Name: synthesis of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles for imaging of atherosclerosis
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
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Os autores gostaria de agradecer o apoio financeiro da University of Southern California, o coração nacional, pulmão e Instituto de sangue (NHLBI), R00HL124279, Eli e Edythe amplo Innovation Award e o L.K. Whittier Fundação Non-câncer Prêmio de pesquisa translacional concedida a EJC. Os autores agradecer o centro de microscopia eletrônica e microanálise, centro de excelência em NanoBiophysics, centro de excelência para a caracterização Molecular e Translational Imaging Center na Universidade de Southern California para assistência em configurações de instrumentais.

Nota: Leia o MSDS para reagentes e siga todas as medidas de segurança química, conforme exigido pela instituição local.
1. preparação de MCP-1 PAMs
<ol><li>
Preparação de peptídeo de MCP-1
	<ol>
<li>Pesar 0,25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang em uma embarcação da reação (RV). Enxágue o lado do VD com 5 mL dimethylforamide (DMF) em uma coifa de química.</li>
		<li>Carrega o RV em um sintetizador de peptídeo de bancada automatizada. Frascos de aminoácido de carga pré-embalados, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', do C a N-terminal. Incluem um frasco vazio no final para a etapa final de desproteção. Nota: Um peptide mexido com sequência, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', pode também ser sintetizada utilizando o mesmo protocolo.</li>
		<li>Finalizada a síntese, transferi os peptídeos na resina do RV para o frasco de cintilação com 2-3 mL de metanol até todas as resinas são transferidas. Depois que a resina afundou-se no fundo, remover o sobrenadante de metanol e evaporar o restante até secar. Vácuo seco para um adicional 2 h ou durante a noite em temperatura ambiente.</li>
		<li>Fazer 12 mL de solução de clivagem contendo trifluoracetic ácido (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 vol % em uma coifa de química. Agite a solução de clivagem para certificar-se que uniformemente misturado. Cuidado: Porque triisopropylsilane e Etanoditiol são sensíveis ao ar, argônio limpar estoque frascos de triisopropylsilane e Etanoditiol por 1 min antes de colocá-los de volta.</li>
		<li>Coloque o recipiente de síntese (SV) em um agitador de braço pela metade do SV de aperto na parte inferior. Transferência do peptide-resina para o SV com 2 mL de solução de clivagem até que todos os peptídeo-resinas são transferidos.</li>
		<li>Lave os lados do SV com 3 mL de solução de clivagem. Feche a tampa do SV e agitar em 300 oscilações/min durante 4 h.</li>
		<li>Pese um tubo de centrifugação de 50 mL vazio. Recorde a massa.</li>
		<li>Após 4 h, drene a solução de peptídeo clivada de SV no tubo de centrífuga de 50 mL. Enxágue o SV várias vezes com o restante da solução clivagem.</li>
		<li>Evapore a solução de peptídeo clivados com nitrogênio até há menos de 4 mL restantes no tubo de centrífuga.</li>
		<li>Adicione 36 mL de éter gelada para a solução de peptídeo-fendida.</li>
		<li>Vórtice a solução até que ele é completamente branca ou amarela. Centrifugar a 3.000 x g por 5 min a 4 ° C e decante o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione éter gelada de 40 mL para o tubo. Vórtice e proceda à sonicação novamente. Repita o processo de centrifugação. Decante o sobrenadante.</li>
		<li>Seca o sedimento de PA bruto com purgação com gás nitrogênio até o éter é evaporado visivelmente.</li>
		<li>Adicionar 20 mL bidestilada água, vórtice e proceda à sonicação até o peptídeo é completamente dissolvido em solução.</li>
		<li>Congelar a solução e lyophilize até secar.</li>
		<li>Uma vez seco o peptídeo, pese a massa do tubo de centrífuga contendo o peptídeo bruto. Dissolva o peptídeo bruto em 5 mg/mL de água.</li>
		<li>Dissolva 25 mg de bruto do peptide de MCP-1 em 5 mL de água bidestilada para fazer uma concentração total de 5 mg/mL. Purificar o peptídeo de MCP-1 bruto por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) utilizando 0,1% TFA em água (solvente A) e 0,1% TFA em acetonitrila (solvente B) como fases móveis em uma coluna de fase reversa C8. Os 5 mL do peptide injete a HPLC. Nota: A fase móvel inicial consistia em 100% solvente A um débito de 9,0 mL/min. diminuir solvente A lentamente para 30% em 27 min e manter esta composição de 3 min. o gradiente de solvente 100% de retorno um 3 min e espera para esta composição para 1 min dar um tempo de execução total de 34 min. manter a temperatura da coluna a 55 ° C. Use o modo de fonte de íon positivo para a análise. Ácido fórmico pode ser usado no lugar do TFA, se TFA é muito ácido para a coluna HPLC. Recomenda-se que a velocidade de subida de composição solvente orgânico não deve exceder 2%/min para melhor separação.</li>
		<li>Analise cada fração usando espectrometria de massa do laser assistida por matriz (MALDI) de dessorção/ionização o produto esperado m/z no 2.890. Nota: Dissolver ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos a 1 mg/mL em acetonitrila/água (50: 50% de vol) como a solução de matriz. Aviste 0,75 µ l da solução de matriz na chapa de MALDI, seguida de 0,75 µ l de cada fração. Realizar a análise utilizando um modo reflexivo de íon positivo em uma faixa de massa de 500-5.000 Da.</li>
		<li>Combine fracções de produto, explodir acetonitrilo, congelar e lyophilize peptídeos purificados até secar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de MCP-1 PA
	<ol>
<li>Prepare um excesso molar 1.1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide de peptídeo em frascos separados de cintilação. Dissolver os dois compostos em água bidestilada tornar ~ 15 mg/mL. Proceda à sonicação por 15 min ou até que ambas as soluções são completamente claras. Nota: DSPE-PEG (2000)-Cy5 é sintetizado usando o mesmo protocolo com DSPE-PEG-amina (2000) e N-Hidroxisuccinimida (NHS) acrescida de éster Cy5, exceto passo 1.2.3, onde o pH da solução é ajustado para 8,5.</li>
		<li>Adicione DSPE-PEG (2000)-maleimide solução para a solução de peptídeo. Vórtice e proceda à sonicação.</li>
		<li>Adicionar 1 M NaOH gota a gota (1 µ l) de cada vez até que o pH da solução é 7.</li>
		<li>Solução de expurgo de nitrogênio por 5 min. agitar a solução durante a noite.</li>
		<li>Congelar a solução e lyophilize até secar.</li>
		<li>Uma vez seco o produto bruto, dissolva o sólido em 5 mg/mL de água.</li>
		<li>Purifica com HPLC como descrito acima. Nota: Na Unconjugated peptídeo e DSPE-PEG(2000) eluir entre 15-30% de concentração orgânica (% vol), enquanto DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugado deve eluir entre 40-50% de concentração de orgânicos.</li>
		<li>Analise cada fração usando espectrometria de massa MALDI para o correspondente m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 deve ter um pico m/z amplo no 5.760. Nota: o ácido benzoico-2,5 é melhor usado como matriz para DSPE-PEG (2000)-MCP-1 com MALDI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem de MCP-1 PAMs
	<ol>
<li>Dissolver 1,75 mg PAs de MCP-1, com 3 mL de metanol em um frasco de dram com 1. Proceda à sonicação até o MCP-1 PA é completamente dissolvido. Nota: Amphiphiles Cy5 podem ser incorporados em uma relação molar de 10:90 MCP-1 PA para aplicativos de imagem.</li>
		<li>Evapore o metanol sob nitrogênio em movimentos circulares enquanto enxaguar o restante metanol fora do frasco até um filme uniforme é formado na parte inferior do frasco. Vácuo-seco o filme durante a noite.</li>
		<li>Hidrate o filme com 3 mL de tampão de água ou fosfato salino (PBS) para fazer uma solução de 100 µM de MCP-1 PAMs. Suavemente o vórtice e proceda à sonicação a solução até que desobstruído. Incube a 80 ° C por 30 min. Nota: A temperatura elevada tem sido mostrada para acelerar o processo auto-montagem e permite que o componente de peptídeo formar a estrutura secundária mais estável, reduzindo a concentração (CMC) de crítica micelle42,43.</li>
		<li>Legal a dispersão resultante a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. caracterização de MCP-1 PAMs
<ol><li>
Difusão dinâmica da luz (DLS) e potencial zeta
	<ol>
<li>Lugar de 100 µM de MCP-1 PAM ou mexida PAM em uma cubeta de acordo com as instruções do instrumento potencial DLS ou zeta. Nota: DLS e zeta potenciais cubetas podem ser diferentes com base nas instruções do instrumento.</li>
		<li>Equilibrar o instrumento à temperatura ambiente. Medir o tamanho e carga superficial do PAM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
	<ol>
<li>Adicionar 7 µ l de 50 µM MCP-1 PAM ou mexida PAM para um grid TEM suspensos dentro de uma pinça de auto-fechamento 5 min. pavio fora a gota com uma limpeza delicada tarefa.</li>
		<li>Adicione 7 µ l de água para lavar a grade. Pavio-embora o droplet.</li>
		<li>Adicione 7 µ l de ácido fosfotúngstico 1 wt % por 2 min. pavio fora da gota. Repita a etapa 2.2.2.</li>
		<li>Seque a grade TEM antes da análise de temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Espectroscopia de Dicroísmo circular (CD)
	<ol>
<li>Ligue o nitrogênio por 5-10 min antes da utilização do instrumento.</li>
		<li>Coloque 300 µ l de espaço em branco (água ou PBS) na cubeta.</li>
		<li>Medir espectros no 190-265 nm, 0.2 mm-comprimento do percurso com um tempo de integração s 1 e uma largura de 1, banda nm na temperatura ambiente. Colete 3 repetições.</li>
		<li>Peptídeo de MCP-1 medida de 100 µM, MCP-1 PAM, mexidos do peptide e mexidos PAM sob a mesma condição descrita na etapa 2.3.3. Subtrai o espaço em branco.</li>
		<li>Ajuste os dados usando uma interpolação linear dos espectros de base polylysine.</li>
		<li>Desligue o instrumento. Espere 10 min antes de desligar o nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. análise in Vitro de MCP-1 PAMs
<ol><li>
Biocompatibilidade in vitro
	<ol>
<li>Cultura e expandir WEHI 274.1 murino monócitos em modificado Eagle suplementado de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina-estreptomicina e 0,05 mM 2-Mercaptoetanol em 37 ° C abaixo de 5% de CO2 para passagem 5. Nota: WEHI 274.1 são células de suspensão. Quando o cultivo, a mídia deve ser alimentada a cada 2-3 dias.</li>
		<li>Monócitos de pipeta nos meios de comunicação em um tubo de centrífuga de 50ml estéril. Centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Aspirar a velha mídia e ressuspender em mídia fresco 10 mL no tubo de centrífuga. Misture lentamente até que as células são distribuídas uniformemente na mídia. Conte as células com coloração azul trypan e um hemocytometer.</li>
		<li>Dilua as células que existem 4.000 monócitos por 90 µ l de mídia por bem. Adicione 90 µ l de células em poços de uma placa de 96 poços. Incube durante 24 h. Nota: Evite usar os poços na borda exterior da placa para evitar diferenças de evaporação e mudanças térmicas na placa. Encha os poços exteriores com 100 µ l PBS.</li>
		<li>Dissolva 0,15 µmol de peptídeo MCP-1, PAM de MCP-1, peptídeo mexido ou ovos mexidos-PAM em 150 µ l PBS, em separado, esterilizado microcentrifuga tubos. Realize uma diluição serial para fazer 65 µ l de 1, 10 e 100 µ m de cada amostra.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l PBS de cada concentração em poços contendo WEHI 274.1 (total volume: 100 µ l por bem, 6 linhas, 96 poços totais). Incube durante 72 h.</li>
		<li>Adicionar 10 µ l (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) em cada poço. Incube durante 1 h.</li>
		<li>Analisar a absorvância usando um leitor de placas em 490 nm ou com base nas instruções do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vinculação de micela em vitro
	<ol>
<li>Monócitos de semente 500.000 em cada poço de uma placa de 6 em 2 mL de mídia contendo 100 µM Cy5-rotulado PAM de MCP-1 (10:90 razão molar de DSPE-PEG (2000)-Cy5 e MCP-1 PA). Incube durante 1 h.</li>
		<li>Coletar WEHI 274.1 por centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire os meios de comunicação.</li>
		<li>Resuspenda e lavar as células em 2 mL de PBS. Centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire a PBS. Repita o processo de lavagem com 2 mL de PBS. Aspire a PBS.</li>
		<li>Adicione 2 mL de frio paraformaldeído 4% para consertar as células. Incube a temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Pipetar as células fixas sobre uma lamela de vidro estéril dentro poços de uma placa de 6. Centrifugar a 400 x g durante 5 min.</li>
		<li>Remova o paraformaldeído. Lave e enxágue com 2 mL de PBS uma vez. Resuspenda com 1 mL de PB Nota: Quando enxaguar, evite perturbar as células no sentido da lamela.</li>
		<li>Colocar 10 µ l de 90% de glicerol em PBS para um slide. Use uma agulha e uma pinça para pegar a lamela. Seque a extremidade da lamela. Coloque delicadamente a lamela numa lâmina voltada para baixo.</li>
		<li>Selo gentilmente a extremidade da lamela com esmaltes claros. Coloque na geladeira até que esteja pronto para a imagem latente.</li>
		<li>Usar um laser confocal microscópio (CLSM) instalado com lasers para Cy5 em λexcitação = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

MCP-1 PAMs são uma promissora plataforma de imagem molecular, consistindo de um peptídeo alvo hidrofílico e cauda hidrofóbica que impulsiona a natureza Self montada das nanopartículas. Este micelle monócito-direcionamento pode ser preparado por síntese simples e etapas de purificação de peptídeo de MCP-1 e DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs têm muitas características benéficas na vivo imagem molecular tais como seus auto-montagem sob condições suaves, biodegradabilidade intrínseca e diversidade estrutur...

As doenças cardiovasculares continuam a ser as principais causas de morte globalmente com aproximadamente 17,3 milhões de mortes em todo o mundo1. Doenças cardiovasculares são contribuídas por aterosclerose, uma condição em que acumulam placas nas artérias, inibindo assim, sangue e fluxo de oxigênio para as células do corpo2,3. A progressão da aterosclerose envolve o espessamento e endurecimento das artérias por uma resposta inflamatória, metabolismo lipídico irregular e acúmulo de placa bacteriana, levando a placa ruptura e infarto do miocárdio,4,5. Células endoteliais expressam moléculas de aderência e citocinas, que incluem MCP-1 que se liga ao receptor chemokine CC (CCR2) encontrado na superfície de monócitos6,7,8. Colesterol oxidado converte os monócitos em macrófagos durante a fase inicial da formação de placa bacteriana, que amplifica a resposta inflamatória na região e leva à lesão tecidual e a formação de placas instáveis ou vulneráveis9, 10.
Tradicionalmente, a aterosclerose é avaliada através da avaliação de estenose luminal por imagens anatômicas usando ultra-som ou angiografia11,12. No entanto, esses métodos somente podem determinar estreitamento grave da parede arterial e não na fase inicial da aterosclerose, como crescimento de placa inicial provoca remodelamento arterial manter o tamanho da artéria e sangue fluxo taxa12,13, 14. Portanto, angiografia sub-representar prevalência de aterosclerose. Além disso, técnicas de imagem não-invasivas, tais como emissão de fóton único computadorizada tomografia computadorizada, ressonância magnética e tomografia por emissão de pósitrons recentemente tem sido usados para caracterizar a morfologia da placa, como eles podem fornecer detalhes iniciais e caracterização de placas. No entanto, estas modalidades são muitas vezes limitadas pela falta de sensibilidade, resolução espacial, ou exigem o uso de radiação ionizante, fazendo a progressão de placa de imagem em diferentes fases muito mais desafiador15,16, 17. Um sistema de entrega de imagens que iria identificar especificamente placas em diferentes estágios da aterosclerose permanece para ser desenvolvido.
As nanopartículas têm demonstrado ser uma plataforma emergente para na vivo placa diagnóstico e direcionamento18,19,20,21. Em particular, PAMs são vantajosas devido a sua diversidade química e capacidade para acomodar uma variedade de partes, composições, tamanhos, formas e superfície functionalization22. Amphiphiles peptídeo (PAs) consistem de um peptídeo hidrofílico, "headgroup" anexado a uma cauda hidrofóbica, que normalmente são lípidos; Essa estrutura anfifílica confere capacidades auto-montagem e permite uma visualização multivalentes dos peptídeos na superfície da partícula22,23,24. O headgroups de peptídeo pode afetar a forma das partículas através de dobramento e hidrogénio entre peptídeos25. Peptídeos que dobra através da interação de β-folha têm sido mostrados para formar micelas alongadas, enquanto confirmação α-hélice pode formar ambos micelas esféricas e alongadas22,23,24, 2526,de,27. Polietileno glicol (PEG) linkers que protegem a carga superficial do peptide podem ser colocados entre o peptídeo hidrofílico e cauda hidrofóbica do PAMs, aumentando a disponibilidade da nanopartículas na circulação sistêmica28, 29 , 30 , 31. PAMs também são vantajosas porque são biocompatíveis e tem sido demonstrados que têm uma ampla gama de aplicações de32,33. A solubilidade em água de micelas oferece uma vantagem sobre outros sistemas baseados em nanopartículas como certas nanopartículas poliméricas que não são solúveis em água e tem que ser suspenso em solubilizers para injeções34. Além disso, a capacidade de criar PAMs que desmontagem em resposta a um estímulo específico torna PAMs um candidato atraente para drogas intracelular controlada entrega35.
Vinculando-se ao receptor CCR2 e acumular-se no arco aórtico, PAMs anteriormente foram desenvolvidas para monócitos direcionamento para monitorar diferentes fases de lesões ateroscleróticas na aorta9. Em ApoE- / - ratos, acúmulo de monócitos aumenta proporcionalmente a placa progressão36. Além disso, verificou-se que pacientes com estágio final, sujeitos a ruptura de placas contêm quantidades mais elevadas de monócitos37. Portanto, a modificação do PAMs incorporar MCP-1 é útil porque permite maior especificidade de segmentação e diferenciação entre lesões ateroscleróticas e tarde-estágio inicial. Estes estudos de prova de conceito também verificado que PAMs são seguras o suficiente ser usado em pré-clinicamente e são limpas em38. Desde que os monócitos e inflamação são característicos de outras doenças, MCP-1 PAMs têm o potencial para ser usado para aplicações de diagnósticos e terapêuticas em outras doenças além da aterosclerose8,39,40 , 41.
Neste documento, nós relatamos a fabricação de altamente escalável e self montado MCP-1 PAMs que demonstrou o tamanho ideal da partícula, carga de superfície e seleção de alvos para monócitos para aplicativos de imagem aprimorados em aterosclerose.

<table><tbody><tr><td>1,2-ethanedithiol</td><td>VWR</td><td>E0032</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>10 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes, polypropylene</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC165200050</td><td>for MALDI</td></tr><tr><td>25 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, 50 mM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>5 mL disposable serological pipets</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>75 cm2 culture flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-65</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>75 mL reaction vessel</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>96-wells cell culture plate</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td>for MTS assay</td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Borosilicate glass, 1 dram</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>for PAM synthesis</td></tr><tr><td>Borosillicate glass pipet, Long tips</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Cy5 amine</td><td>Abcam</td><td>ab146463</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>Diethyl ether, ACS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>for peptide precipitation</td></tr><tr><td>Disposable syringes, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Double neubauer ruled hemocytometer</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) amine</td><td>Avanti</td><td>880128P</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) maleimide</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHS ester&amp;nbsp;</td><td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td><td>for conjugation to Cy5</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium-high glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh</td><td>Novabiochem</td><td>856013</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Formic acid, optima LC/MS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>for HPLC purification</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Hand tally counter</td><td>Fisher Scientific</td><td>S90189</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Magnetic stir bars, egg-shaped</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td>for peptide conjugation</td></tr><tr><td>Methanol, ACS certified</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>for PAM synthesis</td></tr><tr><td>MTS cell proliferation colorimetric assay kit</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>for MTS assay</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide, sequencing grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine</td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416780250</td><td>for fixing cells</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>for various applications</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Peptide synthesis vessel, 25 mL&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>CG186011</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Phosphotungstic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Spectrum</td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>for peptide synthesis</td></tr><tr><td>Plain glass microscope slide 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>Reagent reservoirs, sterile&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>95128093</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Self-closing tweezer</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>TEM support film</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>for TEM</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP618-500</td><td>for peptide cleavage and HPLC purification</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5ml</td><td>for peptide cleavage</td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0.4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td>for cell counting</td></tr><tr><td>Tweezer, general purpose-serrated</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td><td>for confocal microscopy</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;CRL-1679</td><td>murine monocyte</td></tr><tr><td>automated benchtop peptide synthesizer</td><td>Protein Technologies</td><td></td><td>PS3 Benchtop Peptide Synthesizer</td></tr><tr><td>&amp;alpha;- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>476870-2G</td><td>for MALDI</td></tr></tbody></table>

synthesis of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles for imaging of atherosclerosis

A aterosclerose é dos principais contribuintes para doenças cardiovasculares, a principal causa de morte no mundo, que reivindica a 17,3 milhões de vidas anualmente. A aterosclerose é também a principal causa de morte súbita e infarto do miocárdio, instigada por placas instáveis que se romper e obstruir o vaso sanguíneo sem aviso. Corrente de imagens modalidades não pode diferenciar entre placas estáveis e instáveis que se romper. Micelas de amphiphiles peptídeo (PAMs) podem superar esta desvantagem, como eles podem ser modificados com uma variedade de direcionamento metades que ligam especificamente ao tecido doente. Os monócitos foram mostrados para ser marcadores início da aterosclerose, enquanto grande acúmulo de monócitos é associado com placas propensas a ruptura. Daí, nanopartículas que podem direcionar os monócitos podem ser usadas para discriminar os diferentes estágios da aterosclerose. Para esse fim, descrevemos aqui, um protocolo para a preparação de monócitos-direcionamento PAMs (monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs self são montadas através de síntese em condições suaves a forma nanopartículas de 15 nm de diâmetro, com perto de carga de superfície neutra. In vitro, PAMs foram encontradas para ser biocompatível e tinha uma afinidade de ligação de alta para os monócitos. Os métodos descritos neste documento são promissores para uma ampla gama de aplicações em aterosclerose, bem como outras doenças inflamatórias.

Preparação de MCP-1 PAM O CCR2-motivo (resíduos 13-35) da proteína de MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] ou mexido peptídeo [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] foi modificado com a adição de um resíduo de cisteína na N-terminal. O peptídeo de MCP-1 foi sintetizado por um método de fase sólida Fmoc-negociada usando um sintetizador de peptídeo automatizado. O peptídeo bruto foi purificado por HPLC de fase reversa em uma coluna de C8 a 50 ° C, utilizando 0,1% TFA em mist...

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Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Este trabalho apresenta um método que envolve a síntese e caracterização de micelas de amphiphile peptídeo monócito-direcionamento e o correspondente ensaios para testar a capacidade do micelle para vincular a monócitos e biocompatibilidade.

Síntese de monócitos-direcionamento do Peptide Amphiphile micelas para a imagem latente da aterosclerose

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

synthesis-monocyte-targeting-peptide-amphiphile-micelles-for-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K visualizações.  University of Southern California. Este trabalho apresenta um método que envolve a síntese e caracterização de micelas de amphiphile peptídeo monócito-direcionamento e o correspondente ensaios para testar a capacidade do micelle para vincular a monócitos e biocompatibilidade.

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Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this diversity, personalized medicine is developed for silencing malignancy associated genes. Nano drugs fit these needs by targeting tumor and delivering antisense oligonucleotides for silencing of genes. As drugs for the treatment are often administered repeatedly, absence of toxicity and negligible immune response are desirable. In the example presented here, a nano medicine is synthesized from the biodegradable, non-toxic and non-immunogenic platform polymalic acid by controlled chemical ligation of antisense oligonucleotides and tumor targeting molecules. The synthesis and treatment is exemplified for human Her2-positive breast cancer using an experimental mouse model. The case can be translated towards synthesis and treatment of other tumors.

An example of a nano drug based on polymalic acid is presented towards the rational design of personalized medicine that is applicable to cancer. It describes the synthesis of a nano drug to treat Her2-positive human breast cancer in a nude mouse.

À base de ácido Polymalic Nano Biopolímeros para Segmentação de múltiplos marcadores tumorais: uma oportunidade para a medicina personalizada?

Tumors with similar grade and morphology often respond differently to the same treatment because of variations in molecular profiling. To account for this ...

Química

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Bioquímica

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR Imagem Molecular do cancro da próstata com um pequeno Molecular CLT1 Peptide alvejado agente de contraste

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Medicina

Synthesis and Characterization of 1,2-Dithiolane Modified Self-Assembling Peptides

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting self-assembled supramolecular structures. The synthetic route takes advantage of solid-phase peptide synthesis with the on-resin coupling of the dithiolane precursor molecule, 3-(acetylthio)-2-(acetylthiomethyl)propanoic acid, and the microwave-assisted thioacetate deprotection of the peptide N-terminus before final cleavage from the resin to yield the 1,2-dithiolane modified peptide. After the high-performance liquid chromatography (HPLC) purification of the 1,2-dithiolane peptide, derived from the nucleating core of the A&#946; peptide associated with Alzheimer&#39;s disease, the peptide is shown to self-assemble into cross-&#946; amyloid fibers. Protocols to characterize the amyloid fibers by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), circular dichroism spectroscopy (CD) and transmission electron microscopy (TEM) are presented. The methods of N-terminal modification with a 1,2-dithiolane moiety to well-characterized self-assembling peptides can now be explored as model systems to develop post-assembly modification strategies and explore dynamic covalent chemistry on supramolecular peptide nanofiber surfaces.

A protocol for the synthesis of a 1,2-dithiolane modified peptide and the characterization of the supramolecular structures resulting from the peptide self-assembly.

Síntese e caracterização de 1,2-Ditiolano modificado peptídeos auto-montagem

This report focuses on the synthesis of an N-terminus 1,2-dithiolane modified self-assembling peptide and the characterization of the resulting ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Preparação e Fotoacústica Análise de Veículos celulares contendo ouro nanobastões

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Bioengenharia

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Síntese orientada por microondas de óxido de ferro nanopartículas para detecção rápida de Aterosclerose

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

Avaliação inicial do anticorpo cojugado modificado com peptídeos virais-derivado para aumentar a acumulação celular e melhorando o direcionamento do Tumor

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

Síntese de funcionalizados 10 nm polímero-revestida com partículas de ouro para o direcionamento do endotélio e entrega da droga

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Quantificação de transmigração de monócitos e formação de célula de espuma de indivíduos com doenças inflamatórias crônicas

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Imunologia e Infecção

Preparation and Characterization of Targeted Microbubbles

Targeting of microbubbles (ultrasound contrast agents for molecular imaging) has been researched for more than two decades. However, methods of microbubble preparation and targeting ligand attachment are cumbersome, complicated, and lengthy. Therefore, there is a need to simplify the targeted microbubble preparation procedure to bring it closer to clinical translation. The purpose of this publication is to provide a detailed description and explanation of the steps necessary for targeted microbubble preparation, functional characterization and testing. A sequence of the optimized and simplified procedures is presented for two systems: a biotin-streptavidin targeting pair model, and a cyclic RGD peptide targeting the recombinant &#945;v&#946;3 protein, which is overexpressed on the endothelial lining of the tumor neovasculature.
Here, we show the following: covalent coupling of the targeting ligand to a lipid anchor, assessment of the reagent quality, and tests that confirm the successful completion of the reaction; preparation of the aqueous precursor medium containing microbubble shell components, followed by microbubble preparation via amalgamation; assessment of the efficacy of lipid transfer onto the microbubble stabilizer shell; adjustment of microbubble size distribution by flotation at normal gravity to remove larger microbubbles that might be detrimental for in vivo use; assessment of microbubble size distribution by electrozone sensing; evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a static binding assay test (in an inverted dish); and evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a parallel plate flow chamber test.

<meta charset="utf8"></head><body>Preparação e caracterização de microbolhas direcionadas

The goal of this protocol is to prepare, purify and characterize gas-filled microbubbles (targeted contrast agents for ultrasound molecular imaging). Two targeting systems are described: biotinylated bubbles adherent to streptavidin, and cyclic RGD peptide microbubbles that bind to &#945;v&#946;3, a known tumor neovasculature biomarker.