Name: synthesis of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles for imaging of atherosclerosis
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis at JoVE.com

המחברים, הייתי רוצה להכיר את התמיכה הפיננסית של אוניברסיטת דרום קליפורניה, הלב הלאומית, ריאות, ודם המכון (NHLBI), R00HL124279, אלי ו אידית פרס החדשנות רחבה, L.K. Whittier קרן Non-סרטן פרס המחקר translational שהוענקו EJC. המחברים תודה למרכז מיקרוסקופ אלקטרונים, Microanalysis, מרכז של מצוינות NanoBiophysics, מרכז התמחות על אפיון מולקולרי ומרכז Translational הדמיה-אוניברסיטת דרום קליפורניה לעזרה בארגון כיוונוני אינסטרומנטלית.

הערה: קרא את MSDS עבור ריאגנטים ופעל כל אמצעי בטיחות כימית כנדרש על-ידי מוסד מקומי.
1. הכנת PAMs MCP-1
<ol><li>
הכנת פפטיד MCP-1
	<ol>
<li>שוקלים לצאת mmol 0.25 של Fmoc-L-ליס (מפחיד)-Wang בכלי התגובה (RV). יש לשטוף את הצד של הקרוואן עם dimethylforamide מ ל (DMF) בשכונה fume כימי.</li>
		<li>לטעון את הקרוואן על סינתיסייזר פפטיד benchtop אוטומטית. לטעון ארוזים מראש הבקבוקונים חומצת אמינו, N "- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C", מ- C כדי אמיני. לכלול את מבחנה ריקה בסוף השלב הסופי deprotection. הערה: פפטיד מקושקשות עם רצף, N "- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C", יכול גם להיות מסונתז שימוש באותו הפרוטוקול.</li>
		<li>לאחר סיום סינתזה, להעביר את פפטידים על שרף הקרוואן המבחנה נצנוץ עם 2-3 מ ל מתנול עד כל שרפים מועברים. לאחר השרף שקעה לתחתית, להסיר את מתנול supernatant ולא להתאדות הנותרים עד יבש. אבק יבש h 2 נוספות או למשך הלילה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להפוך את פתרון המחשוף 12 mL המכיל חומצה trifluoracetic (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane ב 94:2.5:2.5:1% vol בשכונה fume כימי. מערבולת הפתרון המחשוף כדי לוודא כי הוא מעורב באופן שווה. התראה: כי triisopropylsilane ethanedithiol אוויר רגיש בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד, ארגון לטהר צלוחיות מניות של triisopropylsilane ו- ethanedithiol עבור 1 דקות לפני שמוציאים אותם בחזרה.</li>
		<li>הניחו את כלי הקיבול של סינתזה (SV) על גבי שאכר זרוע על ידי מחבר חובק למעקה ליד החלק התחתון של ה-SV. העברה פפטיד-שרף ה-SV 2 מ של פצילות פתרון עד כל פפטיד-שרפים מועברים.</li>
		<li>לשטוף את הצדדים של ה-SV עם 3 מ ל המחשוף פתרון. לסגור את הפקק של ה-SV ומנערים ב 300 תנודות/דקה במשך 4 שעות.</li>
		<li>שוקלים את צינור צנטריפוגה ריק 50 מ. להקליט את המסה.</li>
		<li>לאחר 4 שעות, לנקז את הפתרון cleaved פפטיד של ה-SV לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ. לשטוף את ה-SV מספר פעמים עם הפתרון המחשוף הנותרים.</li>
		<li>להתנדף פפטיד cleaved פתרון עם חנקן עד שיש פחות מ 4 מ ל שנותרו בצינור צנטריפוגה.</li>
		<li>להוסיף 36 מ"ל של האתר כקרח הפתרון ביקע פפטיד.</li>
		<li>הפתרון עד מערבולת הוא לגמרי לבן או צהוב. צנטריפוגה ב 3000 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C, decant את תגובת שיקוע.</li>
		<li>הוסף אתר קר כקרח 40 מ"ל ברכבת התחתית. מערבולת, sonicate שוב. חזור על תהליך צנטריפוגה. Decant את תגובת שיקוע.</li>
		<li>יבש בגדר הרשות הפלסטינית גולמי עם חנקן גז מנקה עד האתר הוא בעליל התאדו.</li>
		<li>הוסף 20 מ"ל מזוקק פעמיים מים, מערבולת, ו- sonicate עד פפטיד היא התפרקה לחלוטין בפתרון.</li>
		<li>להקפיא את הפתרון, lyophilize עד יבש.</li>
		<li>ברגע פפטיד הוא מיובש, לשקול את המסה של הצינור צנטריפוגה המכיל את פפטיד גולמי. להמיס את פפטיד גס 5 מ"ג/מ"ל מים.</li>
		<li>להמיס 25 מ ג של פפטיד גולמי MCP-1 ב- 5 מ ל מים מזוקק פעמיים כדי ליצור ריכוז מוחלט של 5 מ"ג/מ"ל. לטהר את גולמי MCP-1 פפטיד על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) באמצעות 0.1% TFA במים (הממס A) ו- 0.1% TFA ב- acetonitrile (הממס B) בתור שלבים ניידים על עמודה הפוכה-פאזי C8. להזריק את 5 מיליליטר פפטיד לתוך HPLC. הערה: שלב ניידים הראשונית כללה 100% ממס A בקצב הזרימה של 9.0 מ ל לדקה להקטין הממס A לאט כדי 30% 27 דקות והחזק הזה בהרכב במשך 3 דקות חזרה מעבר הצבע כדי 100% ממס מעל 3 דקות והחזק הזה בהרכב עבור 1 דקות לתת ריצה-הזמן הכולל 34 למינימום של שמור על הטמפרטורה עמודה 55 מעלות צלזיוס. השתמש מצב מקור יון חיובי עבור הניתוח. חומצה פורמית יכול לשמש במקום TFA, אם TFA הוא חומצי מדי עבור העמודה HPLC. מומלץ כי המהירות הרמפה ההרכב הממס האורגני לא יעלה על 2%/min להפרדה טובה יותר.</li>
		<li>לנתח כל שבר באמצעות ספקטרומטר מסה לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) עבור המוצר הצפוי ז/ז-2,890. הערה: להמיס חומצה α-cyano-4-hydroxycinnamic-1 מ ג/מ ל acetonitrile/מים (50: 50% vol) כפתרון מטריקס. במקום µL 0.75 של מטריקס פתרון לצלחת MALDI, ואחריו 0.75 µL של כל שבר. לבצע את הניתוח באמצעות מצב חיובי יון רפלקטיביים במגוון המונית של 500-5000 Da.</li>
		<li>לשלב המוצר שברים, לפוצץ את acetonitrile, להקפיא, ולאחר lyophilize פפטידים מטוהרים עד יבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה של הרשות הפלסטינית MCP-1
	<ol>
<li>הכן של עודף טוחנת 1.1 של 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-יתד (2000)-maleimide כדי פפטיד של נצנוץ נפרד בקבוקונים. להמיס שתי תרכובות במים מזוקק פעמיים כדי להפוך ~ 15 מ"ג/מ"ל. Sonicate למשך 15 דקות, או עד שני פתרונות ברורים לחלוטין. הערה: DSPE-יתד (2000)-Cy5 הוא מסונתז באמצעות פרוטוקול זהה עם DSPE-יתד (2000)-אמין, N-hydroxysuccinimide (NHS) אסתר-functionalized Cy5, למעט שלב 1.2.3, איפה ה-pH של התמיסה מותאם 8.5.</li>
		<li>להוסיף פתרון (2000)-maleimide DSPE-יתד הפתרון פפטיד. המערבולת ו sonicate.</li>
		<li>להוסיף 1 מ' NaOH dropwise (1 µL) עד ה-pH של התמיסה הוא 7.</li>
		<li>חנקן לטיהור לפתרון 5 דק מערבבים את הפתרון בין לילה.</li>
		<li>להקפיא את הפתרון, lyophilize עד יבש.</li>
		<li>ברגע שהמוצר גולמי הוא מיובש, להמיס המוצק של 5 מ"ג/מ"ל מים.</li>
		<li>לטהר עם HPLC כמתואר לעיל. הערה: פפטיד Unconjugated ו- DSPE-PEG(2000) צריך elute בין 15-30% ריכוז אורגנית (vol %), בעוד DSPE-יתד המספר המשלים (2000)-MCP-1 צריך elute בין 40-50% ריכוז אורגנית.</li>
		<li>לנתח כל שבר באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI עבור המתאימים m/z. DSPE-יתד (2000)-MCP-1 צריך לשיא מ רחב/z-5,760. הערה: 2, 5-dihydroxybenzoic חומצה מתאימה ביותר לשימוש כמו המטריקס DSPE-יתד (2000)-MCP-1 עם MALDI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הרכבה של MCP-1 PAMs
	<ol>
<li>להמיס 1.75 מ ג PAs MCP-1 עם מתנול 3 מ בבקבוקון 1-דראם. Sonicate עד שהרשות MCP-1 היא התפרקה לחלוטין. הערה: ניתן לשלב חומרים פעילי שטח Cy5 ביחס של שן טוחנת של 10:90 הרשות הפלסטינית MCP-1 עבור יישומי הדמיה.</li>
		<li>להתנדף מתנול תחת חנקן בתנועה סיבובית בזמן השטיפה מתנול הנותרים את הצד של המיכל עד סרט אחיד נוצר בתחתית המבחנה. ואקום-יבש הסרט בן לילה.</li>
		<li>מימה את הסרט עם 3 מ"ל של מאגר מים או פוספט תמיסת מלח (PBS) כדי להפוך פתרון 100 מיקרומטר של PAMs MCP-1. בעדינות המערבולת ו sonicate הפתרון עד שקוף. דגירה ב 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הערה: הטמפרטורה מוגברות הוכח כדי להאיץ את תהליך הרכבה עצמית ומאפשרת את הרכיב פפטיד ליצור משני המבנה היציב ביותר, תוך כדי הנמכת42,את הריכוז (CMC) מיצלה קריטי43.</li>
		<li>מגניב את פיזור וכתוצאה מכך לטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אפיון PAMs MCP-1
<ol><li>
פיזור אור דינאמי (DLS) ואת פוטנציאל זטה
	<ol>
<li>המקום 100 מיקרומטר של פאם MCP-1 או פאם מקושקשות ב cuvette על פי ההוראות של המכשיר פוטנציאליים DLS או זטא. הערה: DLS, זטה וואקום פוטנציאלי יכול להיות שונה בהתבסס על ההוראות של המכשיר.</li>
		<li>Equilibrate הכלי לטמפרטורת החדר. למדוד את גודל ואת משטח הטעינה של פאם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM)
	<ol>
<li>להוסיף 7 µL של 50 מיקרומטר פאם MCP-1 או פאם מקושקשות על גבי רשת TEM מושעים בתוך פינצטה עצמית הסגירה עבור 5 דק הפתיל משם ה-droplet עם מגבון המשימה העדינה.</li>
		<li>להוסיף 7 µL של מים כדי לשטוף את הרשת. לפתיל משם ה-droplet.</li>
		<li>להוסיף 7 µL של wt 1% חומצה phosphotungstic עבור 2 דק הפתיל משם ה-droplet. חזור על שלב 2.2.2.</li>
		<li>יבש את הרשת TEM לפני ניתוח TEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ספקטרוסקופיה קיווטות (CD)
	<ol>
<li>הפעל את החנקן למשך 5-10 דקות לפני השימוש בכלי.</li>
		<li>מקום µL 300 של ריק (מים או PBS) cuvette.</li>
		<li>למדוד ספקטרה-190-265 nm, 0.2 מ מ אורך נתיב עם זמן אינטגרציה s 1, ורוחב הפס nm 1 הטמפרטורה בחדר. לאסוף 3 משכפל.</li>
		<li>מדד 100 מיקרומטר MCP-1 פפטיד, פאם MCP-1, ביצים מקושקשות פפטיד, ונעמד פאם תחת באותו המצב שמתואר בשלב 2.3.3. להחסיר מן הריק.</li>
		<li>להתאים את הנתונים באמצעות אינטרפולציה ליניארית של polylysine בסיס ספקטרה.</li>
		<li>כבה את המכשיר. לחכות 10 דקות לפני ביטול את החנקן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח במבחנה של MCP-1 PAMs
<ol><li>
במבחנה הביו
	<ol>
<li>תרבות ולהרחיב את ה-וואי 274.1 ומונוציטים מאתר של Dulbecco ששינה נשר בינוני בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, מ מ 0.05 מרקפטואתנול, ב- 37 מעלות מתחת 5% CO2 כדי מעבר 5. הערה: ה-וואי 274.1 הם תאים ההשעיה. כאשר culturing, התקשורת צריכה להיות מתחדש כל 2-3 ימים.</li>
		<li>Pipet ומונוציטים בתקשורת לתוך שפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ. צנטריפוגה ב 300 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>האחות המדיה הישנה, resuspend בתקשורת טריים 10 מ"ל לתוך הצינור צנטריפוגה. מערבבים לאט עד תאים מופצים בצורה שווה בתקשורת. לספור את התאים באמצעות צביעת trypan blue ו- hemocytometer.</li>
		<li>לדלל תאים כאלה ישנם 4,000 ומונוציטים לכל µL 90 של מדיה לכל טוב. להוסיף 90 µL של תאים בבארות של צלחת 96-ובכן. תקופת דגירה של 24 שעות. הערה: הימנע משימוש הבארות על הקצה החיצוני של הצלחת כדי למנוע הבדלי אידוי ושינויים תרמי בצלחת. למלא הבארות החיצוני 100 µL PBS.</li>
		<li>להמיס µmol 0.15 של MCP-1 פפטיד, פאם MCP-1, פפטיד מקושקשות או מקושקשת. פאם ב- PBS µL 150 צינורות microcentrifuge נפרדים, מעוקר. לבצע דילול טורי כדי להפוך µL 65 של 1, 10 ו- 100 מיקרומטר של כל דגימה.</li>
		<li>להוסיף 10 PBS µL ריכוז כל בבארות המכיל את ה-וואי 274.1 (סה כ עוצמה: µL 100 לכל, 6 קווי, בארות סה כ 96). תקופת דגירה של 72 h.</li>
		<li>להוסיף 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) כל היטב. תקופת דגירה של 1 h.</li>
		<li>לנתח את ספיגת שימוש בקורא צלחת 490 nm או בהתאם להוראות היצרן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
במבחנה מיצלה איגוד
	<ol>
<li>ומונוציטים זרע 500,000 ב כל טוב של צלחת 6-ובכן ב- 2 מ של המדיה המכילה 100 מיקרומטר התווית על-ידי Cy5 פאם MCP-1 (יחס טוחנת 10:90 של DSPE-יתד (2000)-Cy5 והרשות MCP-1). תקופת דגירה של 1 h.</li>
		<li>לאסוף ה-וואי 274.1 על ידי צנטריפוגה ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. האחות התקשורת.</li>
		<li>Resuspend ולשטוף את התאים ב- 2 מ"ל PBS. צנטריפוגה ב 300 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. מחוק לגמרי מגניב. חזור על התהליך הכביסה עם 2 מ"ל PBS. מחוק לגמרי מגניב.</li>
		<li>להוסיף 2 מ של paraformaldehyde 4% קר לתקן את התאים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
		<li>Pipet התאים קבוע על גבי coverslip זכוכית סטריליים בתוך בארות של צלחת 6-. טוב. צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דקות.</li>
		<li>להסיר את paraformaldehyde. לרחוץ ולשטוף עם 2 מ"ל PBS פעם אחת. Resuspend עם 1 מל PB הערה: כאשר שטיפה, להימנע לשבש את פעולת התאים על coverslip.</li>
		<li>לשים 10 µL של 90% גליצרול PBS לשקופית. השתמש במחט עם פינצטה כדי לאסוף את coverslip. יבש על קצה coverslip. הנח בעדינות את coverslip לשקופית עם הפנים למטה.</li>
		<li>בעדינות חותם על קצה coverslip עם לק ברורה. מניחים במקרר עד מוכן עבור הדמיה.</li>
		<li>להשתמש לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) המותקן עם לייזרים עבור Cy5-λעירור = 650 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

PAMs MCP-1 הם פלטפורמה הדמיה מולקולרית מבטיח, המורכב פפטיד מיקוד הידרופילית וזנב הידרופובי שמניע את מהות עצמית שהורכב ננו-חלקיק. מיצלה פילוח מונוציט הזה ניתן להכין על ידי סינתזה פשוטה ואת שלבי טיהור של פפטיד MCP-1 ו- DSPE-יתד (2000)-MCP-1. PAMs יש מאפיינים רבים מועילים ויוו מולקולרית הדמיה כגון שלהם הרכבה עצמית תחת תנאים מתון biodegradability מהותי, מבניים וכימיים גיוון המאפשר שיתוף אחרים moieties הדמיה או פילוח פפטידים למסור באופן סלקטיבי אתר מסוים של עניין. יהיה מכוון שלהם גודל החלקיקים, צורה, הרכב על ידי שינוי פפטיד, הזנב הידרופוביות, או ריכוז מיצלה, ומאפשר מאפיינים כימיים ופיזיים אופטימלית עבור מגוון של יישומים22,33.
יש לציין כמה מגבלות של פרוטוקול זה. קודם כל, מאז PAMs מונעים ע י אינטראקציות הידרופוביות, זה הכרחי לבנות מיקוד פפטידים שנמצאים הידרופיליות, ובכך לאפשר את moiety מיקוד שיוצגו על-פני מיצלה. אם הרצף פפטיד הוא הידרופוביות, תוספת של אחד או שניים חומצות אמינו התחנה הסופית C ניתן לאכלס, אך התוספת של חומצות אמינו יכול להשפיע על המבנה משני פפטיד בתוך מיצלה, ובכך לשנות את המאפיינים של פפטיד בתוך למצבו המקורי ב-44,חלבון45. שנית, בריכוזים נמוכים, PAMs יש יציבות בסביבה מימית כפי שהם תלויים במידה רבה CMC, הריכוז המינימלי הדרוש עבור PAs ליצור את מבנה micellar46. להלן CMC, מיצלה פירוק כדי מונומרים הרשות הפלסטינית בודדים, מגביל את מיצלה כדי לפעול כנשא ולפרוק תרופה-אתר מסוים47. כדי להקל על חיסרון זה, ניתן להקטין את CMC על ידי הגדלת אורך שרשרת48,הזנב הידרופובי49. לבסוף, אחסון לטווח ארוך של PAMs בפתרון לא מומלץ כי מבנה שניוני הרשות תוכל לשנות עם הזמן, ובכך להשפיע על מבנה micellar, יציבות, וכן היעילות ליגנד מחייב26.
לסיכום, פרוטוקול זה מדגים אסטרטגיה מבוסס מיצלה ננו-רפואה פפטיד חזקות, שהורכבו עצמית הדמיה טרשת עורקים. PAMs MCP-1 הם מסתיימים, מתכלה, רעילים כמו מרכיבי מיצלה שמקבלים השראה מגורמים אנדוגניים לגוף. יותר חשוב PAMs MCP-1 יש מחייב מועדף ומונוציטים, אשר מגבירים באופן פרופורציונלי כדי התקדמות פלאק, הקלת הגישה לא פולשנית של הבחנה שלבים של הפלאק טרשת עורקים. עקב המודולריות של הפלטפורמה, PAMs באפשרותך לשלב הרפוי, נוספים מיקוד פפטידים, הדמיה moieties וחומצות גרעין. לפיכך, נתון כזה יכולות דינמיות של אלה הקזאין רב תכליתיים, אנו מאמינים כי החלקיקים להחזיק הבטחה גדולה לתרגום קלינית ב טרשת עורקים ומחלות אחרות.

מחלות לב וכלי דם להישאר להיות הגורמים המובילים. למוות באופן גלובלי עם 17.3 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם1. מחלות לב וכלי דם נתרמים על ידי טרשת עורקים, מצב שבו הפלאק לבנות את העורקים, ובכך מעכבים דם, זרימת חמצן אל התאים של הגוף2,3. ההתקדמות של טרשת עורקים כרוך את עיבוי ואת התקשות של העורקים על ידי תגובה דלקתית, חילוף החומרים של השומנים לא סדיר, הצטברות פלאק, המוביל אל רובד אוטם שריר הלב ולמסמנים4,5. תאי אנדותל מבטאים מולקולות ציטוקינים והצמדות, הכוללים MCP-1 זה נקשר לקולטן C-C כימוקין (CCR2) על פני השטח של monocytes6,7,8. כולסטרול מחומצן ממירה ומונוציטים מקרופאגים בשלב מוקדם של היווצרות הפלאק, אשר מגביר את התגובה דלקתית באזור, מוביל פגיעה ברקמות ואת היווצרות הפלאק לא יציבה או פגיע9, 10.
באופן מסורתי, טרשת עורקים מחושבת על-ידי הערכת היצרות luminal על ידי הדמיה אנטומית באמצעות11,של מסתמים או אולטרסאונד-12. עם זאת, שיטות אלה יכול לקבוע אך ורק היצרות חמורה של הקיר עורקים, לא שבשלב מוקדם של טרשת עורקים, כמו צמיחה שלט הראשונית גורמת שיפוץ העורקים כדי לשמור על גודל עורק ודם תזרים קצב12,13, 14. לכן, angiograms underrepresent שכיחות טרשת עורקים. בנוסף, טכניקות הדמיה לא פולשנית כגון פליטת פוטון בודד שחושב טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה, דימות תהודה מגנטית שימשו לאחרונה לאפיין פלאק מורפולוגיה כפי שהם יכולים לספק פרטים הראשונית, אפיון של הפלאק. עם זאת, האופנים האלה מוגבלים לעיתים קרובות על ידי חוסר רגישות, רזולוציה מרחבית, או דורשים השימוש של קרינה מייננת, ביצוע הדמיה פלאק התקדמות בשלבים שונים הרבה יותר מאתגר15,16, 17. מערכת משלוח הדמיה אשר במיוחד מזהה שלטי בשלבים שונים של טרשת עורקים נשאר להיות מפותח.
חלקיקים הוכיחו להיות פלטפורמה המתעוררים ויוו פלאק מיקוד ואבחון18,19,20,21. בפרט, PAMs הם יתרון בשל המגוון הכימי שלהם ואת היכולת להכיל מגוון moieties, יצירות, גדלים, צורות של פני השטח functionalization22. פפטיד חומרים פעילי שטח (PAs) מורכב הידרופיליות, פפטיד "headgroup" מצורף וזנב הידרופובי, אשר בדרך כלל שומנים; מבנה amphiphilic זה מקנה יכולות וההספק עצמי ומאפשר תצוגה multivalent של פפטידים על פני השטח של חלקיקים22,23,24. Headgroups פפטיד יכול להשפיע על צורת החלקיקים באמצעות קיפול ומימן מליטה בין פפטידים25. פפטידים מקפלים כתהליכי β-גיליון הוכחו יוצרות הקזאין מוארך, ואילו אישור α-הסליל יכולים ליצור שני כדורי ומוארך הקזאין22,23,24, 2526,,27. ניתן להניח linkers פוליאתילן גליקול (PEG) למגן את המטען משטח של פפטיד בין פפטיד הידרופילית את וזנב הידרופובי של PAMs, שיפור הזמינות של ננו-חלקיק מחזור מערכתי28, 29 , 30 , 31. PAMs הם גם יתרון כי הם אינם מסתיימים הוכחו, יש מגוון רחב של יישומי32,33. המסיסות במים הקזאין מציע יתרון על פני מערכות אחרות כגון חלקיקים פולימרים מסוימים אינם מסיסים במים, יש להיות מושעים ב- solubilizers עבור זריקות34מבוססי ננו-חלקיק. בנוסף, היכולת ליצור PAMs זה לפרק בתגובה לגירויים ספציפיים הופכת PAMs מבוקר הסמים תאיים משלוח35ההרסני.
על ידי קשירה לקולטן CCR2 המצטבר קשת אבי העורקים, PAMs פותחו בעבר עבור מונוציט מיקוד לעקוב אחר השלבים השונים התרדמה ב אבי העורקים9. בעכברים ספקיות- / - , הצטברות מונוציט מגדילה באופן פרופורציונלי פלאק התקדמות36. יתר על כן, נמצא כי חולים עם שלטי נוטה להיקרע, בשלב מאוחר מכילים כמויות גבוהות של monocytes37. לכן, השינוי של PAMs לשלב MCP-1 הוא שימושי כי זה מאפשר להגדיר מיקוד ובידול בין התרדמה, מאוחר-בשלב מוקדם. מחקרים אלה הוכחה הרעיון לאמת גם כי PAMs בטוחים מספיק לשמש pre-clinically, נמחקים renally38. מאז ומונוציטים ודלקת האופייני למחלות אחרות, PAMs MCP-1 יש פוטנציאל לשמש ליישומים טיפוליים ואבחון מחלות אחרות מעבר טרשת עורקים-8,-39,-40 , 41.
במסמך זה, אנו מדווחים על הזיוף של PAMs MCP-1 מאוד מדרגיים, שהורכבו עצמית, אשר הדגים של החלקיק לגודל האופטימלי משטח הטעינה, המיקוד סלקטיבי ומונוציטים עבור יישומי הדמיה משופר של טרשת עורקים.

<table><tbody><tr><td>1,2-ethanedithiol</td><td>VWR</td><td>E0032</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>10 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes, polypropylene</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165200050</td><td>for MALDI</td></tr><tr><td>25 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>5 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>75 cm2 culture flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>75 mL reaction vessel</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>96-wells cell culture plate</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>for MTS assay</td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Borosilicate glass, 1 dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>for PAM synthesis</td></tr><tr><td>Borosillicate glass pipet, Long tips</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Cy5 amine</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>Diethyl ether, ACS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>for peptide precipitation</td></tr><tr><td>Disposable syringes, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Double neubauer ruled hemocytometer</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) amine</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) maleimide</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHS ester&amp;nbsp;</td><td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td><td>for conjugation to Cy5</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium-high glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh</td><td>Novabiochem</td><td>856013</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Formic acid, optima LC/MS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Hand tally counter</td><td>Fisher Scientific</td><td>S90189</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Magnetic stir bars, egg-shaped</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>Methanol, ACS certified</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>for PAM synthesis</td></tr><tr><td>MTS cell proliferation colorimetric assay kit</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>for MTS assay</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide, sequencing grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine</td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416780250</td><td>for fixing cells</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Peptide synthesis vessel, 25 mL&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>CG186011</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Phosphotungstic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Spectrum</td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Plain glass microscope slide 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Reagent reservoirs, sterile&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>95128093</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Self-closing tweezer</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>TEM support film</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP618-500</td><td>for peptide cleavage and HPLC purification</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5ml</td><td>for peptide cleavage</td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0.4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Tweezer, general purpose-serrated</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;CRL-1679</td><td>murine monocyte</td></tr><tr><td>automated benchtop peptide synthesizer</td><td>Protein Technologies</td><td></td><td>PS3 Benchtop Peptide Synthesizer</td></tr><tr><td>&amp;alpha;- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>476870-2G</td><td>for MALDI</td></tr></tbody></table>

synthesis of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles for imaging of atherosclerosis

טרשת עורקים הוא תורם מרכזי למחלות לב וכלי דם, הגורם המוביל למוות ברחבי העולם, אשר טוען 17.3 מיליון אנשים בשנה. טרשת עורקים הוא גם הגורם המוביל של מוות פתאומי, אוטם שריר הלב, שעודד פלאק לא יציב נקרעים ועוברים occlude את כלי הדם ללא אזהרה. זרם שיטות הדמיה לא יכול להבדיל בין פלאק לא יציב ויציבה להיקרע. פפטיד חומרים פעילי שטח הקזאין (PAMs) יכול להתגבר על חיסרון זה כפי ניתן לשנותן עם מגוון של פילוח moieties לאגד במיוחד כדי רקמות חולות. ומונוציטים הוכחו להיות סמנים מוקדם של טרשת עורקים, בעוד הצטברות גדולה של monocytes משויך הפלאק נוטה להיקרע. לפיכך, חלקיקים שיכולות היעד ומונוציטים ניתן להפלות בשלבים שונים של טרשת עורקים. לשם כך, כאן, נתאר פרוטוקול על פי פילוח מונוציט PAMs (מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1) PAMs). PAMs MCP-1 הם התאספו עצמית דרך סינתזה בתנאים מתון כדי טופס חלקיקים של 15 ננומטר קוטר עם יד תשלום משטח נייטרלי. במבחנה, PAMs נמצאו מסתיימים והיתה זיקה מחייבת גבוהה עבור ומונוציטים. בשיטות המתוארות בזאת מבטיחים למגוון רחב של יישומים טרשת עורקים, כמו גם מחלות דלקתיות אחרות.

הכנה של פאם MCP-1 מוטיב CCR2 מחייב (שאריות 13-35) של MCP-1 חלבון [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] או מקושקשות פפטיד [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] שונתה על-ידי הוספת משקע ציסטאין על קצה אמיני. פפטיד MCP-1 היה מסונתז על ידי שיטה מוצק-פאזי בתיווך Fmoc באמצעות סינתיסייזר של פפטיד אוטומטית. פפטיד גולמי היתה מטוהרת על-ידי הפוכה-פאזי HPLC על עמודה C8 ב 50 מעלות צלזיוס באמצעות 0.1% TFA ב תערובות acetonitrile/מים, מאופיין MALDI ספקטרומטר מסה (איור 1). פפטיד המכיל ציסטאין היה מצומדת אל DSPE-PEG2000-maleimide להניב DSPE-יתד conjugates (2000)-פפטיד באמצעות חיבור אמיתי thioether. לאחר 24 שעות בטמפרטורת החדר, המוצר הגולמי היה טהור על ידי HPLC (איור 2). DSPE-יתד (2000)-Cy5 היה מסונתז באמצעות לתגובה אסתר NHS. פילוח מונוציט PAMs שיתוף מורכבים עם DSPE-יתד (2000)-MCP-1 DSPE-יתד (2000)-Cy5 היו מפוברק על ידי המסת ב מתנול זה היה ואז התאדו מאת N2ואת הסרט שנוצר היה מיובשים תחת ואקום במשך הלילה, התאספו עצמי במים או PBS דרך אינטראקציות הידרופוביות מקבוצות"זנב" טופס PAMs MCP-1.
אפיון של פאם MCP-1 DLS נתונים ותמונות TEM של פילוח מונוציט PAMs הראה nanoparticle מפוזר היטב, כדורית של 15.3 ± 2.0 nm קוטר (איור 3 וטבלה 1). PAMs MCP-1 והן PAMs מקושקשות הראה זטה חיובי קלה פוטנציאלית של 12.1 mV ± 3.1 ו- 13.7 ± 1.9 mV, בהתאמה (טבלה 1). תקליטור הראה כי שילוב של פפטיד MCP-1 בתוך מיצלה משופרת של מבנה שניוני (טבלה 2, PAMs MCP-1: 46.2 ± 0.9% β-גיליון 1.4% ± 53.1 סליל אקראי, MCP1 חינם: ± 3.5% β-גיליון, סליל אקראי של 3.5% 65.8 ± 34.2).
במבחנה ניתוח של פאם MCP-1 במבחנה הביו, מונוציט קשירה של MCP-1 PAMs נצפו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. העכבר ומונוציטים היו מודגרות עם הגדלת ריכוזים של MCP-1, פאם MCP-1, פפטיד מקושקשות, ביצים מקושקשות. פאם במשך 72 h, התאים נמצאו להיות בר קיימא, מסתיימים עד 100 מיקרומטר (איור 4). יתר על כן, מיקרוסקופיה קונפוקלית הראה קשירה ספציפי של monocytes PAMs MCP-1 בהשוואה מקושקשות PAMs (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56625/56625fig1.jpg"> איור 1 : Chromatogram HPLC-220 nm (אורך גל של חלבון) ל- 254 ננומטר (אורך גל של טירוזין) של פפטיד MCP-1 (א) ופפטיד מקושקשות (B) (שיא Boxed ב 7.4 דקה). MALDI-תוף הספקטרום המונית של פפטיד MCP-1 (ג) ופפטיד מקושקשות (D) בטווח של 500-5000 Da מציג אל הפסגה [M + H]+ -m/z 2,888 (2,890 הצפוי). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56625/56625fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56625/56625fig2.jpg"> איור 2: Chromatogram HPLC-220 nm (אורך גל של חלבון) ל- 254 ננומטר (אורך גל של טירוזין) של DSPE-יתד (2000)-MCP-1 (א) ו- DSPE-יתד (2000)-מקושקשת (B). (מסגרת שיא ב- 16.9 דקה). (ג) MALDI-TOF המונית, הספקטרום של DSPE-יתד (2000)-MCP-1 בטווח של 1,000-10,000 Da מציג את הפסגות עבור [M + H]+ -m/z 2,888 (2,890 הצפוי) עבור MCP-1 ו- m/z 5,758 (5,760 הצפוי) עבור DSPE-יתד (2000)-MCP-1. (ד) MALDI-TOF המונית, הספקטרום של DSPE-יתד (2000)-מקושקשת בטווח של 1,000-10,000 Da מציג את הפסגות עבור [M + H]+ -m/z 2,887 (2,890 הצפוי) עבור פפטיד מקושקשות ו- m/z 5,761 (5,760 הצפוי) עבור DSPE-פג-מקושקשת. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56625/56625fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56625/56625fig3.jpg"> איור 3 : TEM תמונות של פאם MCP-1 (א) מהחסכונות פאם (B). סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. התפלגות גודל המספר הממוצע של פאם MCP-1 (ג) מהחסכונות פאם ויה DLS (D). הנתונים הם זאת אומרת ± ש (n = 3). (E) ניתוח תקליטור של MCP-1 ופפטידים מקושקשות ו PAMs (n = 3). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56625/56625fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56625/56625fig4.jpg"> איור 4 : במבחנה הכדאיות של ה-וואי 274.1 ומונוציטים מאתר לאחר חשיפה 72 h MCP-1 פפטיד, פאם MCP-1, פפטיד מקושקשות, ו PAM. מעורבלות הנתונים הם זאת אומרת ± ש (n = 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56625/56625fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56625/56625fig5.jpg"> איור 5: תמונות CLSM של פאם MCP-1 (א) ו פאם מקושקשות (B) משולב עם מול 10% Cy5 הרשות הפלסטינית (אדום) מודגרות עם ה-וואי 274.1 עבור סרגל קנה מידה ה' 1 = 20 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56625/56625fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>PAMs</td>
			<td>קוטר מספר-Ave (אן אם)</td>
			<td>PDI</td>
			<td>פוטנציאל זטה (mV)</td>
		</tr>
<tr>
<td>MCP-1</td>
			<td>15.3 ± 2.0</td>
			<td>0.119 ± 0.006</td>
			<td>12.1 ± 3.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ביצים מקושקשות</td>
			<td>16.9 ± 1.4</td>
			<td>0.232 ± 0.019</td>
			<td>13.7 ± 1.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">נמדד ב- PBS מאגר. הנתונים מבוטאים אומר ± SD.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: גודל, polydispersity, ופוטנציאל זטה של PAMs.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>-סליל (%)</td>
			<td>b-גיליונות (%)</td>
			<td>סליל אקראי (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>פפטיד MCP-1</td>
			<td>0.0 ± 0.0</td>
			<td>36.2 ± 2.2</td>
			<td>63.8 ± 1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>פאם MCP-1</td>
			<td>0.7 ± 0.6</td>
			<td>46.2 ± 0.9</td>
			<td>53.1 ± 1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>פפטיד מקושקשות</td>
			<td>0.0 ± 0.0</td>
			<td>43.7 ± 2.1</td>
			<td>56.3 ± 3.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>פאם מקושקשות</td>
			<td>0.0 ± 0.0</td>
			<td>60.7 ± 0.2</td>
			<td>39.3 ± 0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: מבנה שניוני קומפוזיציה של פפטידים, PAMs.

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis at JoVE.com

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

מאמר זה מציג שיטה המערבים את סינתזה ואפיון של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין, מבחני המתאימה כדי לבדוק את התאימות והיכולת של מיצלה כדי לאגד ומונוציטים.

סינתזה של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין עבור הדמיה של טרשת עורקים

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

synthesis-monocyte-targeting-peptide-amphiphile-micelles-for-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K Views.  University of Southern California. מאמר זה מציג שיטה המערבים את סינתזה ואפיון של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין, מבחני המתאימה כדי לבדוק את התאימות והיכולת של מיצלה כדי לאגד ומונוציטים.

Video: Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.

An example of a nano drug based on polymalic acid is presented towards the rational design of personalized medicine that is applicable to cancer. It describes the synthesis of a nano drug to treat Her2-positive human breast cancer in a nude mouse.

Biopolymers מבוסס חומצת Polymalic ננו עבור מיקוד של גידול סמנים מרובים: הזדמנות לרפואה מותאמת אישית?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

Chemistry

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

גישה קלילה ויעילה לייצור ההפיך דיסולפיד צולב Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Biochemistry

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR הדמיה המולקולרית של סרטן הערמונית עם חומר ניגוד ממוקד המולקולרי קטן CLT1 פפטיד

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Medicine

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting self-assembled supramolecular structures. The synthetic route takes advantage of solid-phase peptide synthesis with the on-resin coupling of the dithiolane precursor molecule, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl)propanoic acid, and the microwave-assisted thioacetate deprotection of the peptide N-terminus before final cleavage from the resin to yield the 1,2-dithiolane modified peptide. After the high-performance liquid chromatography (HPLC) purification of the 1,2-dithiolane peptide, derived from the nucleating core of the A&#946; peptide associated with Alzheimer&#39;s disease, the peptide is shown to self-assemble into cross-&#946; amyloid fibers. Protocols to characterize the amyloid fibers by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), circular dichroism spectroscopy (CD) and transmission electron microscopy (TEM) are presented. The methods of N-terminal modification with a 1,2-dithiolane moiety to well-characterized self-assembling peptides can now be explored as model systems to develop post-assembly modification strategies and explore dynamic covalent chemistry on supramolecular peptide nanofiber surfaces.

A protocol for the synthesis of a 1,2-dithiolane modified peptide and the characterization of the supramolecular structures resulting from the peptide self-assembly.

סינתזה ואפיון של 1, 2-Dithiolane ששינה פפטידים וההספק עצמית

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

ניתוח הכנת photoacoustic של כלי רכב ניידים המכילים Nanorods הזהב

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

סינתזה מיקרוגל מונחה של תחמוצת ברזל חלקיקים עבור איתור מהיר של טרשת עורקים

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

סינתזה של Functionalized 10-nm פולימר מצופה זהב חלקיקים אנדותל הכוונת משלוח סמים

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Immunology and Infection

Preparation and Characterization of Targeted Microbubbles

Targeting of microbubbles (ultrasound contrast agents for molecular imaging) has been researched for more than two decades. However, methods of microbubble preparation and targeting ligand attachment are cumbersome, complicated, and lengthy. Therefore, there is a need to simplify the targeted microbubble preparation procedure to bring it closer to clinical translation. The purpose of this publication is to provide a detailed description and explanation of the steps necessary for targeted microbubble preparation, functional characterization and testing. A sequence of the optimized and simplified procedures is presented for two systems: a biotin-streptavidin targeting pair model, and a cyclic RGD peptide targeting the recombinant &#945;v&#946;3 protein, which is overexpressed on the endothelial lining of the tumor neovasculature.
Here, we show the following: covalent coupling of the targeting ligand to a lipid anchor, assessment of the reagent quality, and tests that confirm the successful completion of the reaction; preparation of the aqueous precursor medium containing microbubble shell components, followed by microbubble preparation via amalgamation; assessment of the efficacy of lipid transfer onto the microbubble stabilizer shell; adjustment of microbubble size distribution by flotation at normal gravity to remove larger microbubbles that might be detrimental for in vivo use; assessment of microbubble size distribution by electrozone sensing; evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a static binding assay test (in an inverted dish); and evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a parallel plate flow chamber test.

The goal of this protocol is to prepare, purify and characterize gas-filled microbubbles (targeted contrast agents for ultrasound molecular imaging). Two targeting systems are described: biotinylated bubbles adherent to streptavidin, and cyclic RGD peptide microbubbles that bind to &#945;v&#946;3, a known tumor neovasculature biomarker.