אנו מודים טיילור AuBuchon-אלדר, ירדן Teisher, קריסטינה Zudock לעזרה בארגון דגימה עשבייה דגימות, ואת הגן הבוטני מיזורי לגישה עשבייה דגימות לדיגום הרסני. עבודה זו הייתה תמיכה על ידי מענק של הקרן הלאומית למדע (דב-1457748).

<ol>
	<li>Savolainen, V., Cu&#233;noud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Cr&#232;vecoeur, M., Manen, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+herbarium+specimens+in+DNA+phylogenetics:+Evaluation+and+improvement.">The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement.</a> Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).</li><li>Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Museomics+illuminate+the+history+of+an+extinct,+paleoendemic+plant+lineage+(Hesperelaea,+Oleaceae)+known+from+an+1875+collection+from+Guadalupe+Island,+Mexico.">Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico.</a> Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).</li><li>Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphyly+of+Arundinoideae+(Poaceae)+and+Evolution+of+the+Twisted+Geniculate+Lemma+Awn.">Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn.</a> Ann Bot. , (2017).</li><li>Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+time+and+space:+the+use+of+herbarium+specimens+to+reconstruct+patterns+of+genetic+variation+in+the+endangered+orchid+Anacamptis+palustris.">Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris.</a> Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).</li><li>Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+museum+specimens+in+population+genetics.">Back to the future: museum specimens in population genetics.</a> Tre Eco &amp; Evo. 22 (12), 634-642 (2007).</li><li>Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+herbarium+specimens+are+needed+to+detect+threatened+species?.">How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?.</a> Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).</li><li>Saltonstall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+invasion+by+a+non-native+genotype+of+the+common+reed,+Phragmites+australis,+into+North+America.">Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America.</a> PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).</li><li>Besnard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+museums+to+genomics:+old+herbarium+specimens+shed+light+on+a+C3+to+C4+transition.">From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition.</a> J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).</li><li>S&#228;rkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+open+the+treasure+chest?+Optimising+DNA+extraction+from+herbarium+specimens.">How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).</li><li>Harris, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+analysis+of+tropical+plant+species:+An+assessment+of+different+drying+methods.">DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods.</a> Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).</li><li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+plant+herbarium+tissue.">DNA damage in plant herbarium tissue.</a> PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).</li><li>Bakker, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbarium+genomics:+plastome+sequence+assembly+from+a+range+of+herbarium+specimens+using+an+Iterative+Organelle+Genome+Assembly+pipeline.">Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline.</a> Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).</li><li>Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+fungal+DNA,+the+source+of+contamination+in+spruce+needle+DNA.">Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA.</a> Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).</li><li>Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., P&#228;&#228;bo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequences+from+multiple+amplifications+reveal+artifacts+induced+by+cytosine+deamination+in+ancient+DNA.">DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA.</a> Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).</li><li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+treasure+troves:+Complete+genome+sequencing+of+herbarium+and+insect+museum+specimens.">Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens.</a> PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).</li><li>Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbarium+genomics:+skimming+and+plastomics+from+archival+specimens.">Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens.</a> Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).</li><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).</li><li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+for+rapid+DNA+isolation+from+plant+tissue+using+cetryltrimethylammonium+bromide.">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide.</a> Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).</li><li>Twyford, A. D., Ness, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+complete+plastid+genome+seqeuncing.">Strategies for complete plastid genome seqeuncing.</a> Mol Eco Resour. , (2016).</li><li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries.">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).</li><li>Grigoriev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MycoCosm+portal:+gearing+up+for+1000+fungal+genomes.">MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes.</a> Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Herbarium Genomics. Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+rapid+diversification+and+convergent+origins+of+active+pollination+within+Agavoideae+(Asparagaceae).">Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae).</a> Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).</li><li>McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verdant:+automated+annotation,+alignment,+and+phylogenetic+analysis+of+whole+chloroplast+genomes.">Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes.</a> Bioinf. , (2016).</li><li>Staton, S. E., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome:+A+toolkit+for+annotation+of+transposable+element+families+from+unassembled+sequence+reads.">Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads.</a> Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).</li><li>Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repbase+Update,+a+database+of+repetitive+elements+in+eukaryotic+genomes.">Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes.</a> Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).</li><li>. Transposons Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>Wei&#223;, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterns+of+damage+and+decay+kinetics+of+DNA+retrieved+from+plant+herbarium+specimens.">Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens.</a> Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).</li><li>Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., P&#228;&#228;bo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterns+of+nucleotide+misincorporations+and+DNA+fragmentation+in+ancient+DNA.">Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA.</a> PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequence+capture+as+a+powerful+tool+for+evolutionary+analysis.">Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis.</a> Am J Bot. 99, 312-319 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים שיש להם אין אינטרסים מתחרים.

פרוטוקול המובאת כאן היא שיטה מקיפה וחזק עבור ספריית הכנה של צמחים מיובשים דגימות DNA בידוד וסדר. העקביות של השיטה, מינימלי צורך לשנות אותו מבוסס על יצירת איכות הדגימה זה מדרגי לפרויקטים גדולים מבוססי עשבייה רצף. ההכללה של שלב reamplification אופציונלי עבור ספריות תשואה נמוכה מאפשר הכללת באיכות נמ?...

עשבייה אוספים הם מקור ערך פוטנציאלי של מינים ושל גיוון גנומית ללימודי כולל פילוגנטיקה1,2,3, גנטיקה של אוכלוסיות4,5, שימור ביולוגיה6, מין פולש ביולוגיה7ותכונה האבולוציה8. היכולת לקבל מגוון רחב של מינים, אוכלוסיות, מיקומים גיאוגרפיים ונקודות זמן מדגיש את "אוצר"9 זה עשבייה. מבחינה היסטורית, מהות נגזר עשבייה DNA מפורק יש הפריע פרויקטים מבוססי ה-PCR, לעיתים קרובות להשכיב חוקרים באמצעות סמנים בלבד נמצאו ב העתק גבוהה, כגון אזורים של הגנום כלורופלסט או מרווח משועתקים פנימי (ITS) של ribosomal ה-RNA. האיכות של דגימות DNA להשתנות בהרחבה על השיטות לשימור9,10, עם הפסקות גדילי כפול, פיצול מהאש המשמשים בתהליך ייבוש הצורות הנפוצות ביותר של נזק, יצירת בסיס מה שנקרא 90% DNA שכלוא יש לתאר מחקרים מבוססי ה-PCR11. מלבד הפיצול, לסוגיה השנייה הכי נפוצה עשבייה גנומיקה היא זיהום, כגון זה נגזר פטריות endophytic13 או פטריות רכשה לאחר המוות לאחר אוסף אך לפני הרכבה עשבייה12, למרות זאת בעיה זו יכולה להיות bioinformatically פתור נתן את מסד הנתונים נכון פטרייתיים (ראו להלן). בעיה השלישי, פחות נפוץ, הוא שינוי רצף עד ציטוזין (C/G→T/א) דיאמינציה14, למרות מוערך יהיה נמוך (~ 0.03%) עשבייה דגימות11. עם כניסתו של תפוקה גבוהה רצף (HTS), סוגיית הפיצול ניתן להתגבר עם רצף עומק12,15, המאפשר רכישת נתונים ברמת גנומית של דגימות רבות עם איכות נמוכה של קריאות קצר ה-DNA, ואפילו לפעמים המתיר רצף הגנום כולו15.
עשבייה דגימות נעשה שימוש בתדירות גבוהה יותר, הם מרכיב גדול של פרויקטים פילוגנטי16. אתגר הנוכחי של משתמש עשבייה דגימות HTS היא בעקביות קבלת מספיק DNA נטושים כפול, תנאי הכרחי עבור רצפי פרוטוקולים, ממינים רבים מבעוד, ללא צורך לייעל שיטות עבור הפרט דגימות. בנייר זה, הוכח עבור הפקת דנ א והכנת ספריית דגימות עשבייה פרוטוקול זה מנצל שיטות קיימות ומשנה אותם כדי לאפשר תוצאות מהר ו לטבלה הניתנת לשכפול. שיטה זו מאפשרת להשלים עיבוד הדגימה לספריה של דגימות 24 h 13, עם הזמן על הידיים של 8 שעות, או ח 16, עם הזמן על הידיים 9 h, כאשר השלב reamplification אופציונלית נדרשת. עיבוד סימולטני של דגימות נוספות הוא בר השגה, אבל הגורם המגביל הוא יכולת צנטריפוגה, מיומנות טכנית. הפרוטוקול נועד דרוש רק טיפוסי ציוד מעבדה (thermocycler צנטריפוגה, דוכני מגנטי) במקום ציוד מיוחד, כגון מפוחים או sonicator, עבור הטיית ה-DNA.
איכות ה-DNA, פרגמנט גודל וכמות המגבילים את הגורמים לשימוש של עשבייה דגימות בניסויים רצף תפוקה גבוהה. שיטות נוספות לבודד דנ א עשבייה ויצירת רצף תפוקה גבוהה ספריות הראו את התועלת של שימוש רק 10 ng של הדנ א16; אולם הם דורשים השפעול קביעת המספר האופטימלי של PCR מחזורי הנדרש להכנה הספרייה. זה הופך מעשית כאשר להתמודד עם כמויות קטנות מאוד של קיימא כפול תקועים דנ א (dsDNA), כמו הדגימות עשבייה לייצר רק מספיק דנ א הכנה בספריה מסוימת. השיטה המוצגת כאן משתמש מספר בודד של מחזורים ללא קשר לאיכות הדגימה, כך אין דנ א הוא איבד ספריית אופטימיזציה שלבים. במקום זאת, צעד reamplification מופעל כאשר ספריות אינן עונות על הכמויות המינימליות לצורך עריכה ברצף. דוגמאות עשבייה רבים נדירים ושולט קצת חומר מקשה להצדיק את הדגימה הרסני במקרים רבים. כדי לשנות זאת, פרוטוקול הציג מאפשר dsDNA קלט מידות פחות מ 1.25 ng לתוך תהליך הכנה ספריה, הרחבת הטווח של דגימות קיימא עבור תפוקה גבוהה רצף וצמצום הצורך דגימה ההרסני של דגימות.
להלן כללי התנהגות יש כבר אופטימיזציה עבור עשבי, נוסה על מאות מינים שונים מדגימות עשבייה, אף אנו צופים כי ניתן להחיל את הפרוטוקול להרבה קבוצות אחרות של הצמח. הוא כולל שלב אופציונלי שחזור יכול לשמש כדי לחסוך באיכות נמוכה ו/או דגימות נדירות. בהתבסס על דגימות עשבייה מעל מאתיים נבדק, פרוטוקול זה פועל על דגימות עם קלט רקמות נמוכה ואיכות, המאפשר השימור של דגימות נדירות באמצעות דגימה הרסני מינימלי. הנה היא מופיעה בפרוטוקול זה יכול לספק ספריות באיכות גבוהה יכול להיות רציף לפרויקטים מבוססי phylogenomics.

<table><tbody><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 well&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Imaging System</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Series</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis System</td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (Ultra pure water)</td><td>ELGA&amp;nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Mini centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Mortar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>porcelain</td></tr><tr><td>Pestle</td><td>fisher Scientific</td><td>S02595</td><td>porcelain</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml Strip tube and Cap for PCR</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen Short-term Storage</td><td>Nalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic-Ring Stand&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 well&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>Hot Plate Stirrers</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Airgas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 X TE Buffer</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml solution</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free water</td><td>bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate Trihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS DNA Ladder</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Disodium Salt</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td>ultra pure</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Purple (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina&amp;nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>Phenol solution</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Silica sand</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Reamplification primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>see text</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>GeneCodes</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

robust dna isolation and high-throughput sequencing library construction for herbarium specimens

Herbaria הם מקור יקר ערך של חומר צמחי יכול לשמש במגוון מחקרים ביולוגיים. השימוש של דגימות עשבייה מזוהה עם מספר אתגרים כולל איכות שימור הדגימה, DNA מפורק דגימה ההרסני של דגימות נדירות. על מנת להשתמש ביעילות רבה יותר חומר עשבייה בפרוייקטים גדולים רצף, דרושה שיטה מהימן ומדרגי הכנה בידוד וספריית הדי. מאמר זה מדגים פרוטוקול חזקות, ההתחלה-to-end לבנייה DNA בידוד, תפוקה גבוהה ספריה של דגימות עשבייה שאינה דורשת שינוי לקבלת דוגמאות בודדות. פרוטוקול זה המותאם במיוחד עבור איכות נמוכה מיובשים צמח חומר לוקח יתרון השיטות הקיימות על-ידי מיטוב רקמות שחיקה, שינוי בחירת גודל הספרייה, היכרות עם שלב reamplification אופציונלי עבור ספריות תשואה נמוכה. Reamplification של ספריות DNA תשואה נמוכה יכול להציל את דגימות נגזר דגימות עשבייה ללא תחליף, ערך פוטנציאלי, שלילת הצורך לדיגום הרסניים נוספים וללא היכרות עם רצף ניכרת הטיה על השכל יישומים פילוגנטי. הפרוטוקול נבדק על מאות מינים דשא, אך צפוי להיות להתאמה לשימוש אחר שושלות הצמח לאחר אימות. פרוטוקול זה יכול להיות מוגבל על ידי ה-DNA ביותר, שבו קטעים שלא קיימים בטווח הרצוי, ועל ידי מטבוליטים משניים נוכח חומר צמח המעכבות נקי בידוד ה-DNA. בסך הכל, פרוטוקול זה מציג שיטה מקיפה ומהירה המאפשרת בידוד ה-DNA והכנת ספריית דגימות 24 ב פחות מ 13 h, עם רק 8 שעות של זמן על הידיים פעילה עם שינויים מינימליים.

בידוד ה-DNA ועם תשואה ספריית הסופי במחקר זה, הדגימו את היעילות של הפרוטוקול עבור הבידוד של דנ א עשבייה ושחזור של ספריות רצף באיכות גבוהה באמצעות כחמישים דוגמאות שונות עם הבכור משנת 1920 הצעיר ביותר מ-2012 (טבלה 2). עבור כל דגימה, כ 10 מ ג של רקמת העלה שימש עבור ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens at JoVE.com

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

מאמר זה מדגים פרוטוקול מפורט DNA בידוד ובניה ספריית תפוקה גבוהה רצף מחומר עשבייה כולל חילוץ של ה-DNA בצורה יוצאת דופן באיכות ירודה.

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K Views.  Donald Danforth Plant Science Center. מאמר זה מדגים פרוטוקול מפורט DNA בידוד ובניה ספריית תפוקה גבוהה רצף מחומר עשבייה כולל חילוץ של ה-DNA בצורה יוצאת דופן באיכות ירודה.

Video: Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Environment

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data may include mobile genetic elements, such as plasmids and extrachromosomal phage, that contribute to the dissemination of antimicrobial resistance and further complicate treatment of urinary tract infection (UTI). In addition to providing fine resolution of genome structure, complete, closed genomes allow for the detailed comparative genomics and evolutionary analyses. The generation of complete genomes de novo has long been a challenging task due to limitations of available sequencing technology. Paired-end Next Generation Sequencing (NGS) produces high quality short reads often resulting in accurate but fragmented genome assemblies. On the contrary, Nanopore sequencing provides long reads of lower quality normally leading to error-prone complete assemblies. Such errors may hamper genome-wide association studies or provide misleading variant analysis results. Therefore, hybrid approaches combining both short and long reads have emerged as reliable methods to achieve highly accurate closed bacterial genomes. Reported herein is a comprehensive method for the culture of diverse urinary bacteria, species identification by 16S rRNA gene sequencing, extraction of genomic DNA (gDNA), and generation of short and long reads by NGS and Nanopore platforms, respectively. Additionally, this method describes a bioinformatic pipeline of quality control, assembly, and gene prediction algorithms for the generation of annotated complete genome sequences. Combination of bioinformatic tools enables the selection of high quality read data for hybrid genome assembly and downstream analysis. The streamlined approach for the hybrid de novo genome assembly described in this protocol may be adapted for the use in any culturable bacteria.

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

This protocol details a comprehensive approach for the culturing, sequencing, and de novo hybrid genome assembly of urinary bacteria. It provides a reproducible procedure for the generation of complete, circular genome sequences useful in studying both chromosomal and extrachromosomal genetic elements contributing to urinary colonization, pathogenesis, and antimicrobial resistance dissemination.

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

<meta charset="utf8"></head><body>ברקוד DNA לצמחי מרפא: זיהוי וניתוח פילוגנטי

Application of DNA Barcoding to Identify Medicinal Plants

Medicinal plants are valuable resources globally and are used worldwide to maintain health and treat disease; however, the presence of adulteration obstructs their development. DNA barcoding, a technique for species identification by standard DNA regions, facilitates prompt and accurate identification of traditional medicinal plants. The process of DNA barcoding entails six basic steps: 1) processing the medicinal plants, 2) extracting high-quality total DNA from the medicinal plants using centrifugal column method, 3) amplifying target DNA region internal transcribed spacer 2 (ITS2) with universal primers of plants and performing Sanger sequencing, 4) splicing and aligning sequence to obtain the target sequence, 5) matching the barcode sequence against the barcode library for identification, 6) aligning sequence, comparing intraspecific and interspecific variation, constructing phylogenetic neighbor-joining tree. As shown in the results, the universal primer can amplify the target region. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) demonstrates the percentage identified was 100%, and the neighbor-joining tree demonstrates that the splicing sequences were clustered with the A. sinensis OR879715.1 clade, and the clade support value is 100. This protocol provides a reference for applying DNA barcoding technology as an effective method to identify medicinal plants and adulterants.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: רתימת טכנולוגיית ברקוד DNA לשיפור היעילות של זיהוי צמחי מרפא

The present protocol describes the use of DNA barcoding technology to authenticate plant-based medicinal materials, and the medicinal plant Angelica sinensis (Oliv.) Diels was identified as an example.

יישום ברקוד DNA לזיהוי צמחי מרפא

Medicinal plants are valuable resources globally and are used worldwide to maintain health and treat disease; however, the presence of adulteration ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בחירת גודל האוטומטי ג'ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

אמפירית, Metagenomic, שיטות חישוביות להאיר את מנגנוני הבריאות דבורה איזה פשרה קוטלי פטריות

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

יישום ברקוד DNA לזיהוי צמחי מרפא

יישום ברקוד DNA לזיהוי צמחי מרפא

יישום ברקוד DNA לזיהוי צמחי מרפא

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג