingungen können getestet werden in ähnlicher Weise, z. B. einschließlich chemische Verbindung, die als ein stabilisierendes Additiv verwendet: insbesondere die tatsächliche Ligand(s), die an einem bestimmten SBP binden sind besonders wirksam bei der Erhöhung der Tm von wenigen Grad Celsius31. In einigen Fällen können die denaturierenden Kurven schlecht definiert werden, durch low-Signal oder eine hohe Fluoreszenz-Hintergrund, hervorgerufen durch Proteinaggregation oder partielle Entfaltung. Um dies zu vermeiden, kann ein Protein: Farbstoff Titration durchgeführt werden, um die unklaren denaturierenden Kurven zu optimieren. Wenn keine Besserung erreicht wird, empfiehlt sich die screening-verschiedene Zusatzstoffe, die die Stabilität des Proteins zu verbessern, können und geeignete Bildschirme wurden zuvor beschriebenen54.
In der Regel die meisten SBPs sind Monomere in ihrer natürlichen Umgebung, aber wie hier gezeigt, dass Multimerization in den höheren Konzentrationen Kristallisation Experimente auftreten kann, so ist die Oligomerisierung Verhalten Charakterisierung von MALS und SEC zur Verfügung gestellt wesentlich für den günstigsten stabile Monodisperse Oligomerisierung stand für Kristallisation zu bewerten. Dennoch ist es schwer vorherzusagen, die Wirkung von verschiedenen Chemikalien in die Kristallisation Bedingung auf die Oligomerisierung Verhalten der Proteine enthalten. Wenn die SEC und MALS Prüfung umfangreiche Ansammlung von der Protein-Probe zeigt, empfehlen wir die folgenden zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit dieses auftritt: verwenden Sie frische Eiweiß-Beispiel (nicht einfrieren aufgetaut) und erweitern die durchgeführte mit thermischen Stabilisierung-Analyse Shift-Assays, Tests möglich Zusatzstoffe und milde Reinigungsmittel als letztes Mittel, um Aggregation zu minimieren. In diesem Papier stellen wir grundlegende Richtlinien für die Kristallisation mit Hochdurchsatz-dünnbesetzte Matrix kommerzielle Kristallisation Screening auf um den allgemeinen Charakter dieses Protokolls zu erhalten. Jedoch erhalten hochauflösende Röntgenbeugung Proteinkristallen möglicherweise iterative Feinabstimmung um die Kristallisation Bedingungen bezüglich Fällungsmittel Konzentration, pH-Wert, Zusatz von chemischen Zusätzen, unterschiedliche Temperaturen, zu optimieren und andere Faktoren, die sich verändernde Gleichgewicht Dynamik zwischen den Kristall Tropfen und Stausee16,17.
Der zweite Teil des Protokolls beschreibt die Charakterisierung von Proteinkristallen um die optimale Strategie für x-ray Diffraction Datenerfassung mit einem besonderen Schwerpunkt auf den Erwerb der anomale Daten für traurige Ausstieg zu definieren. Auch wenn SBPs eine ähnliche allgemeine Architektur pflegen (und es viele hinterlegte 3D Strukturen potenziell nutzbare gibt als Ausgangspunkt Modelle), Ausstieg dieser Proteine durch die molekulare Ersetzungsmethode ist nicht immer einfach aufgrund der Variabilität von der Elemente der Sekundärstruktur und die innere Flexibilität dieser Proteine. Daher, wir schlagen die traurige Methode und betonen, dass diese Proteine bereits intrinsisch Metalle oder in der Tat unspezifische Bindung von Metallen aus der Kristallisation Pufferbedingungen gebunden haben kann die eine Palette von anomalen Interferenzgitters Elemente wie anbieten kann eine Standard-Schritt in unserer allgemeinen Protokolls.
Zusammenfassend, definiert dieses Protokoll einen standard geführte Workflow Verfahren ermöglicht die detaillierte Beschreibung der biochemischen und strukturellen Merkmale der SBPs, die ausgenutzt werden können, um die Struktur Entschlossenheit Erfolgsquote zu erhöhen, als auch zu beschleunigen die strukturelle Charakterisierung der SBPs im Allgemeinen.

Streptococcus Pneumoniae (Pneumokokken) ist ein Gram-positiven Bakterium mit Wohnsitz asymptomatisch in den oberen Luftwegen der menschlichen Atemwege mit der Fähigkeit, normalerweise sterilen Nischen verursacht Otitis, Lungenentzündung, Sepsis, Blutvergiftung, Migration und Meningitis1,2. Pneumokokken-Infektion ist übrigens die häufigste Ursache für ambulant erworbener Pneumonie, die zu einer klinischen und wirtschaftlichen Belastung weltweit3,4beiträgt. Antibiotika-resistente Stämme von S. Pneumoniae rund um den Globus ausgebreitet haben und obwohl eine sieben-Valent und ein 13-Valent Pneumokokken Protein konjugierte Impfstoff geholfen haben reduzieren die Rate von Antibiotikaresistenzen, Ersatz-Stämme aus Impfstoff sind entstanden und führten zu erhöhten Anforderungen für die Forschung in der Entwicklung von neuen Therapien gegen Pneumokokken-Erkrankungen5,6,7,8.
Die Pneumokokken hängt von Zucker aus den Host als CO2-Quelle9,10importiert; in der Tat wendet es 30 % seiner Import Maschinen für den Transport von 32 verschiedenen Kohlenhydrate11,12,13. Diese Importeure sind mindestens acht ABC-Transportern13. In ABC-Transporter spielen die extrazelluläre SBPs eine wesentliche Rolle bei der Bestimmung der Spezifität für die Liganden und fester Membran-Transporter für die Aufnahme in die Zelle zu präsentieren. SBPs repräsentieren gültige Ziele für die Gestaltung von neuen Impfstoffen und Antibiotika, weil sie Oberflächenproteine und ihre entscheidende Rolle bei der zellulären Prozesse sind.
Ziel Protein Charakterisierung und detaillierte Beschreibung der strukturellen Merkmale wie Liganden Taschen und domänenübergreifendes Flexibilität bieten ein nützliches Werkzeug für Struktur-based Drug Design14,15. Röntgen-Kristallographie ist die Methode der Wahl für die strukturelle Charakterisierung von Proteinen in der Nähe von atomarer Auflösung, aber die Kristallisation ist unberechenbar, zeitaufwendig und nicht immer erfolgreich. Systematische Methoden haben die Erfolgsquote verbessert und wichtige Faktoren sind die Sample-Qualität und Stabilität. Die Erfolgsquote bei der Kristallisation wird durch das Protein chemische Eigenschaften und Probe Vorbereitung Methode beeinflusst. Die Wirkung dieser werden bewertet und durch biochemische Charakterisierung16,17informiert.
Eine weitere Komplikation für Struktur-basiertes Design ist das Problem der kristallographischen Phase, die angegangen werden müssen. Sobald mehr Protein-Strukturen vorliegen haben, können viele Strukturen durch die molekulare Ersetzungsmethode erfordern eine homologe Struktur18behoben werden. Wie SBPs eine flexible Domänenstruktur präsentieren, könnte molekulare Ersatz auch anspruchsvolle19. Ist ein strukturelles Modell, das ähnlich genug, um das Zielprotein ist nicht verfügbar, kann eine Reihe von Techniken verwendet werden, um die experimentelle Phasenabgleich20zu erhalten. Unter diesen Einzel-Wellenlänge anomale Dispersion (SAD) Methode hat als die wichtigste Technik entstanden und wurde ausgiebig genutzt, um die Phase Problem21zu lösen. Die Verwendung der traurig-Methode hat weiter mit Verbesserungen bei der Hardware und Software sowie Daten-Sammlung-Strategien ermöglichen die Erkennung und Nutzung von schwachen anomale Signale zur schrittweisen22,23, 24. Darüber hinaus Fortschritte in der direkten Methoden für die Lösung von Strukturen der Makromoleküle, die in der Vergangenheit Beugung Daten zu atomarer Auflösung benötigt, jetzt genutzt werden kann, durch die Kombination von z. B. stereochemische wissen, wie im Programm implementiert ARCIMOLDO25. Eine nützliche Überprüfung der Methoden zur Lösung des Problems der Phase in der Kristallographie wird von Taylor26gegeben.
Hier präsentieren wir eine rationalisierte Protokoll zur Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport SBP, SP0092 von S. Pneumoniae, biochemische und strukturelle Techniken (Abbildung 1) zu integrieren. Dieses schrittweise Protokoll bietet ein nützliches Beispiel Test Case von Strategien, die Erfolgsquote der strukturelle Studien über SBPs im Allgemeinen zu verbessern, die in allen Königreichen des Lebens zu finden sind. Insbesondere das Protokoll unterstreicht die Bedeutung der Charakterisierung der stabilsten Oligomeren Zustand des Proteins in Lösung in eine schnelle und effektive Methode, und erlaubt die Identifikation der besten Arten, für Kristallisation Experimente zu folgen. Zwar gibt es über 500 SBP-Strukturen in der Protein Data Bank27berichtet, kann molekulare Ersatz aufgrund der inhärenten flexible Natur der beiden Domänen α/β, verbunden durch ein Scharnier Region19schwierig sein. So beschreibt der zweite Teil des Protokolls mit der traurigen Methode für Ausstieg aus gebundenen Metall-Ionen, die häufig in SBPs sowie die Einbeziehung von Selenomethionin und Verwendung von Selen (Se) ist in traurige Ausstieg.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SelenoMethionine Medium Complete</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-500</td>
			<td>Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306737</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems&#174; 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Orange</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S6651</td>
			<td>SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4362143</td>
			<td>The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 increase 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN HELEOS II</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td></td>
			<td>DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 5/150 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28906561</td>
			<td>Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the &#34;increase&#34; version but this model is ideal for the standard day by day use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well &#34;Big&#34; Sitting Drop Crystallization Plate</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td>The 24 well &#34;big&#34; crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Pre-Crystallization Test</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR2-140</td>
			<td>The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6098xx</td>
			<td>Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td>The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Foam Dewar</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-35</td>
			<td>5.7&#34; diameter by 2.8&#34; deep. 800mL capacity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-955</td>
			<td>Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes&#8482; that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puck dewar loading tool</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td>This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092

Entwicklung von neuen Antibiotika und Impfstoffe für Streptococcus Pneumoniae (Pneumokokken) sind notwendig, um den raschen Anstieg der multiplen Resistenzen zu stoppen. Kohlenhydrat-Substrat-bindende Proteine (SBPs) stellen praktikable Ziele für die Entwicklung von Protein-basierten Impfstoffen und neue Antibiotika wegen ihrer extrazellulären Lokalisierung und die Zentralität des Kohlenhydrat-Import für Pneumokokken Stoffwechsel, bzw.. Hier beschriebene ist ein rationalisierter integrierte Protokoll, eine umfassende Charakterisierung der SP0092, die aus der Pneumokokken und andere Bakterien auf andere Kohlenhydrat SBPs erweiterbar durchzuführen. Dieses Verfahren kann helfen, die Struktur-basierte Design-Inhibitoren für diese Klasse von Proteinen. Präsentiert im ersten Teil dieser Handschrift sind Protokolle für die biochemische Analyse durch thermische Verschiebung Assay, Multi Winkel Lichtstreuung (MALS) und Größe Ausgrenzung Chromatography (SEC), die die Stabilität optimieren und Homogenität der Probe gerichtet Kristallisation Studien und so erhöhen die Wahrscheinlichkeit des Erfolgs. Der zweite Teil dieses Verfahrens beschreibt die Charakterisierung der SBP Kristalle mit einer abstimmbaren Wellenlänge anomale Beugung Synchrotron Strahlrohr und Datenprotokolle Sammlung für Messdaten, die verwendet werden können, das kristallisierte Protein lösen Struktur.

Dieses integrierte Protokoll nachgewiesen wurde, um mit vier erfolgreich zu sein (zwei veröffentlicht und zwei unveröffentlichte Strukturen) von sechs Kohlenhydrat Protein Verbindlichkeit von Pneumokokken32,53bisher analysiert. In diesem Abschnitt präsentieren wir Ihnen die biochemische und strukturelle Charakterisierung von SP0092 als ein repräsentatives Ergebnis, strukturelle Studien der SBPs im Allgemeinen zu führen.
Nachdem die SBP-SP0092 zum Ausdruck gebracht und gereinigt wie zuvor32definiert wurde, wurde gereinigte Protein für Puffer-Stabilität über eine thermische Verschiebung Assay analysiert: SP0092 weist eine verstärkte Tm bei pH 6,5 und in Gegenwart von NaCl im Bereich 0 - 0,2 M Konzentrationsbereich (Abb. 3A). Vor diesem Hintergrund wurde die Pufferlösung für die nachfolgenden Schritte definiert als: 0,02 M MES pH 6,5, 0,2 M NaCl, 2,5 % (V/V) Glycerin, 0,5 mM DÄMMUND. Die absolute molare Masse der verschiedenen Oligomerisierung Zustände des SP0092 wurde gemessen, indem MALS gekoppelt an SEC ein Molekulargewicht von 187.2, 140,8 und 97,0 49,4 kDa Messung entspricht tetrameres, Trimere dimeres und Monomeren Arten bzw. () Abb. 3 b). Die SEC-Profil bei verschiedenen Protein Verdünnungen ergab, dass die Oligomerisierung durch erhöhte Proteinkonzentration ausgelöst wird, was darauf hindeutet, dass die größeren Oligomere stabiler bei höheren Konzentrationen als in der Regel gewöhnt sind Kristallisation. In der Tat, gereinigten größeren Oligomere Sorte gerichtet zur Kristallisation Studien erfolgreich produzierten Proteinkristallen zwar das Monomer Arten nicht.
Die optimierte Kristalle aus dem einheimischen gewonnen und Se-Methionin beschriftet Formen der SP0092 zeichneten sich durch Röntgenbeugung. Messung der Röntgen-Fluoreszenz von diesen Kristallen enthüllt in beiden Fällen Emissionen Gipfel für Zn wird an das Protein gebunden, während Se nur für die Se-Methionin Kristalle wie erwartet erkannt wurde. Später wurden x-ray Absorption Scans an den Se und Zn Kanten durchgeführt die vorausgesetzt direkten experimentelle Daten die einfallende Röntgen-Wellenlänge zu den jeweiligen x-ray Absorption Rändern des Zn oder Se Tune in den Kristallen, die anomale Signal zu maximieren, aus den daraus resultierenden Daten (Abbildung 4A–B) erhältlich.
Nach drei Beugungsmuster bei niedrigen Transmission zu messen, wurde ein komplettes Set für anomales Daten erhalten mit Hilfe der Daten-Sammlung-Strategie vorgeschlagen von EDNA (Abbildung 4). Das anomale anliegende Signal löst die automatisierte Phasenabgleich Pipeline an das Strahlrohr an die Unterkonstruktion zu bestimmen und anhand der experimentellen Anfangsphase abgeleitet, produziert erste Karten und Modelle, die dann verfeinert und validiert werden kann (Abbildung 4 ).
Zusammenfassend lässt sich sagen werden potenzielle Fallstricke der Technik in erster Linie auf Kristall-Verfügbarkeit und Qualität zentriert. Optimierung der Pufferbedingungen Proteinstabilität zu verbessern sowie Identifizierung von den am besten geeigneten Oligomere Zustand des Proteins zu verwenden, wenn mehr als ein Oligomer in Lösung identifiziert wird, kann das Risiko eines Ausfalls bei der Kristallisation reduzieren. Bühne. Nutzung den Einsatz von gebundenen Metall-Ionen in einem frühen Stadium erkannt Struktur Lösung beschleunigen und vermeiden unnötige Produktion von Selenomethionin Protein beschriftet, wenn molekulare Ersatzmethoden Versagen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Diagramm des Workflows für biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydraten SBPs. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Kristall Charakterisierung in GDA. (A) Screenshot der Registerkarte Röntgen-Fluoreszenz Kontrolle der GDA Strahlrohr Steuerungssoftware. (B) Screenshot der Registerkarte der x-ray für Energie Rand-Scannen in GDA. (C) Screenshot von der Registerkarte Daten Sammlung Kristall Screening in GDA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Biochemische Charakterisierung der SP009239-491. (A) 3D-Oberfläche Graphen Plotten die Schmelztemperatur der SP009239-491 als eine Funktion des pH-Wertes und NaCl-Konzentration der Pufferlösung. (B) SEC und MALS Ergebnisse für SP009239-491. Absorption bei 280 nm ist in blau dargestellt. Die Molmassen der verschiedenen Oligomerisierung Staaten werden in rot angezeigt. Zentrale (B) wurde von32geändert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
Abbildung 4. Strukturelle Charakterisierung von SP009239-491. (A) und (B) x-ray Absorption Energie am Rande Zn und Se für SP0092-39-491 -Kristalle zu scannen. Die gemessenen Fluoreszenz von Zn und Se mit Kristallen erscheint in blau und Cyan, die berechneten f' und f "anomale Streuung Brüche sind in grün und rot, jeweils. (C) Beispiele für x-ray Diffraction Muster von SP009239-491 Kristalle gesammelt. (D) Cartoon Darstellung der SP009239-491 Dimer Struktur. Ein Protomer ist weiß eingefärbt und den anderen Magenta (Rückstände 39-366) und violett (Rückstände 367-491), und die anomale Streuung Atome werden als blau und Cyan Kugeln für Zn und Se, bzw. angezeigt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.1 M Zitronensäure pH 4.0</td>
			<td>0.1 M Zitronensäure pH 4,5</td>
			<td>0,1 M Phosphat pH 5,0</td>
			<td>0,1 M Citrat pH 5,5</td>
			<td>0,1 M Bis-Tris pH 6</td>
			<td>0,1 M ADA pH 6,5</td>
			<td>0,1 M MOPS pH 7</td>
			<td>0,1 M HEPES pH 7,5</td>
			<td>0,1 M Imidazol pH 8.0</td>
			<td>0,1 M Tris pH 8,5</td>
			<td>0,1 M CHES pH 9</td>
			<td>0,1 M CHES pH 9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl 0.1 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,2 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.5 M</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
			<td>40 ΜL</td>
		</tr>
	

Tabelle 1. Komposition für thermische Verschiebung Assay-Puffer.

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Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Eine optimierte Protokoll für die Durchführung einer umfangreichen biochemischen und strukturelle Charakterisierung von ein Kohlenhydrat-Substrat-Bindeprotein von Streptococcus Pneumoniae wird vorgestellt.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

biochemical-structural-characterization-carbohydrate-transport

Research

JoVE Journal

Biochemistry

29.7K Aufrufe.  Harwell Science & Innovation Campus. Eine optimierte Protokoll für die Durchführung einer umfangreichen biochemischen und strukturelle Charakterisierung von ein Kohlenhydrat-Substrat-Bindeprotein von Streptococcus Pneumoniae wird vorgestellt.

Serie: Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural information, typically obtained by crystallography; however MPs are difficult to crystallize. Recent progress in MP structural determination has benefited greatly from the development of lipidic cubic phase (LCP) crystallization methods, which typically yield well-diffracting, but often small crystals that suffer from radiation damage during traditional crystallographic data collection at synchrotron sources. The development of new-generation X-ray free-electron laser (XFEL) sources that produce extremely bright femtosecond pulses has enabled room temperature data collection from microcrystals with no or negligible radiation damage. Our recent efforts in combining LCP technology with serial femtosecond crystallography (LCP-SFX) have resulted in high-resolution structures of several human G protein-coupled receptors, which represent a notoriously difficult target for structure determination. In the LCP-SFX technique, LCP is recruited as a matrix for both growth and delivery of MP microcrystals to the intersection of the injector stream with an XFEL beam for crystallographic data collection. It has been demonstrated that LCP-SFX can substantially improve the diffraction resolution when only sub-10 &#181;m crystals are available, or when the use of smaller crystals at room temperature can overcome various problems associated with larger cryocooled crystals, such as accumulation of defects, high mosaicity and cryocooling artifacts. Future advancements in X-ray sources and detector technologies should make serial crystallography highly attractive and practicable for implementation not only at XFELs, but also at more accessible synchrotron beamlines. Here we present detailed visual protocols for the preparation, characterization and delivery of microcrystals in LCP for serial crystallography experiments. These protocols include methods for conducting crystallization experiments in syringes, detecting and characterizing the crystal samples, optimizing crystal density, loading microcrystal laden LCP into the injector device and delivering the sample to the beam for data collection.

We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.

Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in human pathology and other biochemical contexts. In order to perform characterization of protein deamidation, we have recently developed a novel long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method which can separate the glutamine (Gln) and asparagine (Asn) isoform products of deamidation from model compounds to highly complex biological samples. LERLIC-MS/MS is, therefore, the first shotgun proteomics strategy for the separation and quantification of Gln deamidation isoforms. We also demonstrate, as a novelty, that the sample processing protocol outlined here stabilizes the succinimide intermediate allowing its characterization by LERLIC-MS/MS. Application of LERLIC-MS/MS as shown in this video article can help to elucidate the currently unknown molecular arrays of protein deamidation. Additionally, LERLIC-MS/MS provides further understanding of the enzymatic reactions that encompass deamidation in distinct biological backgrounds.

Here we present a step-by-step protocol of the long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method. This is a novel methodology that enables for the first time quantification and characterization of the glutamine and asparagine deamidation isoforms by shotgun proteomics.

LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts of purified material. Here, we describe a simple method for gaining detailed polysaccharide structural information, including resolution of structural isomers. For polysaccharide analysis by gel electrophoresis (PACE), plant cell wall material is hydrolyzed with glycosyl hydrolases specific to the polysaccharide of interest (e.g., mannanases for mannan). Large format polyacrylamide gels are then used to separate the released oligosaccharides, which have been fluorescently labeled. Gels can be visualized with a modified gel imaging system (see Table of Materials). The resulting oligosaccharide fingerprint can either be compared qualitatively or, with replication, quantitatively. Linkage and branching information can be established using additional glycosyl hydrolases (e.g., mannosidases and galactosidases). Whilst this protocol describes a method for analyzing glucomannan structure, it can be applied to any polysaccharide for which characterized glycosyl hydrolases exist. Alternatively, it can be used to characterize novel glycosyl hydrolases using defined polysaccharide substrates.

A protocol for the structural analysis of polysaccharides by gel electrophoresis (PACE), using mannan as an example, is described.

Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

Einzelne Liposomen Messungen für das Studium der Protonen-Pumpen Membran Enzyme mit Elektrochemie und Fluoreszenz-Mikroskopie

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for even the most challenging projects in structural biology. However, most facilities still require the presence of a scientist on site to perform the experiments. A new generation of automated beamlines dedicated to the fully automatic characterization of, and data collection from, crystals of biological macromolecules has recently been developed. These beamlines represent a new tool for structural biologists to screen the results of initial crystallization trials and/or the collection of large numbers of diffraction data sets, without users having to control the beamline themselves. Here we show how to set up an experiment for automatic screening and data collection, how an experiment is performed at the beamline, how the resulting data sets are processed, and how, when possible, the crystal structure of the biological macromolecule is solved.

Here, we describe how to use the automated screening and data collection options available at some synchrotron beamlines. Scientists send cryocooled samples to the synchrotron, and the diffraction properties are screened, the data sets are collected and processed and, where possible, a structure solution is carried out&#8212;all without human intervention.

Völlig autonom Charakterisierung und Datenerfassung aus Kristallen von biologischen Makromolekülen

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identifizierung von neuartigen CK2 Kinase Substrate mit einem vielseitigen biochemischen Ansatz

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination of the high-specificity separation technique IEX with the accurate molar mass analysis achieved by MALS allows the characterization of heterogeneous protein samples, including mixtures of oligomeric forms or protein populations, even with very similar molar masses. Therefore, IEX-MALS provides an additional level of protein characterization and is complementary to the standard size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) technique.
Here we describe a protocol for a basic IEX-MALS experiment and demonstrate this method on bovine serum albumin (BSA). IEX separates BSA to its oligomeric forms allowing a molar mass analysis by MALS of each individual form. Optimization of an IEX-MALS experiment is also presented and demonstrated on BSA, achieving excellent separation between BSA monomers and larger oligomers. IEX-MALS is a valuable technique for protein quality assessment since it provides both fine separation and molar mass determination of multiple protein species that exist in a sample.

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

This protocol describes the use of high-specificity ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering for an accurate molar mass determination of proteins, protein complexes, and peptides in a heterogeneous sample. This method is valuable for quality assessment, as well as for the characterization of native oligomers, charge variants, and mixed-protein samples.

Ionenaustausch-Chromatographie (IEX) gekoppelt an Multiwinkel Lichtstreuung (MALS) für Protein Trennung und Charakterisierung

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The identification and characterization of these biomolecules can improve knowledge about their secretion pathways and help to manipulate them. Furthermore, some of these biomolecules are also interesting in terms of biotechnological applications. Described here are two protocols for easy and rapid isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins. The method for isolation of released carbohydrate polymers is based on conventional precipitation techniques of polysaccharides in aqueous solutions using organic solvents. This method preserves the characteristics of the polymer and simultaneously avoids the presence of contaminants from cell debris and culture medium. At the end of the process, the lyophilized polymer is ready to be used or characterized or can be subjected to further rounds of purification, depending on the final intended use. Regarding the isolation of the cyanobacterial exoproteome, the technique is based on the concentration of the cell-free medium after removal of the major contaminants by centrifugation and filtration. This strategy allows for reliable isolation of proteins that reach the extracellular milieu via membrane transporters or outer membrane vesicles. These proteins can be subsequently identified using standard mass spectrometry techniques. The protocols presented here can be applied not only to a wide range of cyanobacteria, but also to other bacterial strains. Furthermore, these procedures can be easily tailored according to the final use of the products, purity degree required, and bacterial strain.

Here, protocols for the isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and isolation of their exoproteomes are described. Both procedures embody key steps to obtain polymers or proteins with high purity degrees that can be used for further analysis or applications. They can also be easily adapted according to specific user needs.

Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Charakterisierung von Proteinen durch Größen-Ausschluss-Chromatographie gekoppelt an Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...