Taylor AuBuchon-yaşlı, Jordan Teisher ve Kristina Zudock için örnekleme sulak numuneler yardım ve Missouri Botanical Garden erişim sulak numuneler için yıkıcı örnekleme için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (DEB-1457748) bir hibe destek oldu.

1. başlangıç önce
<ol><li>CTAB, polyvinylpyrrolidone (PVP) 40, 100,0 mL 1 M Tris pH 8.0, 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 8.0, 280,0 mL 40 mL 5 10 g 20 g ekleyerek taze setil trimethylammonium bromür (CTAB) arabellek17 olun M NaCl ve 400.0 mL reaktif su birlikte, Toplam hacim 1 L reaktif sınıf kullanarak su getir. 8,0 pH ayarlayın. Not: Ek reaktifler CTAB için bireysel takson olarak ikincil bileşikler bağlı olarak ilave edilebilir. Allen ve ark. görmek 18 katkı Kimyasalları kapsamlı bir listesi için.</li>
	<li>
β-mercaptoethanol 5 mL CTAB arabellek de başına 10 µL ekleyin. Not: Bu 50 mL toplu olarak hazırlanan ve 3-4 hafta için oda sıcaklığında saklanan.<ol>
<li>Isı 65 ° C su banyosu CTAB çözümde.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Harçlar ve en az 20 dakika-20 ° C'de dibekler chill.</li>
	<li>2 n 2 mL tüpler x 4 set etiket (burada n = örnekleri sayısı). 1 etiketli tüpler kümesi buza koy.</li>
	<li>İsopropanol buz üzerinde veya -20 ° C-dondurucu soğuk.</li>
	<li>Katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon (SPRI) boncuk ( Tablo malzemelerigörmek) buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığında (en az 30 dk) equilibrate etmelerine izin.</li>
	<li>% 80 etanol hazırlayın.</li>
	<li>Sulak numuneler çıkarılması için seçmek ve ~ 1 cm2veya 10 mg, numune, tercihen yaprak malzeme başına doku almak.</li>
</ol>2. DNA ekstraksiyon
<ol><li>~ 1 cm2 prechilled havan ve dibekler kullanarak önceden seçilmiş sulak doku eziyet. Sıvı azot ve 30-50 mg steril kum ekleyin. Doku ince toz haline döner kadar eziyet. Not: 10 mg veya daha fazla doku tercih edilir, ancak daha az Ayrıca bazı durumlarda çalıştı. Bir kere sıvı azot buharlaşır, daha fazla doku tamamen yere kadar gerektiği gibi ekleyin. Hücre ve doku için başka bir ortak yöntem boncuk çırpıcı kullanmaktır. Ancak, bu yöntem de bu deneylerde kullanılan numuneler için çalışmıyor bulundu.</li>
	<li>Donmuş toz (tüp 's birim fazla yarısını ekleyin) iki 2 mL tüpler içine aktarın. Sıcak CTAB çözüm 600 µL her boru ve tüpler inversiyon ve vortexing tarafından iyice karıştırın. Not: miktar ve sulak malzeme kalitesi ve sık sık düşük DNA izolasyon içinde iki tekrar performans daha yüksek verim elde etmek için yardımcı olur.</li>
	<li>1 – 1,5 h, vortexing her 15 dakikada bir 65 ° C su banyosunda örnekleri kuluçkaya.</li>
	<li>Santrifüj örnekleri 10.000 x g 5 dakika süreyle de süpernatant etiketli tüpler (~ 500 µL) taze bir dizi Transfer. Standart olmayan klorlu elden çıkarma yordamı kullanarak Pelet atmak.</li>
	<li>4 µL RNase-A (10 mg/ml) her tüp ve ters çevirme veya pipetting karıştırın. Bir ısı blok veya su banyoda 15dk için 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya.</li>
	<li>Tüpler oda sıcaklığında alabilirseniz eşit bir birim (~ 500 µL) 25:24:1 fenol: kloroform: izoamil alkol karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından ve/veya inversiyon ile iyice karıştırın. Borular 12,000 x g 15 dakika süreyle de sulu katman (üst katman) için yeni bir set Transfer santrifüj tüpleri (~ 400 µL) etiketli. Organik katman klorlu atık konteyner içine atın. Not: Adım 2.6 tekrar ikincil bileşiklerin büyük miktarlarda bekleniyor Eğer bitki malzeme.</li>
	<li>Eşit bir birim (~ 400 µL) 24:1 kloroform: izoamil alkol karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından ve/veya inversiyon ile iyice karıştırın. Borular 12,000 x g 15 dk. Transfer için de prechilled, etiketli tüpler (~ 300 µL) yeni bir set için sulu katman (üst katman) santrifüj kapasitesi. Organik katman klorlu atık konteyner içine atın.</li>
	<li>Eşit bir birim (~ 300 µL) 12 µL 2.5 M sodyum asetat ve prechilled isopropanol her tüp için ekleyin. Örnekleri-20 ° c 30-60 dk için kuluçkaya. Not: Kuluçka kez (kadar gece kuluçka) uzatılabilir ama DNA kalite artık örnekleri kuluçkaya azalacak.</li>
	<li>Dondurucu ve borular 12,000 x g 15 dakika süreyle de kaldırmak ve süpernatant yavaşça atmak Pelet bozmadan santrifüj numune al. Pelet tarafından süspansiyon taze % 70 etanol (yaklaşık 300-500 µL) ile yıkayın. Her iki katına örnek için iki bireysel granül etanol eşlik eden biriyle birleştirir. Not: Örnekleri etanol ilk kullanarak bir tüpe konsolide edilecek ve daha sonra devam edin. Her örnek etanol ile ayrı ayrı yıkamak gerekli değildir.</li>
	<li>12.000 x g 10 dk. Kaldır, tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant yavaşça Pelet bozmadan atın. Hava Kuru granül. Not: Örnekleri daha hızlı bir kuru sıcak blok kullanarak kurutulmuş (65 ° C fazla olamaz). Örnekleri değil aşırı kuru olduğundan emin olun, bu DNA son verimini düşürebilir.</li>
	<li>İzole DNA 1 x TE 50 µL içinde askıya alma. Uzun süreli depolama için-20 ° C-derin dondurucu veya kullanılmak üzere aşağıdaki hafta 4 ° C'de depolayın.</li>
</ol>3. kalite kontrol (QC)
<ol><li>
Kalite kontrol için bir özel jel çalıştırın.
	<ol>
<li>1 x Tris/Bor/EDTA (TBE) arabellek 54 g Tris Bankası, 27,5 g Borik asit ve 3.75 g EDTA ekleyerek disodyum tuzu, Toplam hacim 5 L reaktif sınıf su kullanarak getirerek hazırlayın.</li>
		<li>% 1'özel jel hazırlamak için 100 mL 1 1 g özel ekleyerek x TBE. Hiçbir özel görünene kadar çözüm mikrodalga. % 0,01 nükleik asit jel ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) leke. Dokunmak sıcak kadar şişesi soğumaya bırakın. Tarafından iyi karıştırma karıştırın. Özel bir jel tepsiye dökün ve bunun katılaşır kadar oturmak izin.</li>
		<li>Örnek 3 µL, reaktif sınıf su 2 µL ve boya yükleme x 6 1 µL karıştırın. Onların düzen belirterek örnekleri jel matris yükleyin.</li>
		<li>Örnekleri için 60-70 dk 60 – 70 V. Image'da UV ışık altında jel doğru pozlama ve odak ile çalıştırın. Not: smear genellikle DNA Bozulması gösterir iken açık yüksek molekül ağırlıklı bant varlığı yüksek kalitede DNA, bir ibret vardır. En sulak numuneler bozulmuş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DsDNA miktar analizler (çift miktarını belirlemek için malzemeler tablo bkz:) telli DNA.
	<ol>
<li>Örnek 2 µL çözümleme için kullanın. Not: en az miktarlarda olmak eğilimi olarak Dilutions sulak malzeme miktar analiz için gerekli değildir. Başarılı kitaplıkları kadar az 1.26 ng toplam dsDNA bu adım üzerinden yapıldı.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DNA kesme
Not: Bu ticari bir çift iplikçikli fragmentase en iyi duruma getirilmiş bir sürümüdür ( Tablo malzemelerigörmek) protokol.
<ol><li>Yer dsDNA parçalanma enzim buzda vortexing için 3 sonra s.</li>
	<li>Bir steril 0.2 mL Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüp, mix 1 – 16 µL parçalanma tepki arabellek eşlik 2 µL DNA izole. Toplam hacim için 18 µL nükleaz boş su ekleyerek getir. 2 µL dsDNA parçalanma enzim ve girdap karışımı için 3 eklemek s. Not: Gerekli DNA'ın DNA toplama (AIM tüp 200 ng toplamda için) bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>8,5 min için 37 ° C'de örnekleri kuluçkaya. Sonra 0,5 M EDTA 5 µL tüpler için ekleyin. Not: Bu adımı tepki sonlandırmak ve DNA örnekleri aşırı kesme önlemek için kuluçka dönemi bitti en kısa zamanda yapılması gerekiyor.</li>
</ol>5. boncuk temizlik
<ol><li>SPRI boncuk vortexing tarafından lunaparkçı.</li>
	<li>Yamultulmuş DNA hacmi 25 µL nükleaz boş su ekleyerek için 50 µL getir. Oda sıcaklığında SPRI boncuk (% 90 cilt) 45 µL yamultulmuş DNA ve mix 50 µL iyice yukarı ve aşağı pipetting tarafından ekleyin. Not: Toplam numune hacmi yüzde 90'ını boncuk ekleme kez 200 baz çifti aşağıda DNA parçalarının en küçüğü kaldırmak için yapılır.</li>
	<li>Örnekleri kuluçkaya 5 dk. tüpler manyetik tabağa koy ve onlara 5 dk. için dikkatli bir şekilde oturmak için izin kaldırmak ve süpernatant atın. Not: onlar istenen DNA hedefleri içeren boncuklar, rahatsız değil dikkatli olun.</li>
	<li>Taze % 80 etanol 200 µL iken manyetik stand tüpler ekleyin. 30 oda sıcaklığında kuluçkaya s ve o zaman dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Bir kez bu adımı yineleyin. Hava tüpü kapağı açık manyetik ayaklıklı açıkken Boncuk 5 min için kuru. Not: boncuk aşırı kurutma önlemek. Bu DNA'ın alt kurtarma yol açabilir.</li>
	<li>Tüpler mıknatıs kaldırın. Boncuk DNA'dan 0.1 x TE 55 µL elute ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. 5 dk. yer tüpler manyetik stand için oda sıcaklığında kuluçkaya ve açmak belgili tanımlık eriyik için bekleyin (~ 2 dk) temizleyin.</li>
	<li>52 µL süpernatant ile çekin. Bir DNA miktar analiz örnekleri kurtarma ve Kütüphane hazırlık gider ilk toplama kontrol için çalıştırın. Not: Kütüphaneler daha az 1,25 olarak tahmin toplam dsDNA ile yapılmış olan ng, yine de her durumda reamplification gerekli.</li>
</ol>6. Kütüphane hazırlık
Not: Bu bir ticari olarak mevcut Kütüphane seti değiştirilmiş bir versiyonu olduğunu (bakınız Tablo reçetesi Protokolü).
<ol><li>
Son hazırlık
	<ol>
<li>3 µL endonükleaz ve enzimler takip fosfat ve reaksiyon arabellek temizlenmiş, yamultulmuş DNA'ın 50 µL eşlik 7 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. Kabarcıklar kaldırmak tüplere spin. Not: Toplam hacmi 60 µL olmalıdır.</li>
		<li>Aşağıdaki programı ile bir thermocycler örnekleri yer: 20 ° C, 65 ° C'de 30 dk, 30 dk sonra 4 ° C'de tutun Not: Isıtmalı kapak ≥75 ° C kuruldu</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adaptör ligasyonu
	<ol>
<li>25-50 kat adaptör seyreltik (0,6 – 0.3 konsantrasyon adaptör çalışma µM). Tüp ligasyonu ana karışımı 30 µL, 1 µL ligasyonu artırıcı ve yüksek-den geçerek kısa okuma sıralama için adaptör 2.5 µL tüpler için ekleyin. Not: Toplam hacim 93,5 µL olmalıdır.</li>
		<li>Yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. Kabarcıklar kaldırmak tüplere spin. 15 dakika 20 ° C'de tüpler kuluçkaya.</li>
		<li>3 µL urasil DNA glycosylase (UDG) ve DNA glycosylase-liyaz endonükleaz VIII ticari karışımı ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) tüpler için. Toplam hacim 96,5 olduğundan emin µL. iyice karıştırın ve bir thermocycler kullanarak 15dk için 37 ° C'de kuluçkaya. Not: Kapağı olmalıdır küme ≥47 ° C. Ticari iletişim kuralı özgün sürümü boyutu seçimi son adımı olarak bir boncuk temizlik ardından adaptör ligasyonu adım sonra sahiptir. Daha yüksek verim elde, bu iletişim kuralı aşağıdaki adımları sırasını geçirir ve Boyut seçimi son bir adım olarak uygular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enzimler ve küçük parçalarını kaldırmak için Temizleme
	<ol>
<li>Manyetik boncuklar tarafından vortexing homojenize.</li>
		<li>SPRI manyetik boncuklar (% 80 cilt) 78 µL ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. Not: çoğu kez 250 baz çifti kısa en küçük DNA parçalarının kaldırmak için toplam numune hacmi % 80'i boncuk ekleme yapılır. Küçük DNA parçalarının daha sıkı (i) ihtiyaç fazlası adaptörleri kaldırmak ve (ii) daha büyük parçaları aşağıdaki adımlarda amplifikasyon vurgulamak için çıkartılmasıdır.</li>
		<li>5 dk. tüpler 5 dakika süreyle manyetik bir plaka üzerinde dikkatle kaldırmak ve istediğiniz boyuta aralığın dışındaki DNA içeren süpernatant yerine örnekleri kuluçkaya izin. Not: istediğiniz DNA hedefinde boncuk değil rahatsız etmek için dikkatli olun.</li>
		<li>Taze % 80 etanol 200 µL iken manyetik stand tüpler ekleyin. 30 oda sıcaklığında kuluçkaya s ve o zaman dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Bir kez bu adımı yineleyin. Hava Kuru Boncuk 5 min için tüp manyetik stand ile kapak açık iken. Not: boncuk kurutma üzerinde kaçının. Bu DNA'ın alt kurtarma yol açabilir.</li>
		<li>Tüpler mıknatıs kaldırın. 0.1 x TE 17 µL ekleyerek boncuk DNA hedef elute ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın.</li>
		<li>5 dk. yer tüpler manyetik stand için oda sıcaklığında kuluçkaya ve açmak belgili tanımlık eriyik için bekleyin (~ 2 dk) temizleyin.</li>
		<li>15 µL süpernatant ile çekin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR güçlendirme
	<ol>
<li>Yüksek sadakat PCR ana Mix 25 µL, 5 µL Kütüphane hazırlık 5' astar sıralama yüksek üretilen iş kısa okuma ve yüksek-den geçerek kısa okuma sıralama kitaplığı hazırlık 3' astar, 5 µL temizlenmiş adaptör bakmaksızın DNA'ın 15 µL ekleyin. Not: Toplam hacmi 50 µL olmalıdır.</li>
		<li>De vortexing tarafından karıştırın. Tablo 1' de bulunan ayarları kullanarak bir thermocycler örnekleri yerleştirin: Thermocycler amplifikasyon ayarı. Not: Devir çok sayıda giriş DNA düşük miktar nedeniyle gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Döngüsü adım</td>
			<td>Temp.</td>
			<td>Zaman</td>
			<td>Döngüleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>İlk denatürasyon</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denatürasyon</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 s</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tavlama/uzantısı</td>
			<td>65 ° C</td>
			<td>75 s</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Son uzantısı</td>
			<td>65 ° C</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Basılı tutun</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: PCR protokol denatürasyon, tavlama ve uzantısı kez ve sıcaklıklar. Sıcaklık ve kez bu protokol için sunulan reaktifler için optimize. Reaktifler değişmiş, sıcaklık ve kez tekrar optimize edilmelidir.
<ol start="5"><li>
İstenen Kütüphane boyutu için Boyut seçimi Not: Bu boncuk adım parçaları hedef aralığı altında ve üstünde kaldırır.<ol>
<li>SPRI boncuk vortexing tarafından lunaparkçı.</li>
		<li>25 µL (% 50 cilt) oda sıcaklığında manyetik boncuklar ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın. Örnekleri kuluçkaya 5 dk. tüpler manyetik tabağa koy ve onlara 5 dk. için dikkatli bir şekilde oturmak için izin ve süpernatant etiketli tüpler yeni bir dizi transfer çıkarın. Not: Bu ses seviyesi istenen Kütüphane boyutu temelinde ayarlanabilir. Süpernatant istediğiniz boyuta DNA parçaları içerir. İlk boncuk kuluçka içinde boncuklar daha büyük kütüphane parçaları bağlayıcıdır. Bunlar o 400-600 baz çifti aralıktaki odaklanmak için kaldırılır. Süpernatant daha küçük parçaları içerir.</li>
		<li>Oda sıcaklığında SPRI boncuk 6 µL süpernatant için iyice yukarı ve aşağı pipetting tarafından ekleyip karıştırın. İzin için 5 dk. tüpler manyetik tabağa koy ve 5 min için oturmak izin örnekleri kuluçkaya. Not: Bu ses seviyesi adım 6.5.2 uygun olarak istenilen Kütüphane boyutu temelinde ayarlanabilir.</li>
		<li>Dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Not: istediğiniz DNA içeren boncuk değil rahatsız etmek için dikkatli olun. İkinci boncuk kuluçka içinde boncuklar ilk kaldırma en büyük DNA parçaları sonra kalan parçaları için bağlayıcıdır. Bu parçaları genellikle istenen boyut aralığında kümesidir.</li>
		<li>Taze % 80 etanol 200 µL iken manyetik stand tüpler ekleyin. 30 oda sıcaklığında kuluçkaya s, o zaman dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Tekrar ediyorum. Hava Kuru Boncuk 5 min için tüp manyetik stand ile kapak açık iken. Not: boncuk aşırı kurutma önlemek. Bu DNA'ın alt kurtarma yol açabilir.</li>
		<li>Tüpler mıknatıs kaldırın. Boncuk DNA hedeften 0.1 x TE 33 µL elute ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın.</li>
		<li>5 dk. yer tüpler manyetik stand için oda sıcaklığında kuluçkaya ve açmak belgili tanımlık eriyik için bekleyin (~ 2 dk) temizleyin. (Bkz. Tablo reçetesi) 2 mL tüpler için depolama için 30 µL süpernatant ve transfer çekin. Not: Kütüphaneler, uzun süreli depolama için-20 ˚C tutulabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kalite kontrol
	<ol>
<li>DNA arşivini kalite kontrol testi. 3.1 ve 3.2 adımlarına bakın. Not: DNA kitaplıkları için 96 V ~ 45 dk için jel çalıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kütüphane reamplification: isteğe bağlı kitaplık miktar yeterli değil. Not: Örnekleri kitaplığına konsantrasyonları altında 10 ile nM reamplified aşağıdaki adımları kullanarak. Reamplification düşük konsantrasyon kütüphanelerin sıralama için uygulanabilir sonuçlar elde edebilirsiniz, ancak reamplification toplanan veri (Tablo 3) bu belirli ölçümleri için önemsiz olduğunu göstermektedir rağmen temel kompozisyon çeşitlilik, mütevazı bir kayma neden olabilir .<ol>
<li>10 kat 0.1 x TE kullanarak evrensel reamplification astar sulandırmak.</li>
		<li>Yüksek sadakat PCR ana Mix 25 µL, 5 µL seyreltilmiş evrensel reamplification astar 1 (AATGATACGGCGACCACCGA) ve 5 µL seyreltilmiş evrensel reamplification astar 2 (CAAGCAGAAGACGGCATACGA) düşük konsantrasyon kütüphanelerin 15 µL ekleyin. Not: Toplam hacim 50 µL olmalıdır.</li>
		<li>De vortexing tarafından karıştırın. Tablo 1' de bulunan ayarları kullanarak bir thermocycler örnekleri yerleştirin: Thermocycler amplifikasyon ayarı Not: Devir çok sayıda giriş DNA düşük miktar nedeniyle gereklidir.</li>
		<li>Boncuk temizlik</li>
		<li>SPRI boncuk vortexing tarafından lunaparkçı. Oda sıcaklığında SPRI boncuk (% 90 cilt) 45 µL ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın.</li>
		<li>5 dk. 5 min için manyetik bir tabakta tüpler koymak için kuluçkaya örnekleri ver.</li>
		<li>Dikkatle kaldırın ve istenmeyen DNA içeren süpernatant. Not: istediğiniz DNA hedefinde boncuk değil rahatsız etmek için dikkatli olun.</li>
		<li>Taze % 80 etanol 200 µL iken manyetik stand tüpler ekleyin. 30 oda sıcaklığında kuluçkaya s ve o zaman dikkatle kaldırmak ve süpernatant. Bir kez bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Hava tüpü kapağı açık manyetik ayaklıklı açıkken Boncuk 5 min için kuru. Not: boncuk aşırı kurutma önlemek. Bu DNA hedef alt kurtarılması neden olabilir.</li>
		<li>Tüpler mıknatıs kaldırın. Boncuk DNA hedeften 0.1 x TE 33 µL elute ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın.</li>
		<li>5 dk. yer tüpler manyetik stand için oda sıcaklığında kuluçkaya ve açmak belgili tanımlık eriyik için bekleyin (~ 2 dk) temizleyin.</li>
		<li>30 µL süpernatant ile çekin. Uzun süreli depolama için-20 ° C'de kitaplık depolanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kalite kontrol
	<ol>
<li>DNA arşivini kalite kontrol testi. 3.1 ve 3.2 adımlarına bakın. DNA kitaplıkları için 96 V ~ 45 dk için jel çalıştırın. Not: Çift Kişilik bir grup içinde jel görüldüğünde, bu büyük olasılıkla bir reamplification adım yorgunluktan astar sonucudur. Bantları 6,9 yinelenen, ancak Tablo 1' de tasvir PCR programda yalnızca bir döngüsü kullanılarak kaldırılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Savolainen, V., Cu&#233;noud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Cr&#232;vecoeur, M., Manen, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+herbarium+specimens+in+DNA+phylogenetics:+Evaluation+and+improvement.">The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement.</a> Plant Syst Evo. 197 (1-4), 87-98 (1995).</li><li>Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Museomics+illuminate+the+history+of+an+extinct,+paleoendemic+plant+lineage+(Hesperelaea,+Oleaceae)+known+from+an+1875+collection+from+Guadalupe+Island,+Mexico.">Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico.</a> Bio J Linn Soc. 117 (1), 44-57 (2016).</li><li>Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphyly+of+Arundinoideae+(Poaceae)+and+Evolution+of+the+Twisted+Geniculate+Lemma+Awn.">Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn.</a> Ann Bot. , (2017).</li><li>Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+time+and+space:+the+use+of+herbarium+specimens+to+reconstruct+patterns+of+genetic+variation+in+the+endangered+orchid+Anacamptis+palustris.">Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris.</a> Conserv Gen. 8 (3), 629-639 (2007).</li><li>Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Back+to+the+future:+museum+specimens+in+population+genetics.">Back to the future: museum specimens in population genetics.</a> Tre Eco &amp; Evo. 22 (12), 634-642 (2007).</li><li>Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+herbarium+specimens+are+needed+to+detect+threatened+species?.">How many herbarium specimens are needed to detect threatened species?.</a> Bio Conserv. 144 (10), 2541-2547 (2011).</li><li>Saltonstall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+invasion+by+a+non-native+genotype+of+the+common+reed,+Phragmites+australis,+into+North+America.">Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America.</a> PNAS USA. 99 (4), 2445-2449 (2002).</li><li>Besnard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+museums+to+genomics:+old+herbarium+specimens+shed+light+on+a+C3+to+C4+transition.">From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition.</a> J Exp Bot. 65 (22), 6711-6721 (2014).</li><li>S&#228;rkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+open+the+treasure+chest?+Optimising+DNA+extraction+from+herbarium+specimens.">How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43808 (2012).</li><li>Harris, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+analysis+of+tropical+plant+species:+An+assessment+of+different+drying+methods.">DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods.</a> Plant Syst Evo. 188 (1-2), 57-64 (1994).</li><li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+plant+herbarium+tissue.">DNA damage in plant herbarium tissue.</a> PLoS ONE. 6 (12), e28448 (2011).</li><li>Bakker, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbarium+genomics:+plastome+sequence+assembly+from+a+range+of+herbarium+specimens+using+an+Iterative+Organelle+Genome+Assembly+pipeline.">Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline.</a> Bio J of the Linn Soc. 117 (1), 33-43 (2016).</li><li>Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endophytic+fungal+DNA,+the+source+of+contamination+in+spruce+needle+DNA.">Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA.</a> Mol Eco. 6 (10), 983-987 (1997).</li><li>Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., P&#228;&#228;bo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequences+from+multiple+amplifications+reveal+artifacts+induced+by+cytosine+deamination+in+ancient+DNA.">DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA.</a> Nucl Acids Res. 29 (23), 4793-4799 (2001).</li><li>Staats, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+treasure+troves:+Complete+genome+sequencing+of+herbarium+and+insect+museum+specimens.">Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens.</a> PLoS ONE. 8 (7), e69189 (2013).</li><li>Bakker, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbarium+genomics:+skimming+and+plastomics+from+archival+specimens.">Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens.</a> Webbia. 72 (1), 35-45 (2017).</li><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).</li><li>Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+protocol+for+rapid+DNA+isolation+from+plant+tissue+using+cetryltrimethylammonium+bromide.">A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide.</a> Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).</li><li>Twyford, A. D., Ness, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+complete+plastid+genome+seqeuncing.">Strategies for complete plastid genome seqeuncing.</a> Mol Eco Resour. , (2016).</li><li>Aird, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+and+minimizing+PCR+amplification+bias+in+Illumina+sequencing+libraries.">Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries.</a> Genome Bio. 12 (2), R18 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+A+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).</li><li>Grigoriev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MycoCosm+portal:+gearing+up+for+1000+fungal+genomes.">MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes.</a> Nucl Acids Res. 42 (1), D699-D704 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Meth. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Herbarium Genomics. Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+rapid+diversification+and+convergent+origins+of+active+pollination+within+Agavoideae+(Asparagaceae).">Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae).</a> Am J Bot. 103 (10), 1717-1729 (2016).</li><li>McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verdant:+automated+annotation,+alignment,+and+phylogenetic+analysis+of+whole+chloroplast+genomes.">Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes.</a> Bioinf. , (2016).</li><li>Staton, S. E., Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposome:+A+toolkit+for+annotation+of+transposable+element+families+from+unassembled+sequence+reads.">Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads.</a> Bioinf. 31 (11), 1827-1829 (2015).</li><li>Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repbase+Update,+a+database+of+repetitive+elements+in+eukaryotic+genomes.">Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes.</a> Mobile DNA. 6 (1), 11 (2015).</li><li>. Transposons Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/mrmckain/">https://github.com/mrmckain/</a> (2017)</li><li>Wei&#223;, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterns+of+damage+and+decay+kinetics+of+DNA+retrieved+from+plant+herbarium+specimens.">Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens.</a> Royal Soc Open Sci. 3 (6), 160239 (2016).</li><li>Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., P&#228;&#228;bo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+patterns+of+nucleotide+misincorporations+and+DNA+fragmentation+in+ancient+DNA.">Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA.</a> PLoS ONE. 7 (3), e34131 (2012).</li><li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Library+construction+for+next-generation+sequencing:+overviews+and+challenges.">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> BioTechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li><li>Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sequence+capture+as+a+powerful+tool+for+evolutionary+analysis.">Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis.</a> Am J Bot. 99, 312-319 (2012).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Burada sunulan Protokolü DNA izolasyon ve Kütüphane hazırlık kurutulmuş bitki örnekleri üzerinden sıralama için kapsamlı ve sağlam bir yöntemdir. Yöntemi ve bunu değiştirmek için çok az ihtiyaç örnek kalite make büyük sulak alan sıralama projeler için ölçeklenebilir temel. Düşük verim kitaplıkları için bir isteğe bağlı reamplification adım dahil düşük kaliteli, düşük miktar, nadir, ya da başka türlü sıralama için uygun olmaz tarihsel açıdan önemli örnekleri dahil sağlar...

Sulak koleksiyonları tür ve genomik çeşitlilik filogenetik1,2,3, Populasyon genetiği4,5, koruma çalışmaları için potansiyel olarak değerli bir kaynaktır Biyoloji6, istilacı türlerin Biyoloji7ve özellik evrim8. Zengin bir çeşitlilik türlerin, nüfus, coğrafi yer ve zaman puan elde etmek için yeteneğini sulak olduğunu "hazine sandığı"9 vurgulamaktadır. Tarihsel olarak, bozulmuş doğa sulak elde edilen DNA PCR tabanlı projeler genellikle yalnızca bölgeleri kloroplast genom veya ribozomal, iç kopya etmek Rondela (ITS) gibi yüksek bir kopyasını buldum işaretçileri kullanarak araştırmacılar relegating engel RNA. Örnekler ve DNA kalitesini kapsamlı koruma9,10, çift iplikçikli sonları ve parçalanma hasar en yaygın formları olmak, oluşturma kurutma işleminde kullanılan ısı ile yöntemleri göre değişir sözde % 90'ı DNA kilit-up bu çalışmalar PCR tabanlı11ipotekli. Parçalanma bir yana, ikinci en yaygın sulak genomik kirlenme, bu endophytic mantarlar13 türetilmiş veya mantar toplama sonra ama yine de içinde sulak12, montaj önce öldükten sonra edinilen gibi sorundur Bu sorun çözüldü bioinformatically şu mantar veritabanı (aşağıya bakın) verilen olabilir. Üçüncü ve daha az yaygın bir sorun ile sitozin Deaminasyon (C/G→T/A)14, sıra değişiklik olsa da sulak numuneler11' (~ %0,03) düşük olduğu tahmin edilmektedir. Yüksek işlem hacmi sıralama (HTS) gelişiyle, parçalanma sayısında kısa okuma ve düşük kalitesi ile çok sayıda numune üzerinden genomik düzeyinde veri toplama izin sıralama derinliği12,15, üstesinden gelebilir DNA ve hatta bazen tüm genom sıralama15erişimine izin verme.
Sulak örnekleri daha sık kullanılan olma ve filogenetik projeleri16büyük bir bileşenidir. HTS için sulak örnekler kullanarak geçerli bir meydan okuma tutarlı bir şekilde yeterli çift telli DNA, sıralama iletişim kuralları için gerekli bir ön koşul zamanında, çok sayıda tür yöntemleri birey için optimize etmek gerek kalmadan almaktır numuneler. Bu yazıda, bu mevcut yöntemlerden yararlanır ve onlara hızlı ve yinelenebilir sonuçları için izin vermek için değiştirir DNA ekstraksiyon ve Kütüphane sulak numunelerin hazırlanması için bir iletişim kuralı gösterilmiştir. Bu yöntem için tam 13 h, 8 h uygulamalı zamanla veya isteğe bağlı reamplification adım gerekli olduğunda 9 h uygulamalı zamanla 16 h 24 örnekleri kitaplığına örnek işleme sağlar. Daha fazla örnek aynı anda işleme ulaşılabilir, olsa da santrifüj kapasitesi ve teknik beceri sınırlayıcı faktördür. Protokol yalnızca tipik labaratuar donanımları (thermocycler, santrifüj ve manyetik duruyor) Nebulizatör veya sonicator, gibi özel ekipman yerine DNA kesme için gerektirecek şekilde tasarlanmıştır.
DNA kalite, parça boyutu ve miktar faktörler sulak örneklerin yüksek üretilen iş sıralama deneylerde kullanmak için sınırlı hale gelir. Sulak DNA izole ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplıkları oluşturmak için diğer yöntemleri 10 kadar az kullanma belgili tanımlık yarar göstermiştir ng DNA16; Ancak onlar deneysel olarak PCR optimum sayısını belirleme gerektiren bir kütüphane hazırlık için gerekli geçer. Son derece küçük miktarlarda uygun çift ile ilgili DNA (dsDNA), telli birkaç sulak numune yalnızca bir tek kitaplık hazırlık için yeterli DNA üretmek gibi bu pratik olur. DNA yok Kütüphane optimizasyonu adımda kayıp burada sunulan yöntem döngüleri örnek kalite, ne olursa olsun tek bir sayı kullanır. Bunun yerine, kitaplıkları sıralama için gerekli minimum tutarları uygun olmayan bir reamplification adım çağrılır. Birçok sulak örnekleri nadirdir ve sahip küçük malzeme birçok durumda yıkıcı örnekleme haklı zorlaştırır. Bu karşı sunulan Protokolü sağlar dsDNA giriş boyutları daha az 1,25 ng Kütüphane hazırlık sürecine yüksek üretilen iş sıralama ve örneklerin yıkıcı örnekleme gereksinimini en aza indirilmesi için uygun örnekleri kapsamını genişletiyor.
Aşağıdaki iletişim kuralı otlar için en iyi duruma getirilmiş ve protokol başka birçok bitki gruplarına uygulanabilir beklemek rağmen sulak örnekleri, farklı türlerin yüzlerce test. Düşük kaliteli ve/veya nadir örnekleri kaydetmek için kullanılan bir isteğe bağlı kurtarma adım içerir. Test iki yüz sulak numuneler üzerinde bağlı olarak, bu protokol bırakmak nadir örnekleri minimal yıkıcı örnekleme yoluyla korunması için numuneler ile düşük doku girdi ve kalite, çalışır. Burada bu protokolü phylogenomics tabanlı projeler için sıralı kaliteli kitaplıkları sağlayabilir gösterilir.

<table><tbody><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4452300</td><td>96 well&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Imaging System</td><td>Azure Biosystems</td><td>c300</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20 Series</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30137</td><td></td></tr><tr><td>Digital Dry Bath</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis System</td><td>EasyCast</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>PURELAB flex 2 (Ultra pure water)</td><td>ELGA&amp;nbsp;</td><td>89204-092</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td>2 ml</td></tr><tr><td>Mini centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-006-901</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Mortar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02591</td><td>porcelain</td></tr><tr><td>Pestle</td><td>fisher Scientific</td><td>S02595</td><td>porcelain</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>fisher Scientific</td><td>21-403-161</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Kenmore</td><td>405.7309231</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml Strip tube and Cap for PCR</td><td>VWR</td><td>20170-004</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen Short-term Storage</td><td>Nalgene</td><td>F9401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic-Ring Stand&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM10050</td><td>96 well&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>VWR</td><td>89032-210</td><td></td></tr><tr><td>Hot Plate Stirrers</td><td>VWR</td><td>97042-754</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Airgas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>1 X TE Buffer</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>pH 8.0</td></tr><tr><td>CTAB</td><td>AMRESCO</td><td>0833-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-MERCAPTOETHANOL</td><td>AMRESCO</td><td>0482-200ML</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>AMRESCO</td><td>E866-5ML</td><td>10 mg/ml solution</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>bio WORLD</td><td>705744</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>bio WORLD</td><td>40970004-1</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Free water</td><td>bio WORLD</td><td>42300012-2</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A393-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate Trihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>s608-500</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>100bp PLUS DNA Ladder</td><td>Gold Biotechnology</td><td>D003-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Disodium Salt</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70182</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td>ultra pure</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Purple (6 X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina&amp;nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>E7645L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7600S</td><td>Dual Index Primers Set 1</td></tr><tr><td>NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0543L</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RXNPure Plus</td><td>Omega bio-tek</td><td>M1386-02</td><td></td></tr><tr><td>GelRed 10000 X</td><td>Pheonix Research</td><td>41003-1</td><td></td></tr><tr><td>Phenol solution</td><td>SIGMA Life Science</td><td>P4557-400ml</td><td></td></tr><tr><td>PVP40</td><td>SIGMA-Aldrich</td><td>PVP40-50G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>EM8.22265.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>200 Proof</td></tr><tr><td>Silica sand</td><td>VWR</td><td>14808-60-7</td><td></td></tr><tr><td>Reamplification primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>see text</td><td></td></tr><tr><td>Sequencher v.5.0.1</td><td>GeneCodes</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

robust dna isolation and high-throughput sequencing library construction for herbarium specimens

Herbaria biyolojik çalışmalar çeşitli kullanılan bitki materyali paha biçilmez bir kaynaktır. Sulak örnekler kullanımı zorlukları örnek koruma kalitesi, bozulmuş DNA ve nadir örneklerin yıkıcı örnekleme dahil olmak üzere, bir dizi ile ilişkilidir. Daha etkili bir şekilde sulak malzeme büyük sıralama projelerde kullanmak için güvenilir ve ölçeklenebilir yöntemi DNA izolasyon ve Kütüphane hazırlanması gereklidir. Bu kağıt bir sağlam, başına sonuna protokol değişikliği için bireysel örnekleri gerektirmeyen DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi Kütüphane yapımı için sulak örnekler üzerinden gösteriyor. Bu iletişim kuralı, Kütüphane boyutu seçimi değiştirme ve düşük verim kitaplıkları için bir isteğe bağlı reamplification adım tanıtımı doku kabuğu optimize ederek düşük kaliteli kurutulmuş bitki malzeme ve alır avantajı mevcut yöntemler için hazırlanmıştır. Reamplification düşük verim DNA kütüphanelerinin yeri doldurulamaz ve potansiyel olarak değerli sulak numuneler, ihtiyaç için ek yıkıcı örnekleme ve fark edilebilir sıralama önyargı için ortak tanıtımı olmadan inkâr türetilen örnekleri kurtarabilirsiniz Filogenetik uygulamaları. Protokol çim türleri yüzlerce üzerinde test edilmiştir, ancak doğrulama sonra diğer bitki soy kullanmak için adapte olması bekleniyor. Bu iletişim kuralı nerede parçaları istediğiniz boyuta aralığında var olmayan, son derece bozulmuş DNA ve temiz DNA izolasyon inhibe Sekonder metabolitler bazı bitki malzeme mevcut sınırlı olabilir. Genel olarak, bu protokol bırakmak için DNA izolasyon ve az 13 h, 24 örnekleri kitaplığı hazırlanması sadece 8 h minimal değişiklikler ile aktif uygulamalı zaman ile hızlı ve kapsamlı bir yöntem sağlar.

DNA izolasyonu ve son Kütüphane verim Bu çalışmada, sulak DNA izolasyonu ve yüksek kaliteli sıralama kitaplıkları kurtarılması için iletişim kuralı etkinliğinin 1920 en eski ve en küçük 2012 (Tablo 2) ile 50 farklı örnekleri kullanarak gösterilmiştir. Her örnek için yaklaşık 10 mg yaprak doku DNA izolasyon için kullanıldı. Yeşil yaprak dokusu varsa tercih ve hiçbir doku bariz mantar kirlenme ile seçilmiştir. Verim düş...

Watch this Scientific Journal Video about Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens at JoVE.com

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Bu makalede, DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak malzeme son derece kalitesiz DNA'ın kurtarma dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol gösterilir.

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

robust-dna-isolation-high-throughput-sequencing-library-construction

Research

JoVE Journal

Genetics

10.5K Görüntüleme.  Donald Danforth Plant Science Center. Bu makalede, DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak malzeme son derece kalitesiz DNA'ın kurtarma dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol gösterilir.

Video: Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA libraries are needed for optimal results from next-generation sequencing. Environmental samples such as water may have low quality and quantities of DNA as well as contaminants that co-precipitate with DNA. The mechanical and enzymatic processes involved in extraction and library preparation may further damage the DNA. Gel size selection enables purification and recovery of DNA fragments of a defined size for sequencing applications. Nevertheless, this task is one of the most time-consuming steps in the DNA library preparation workflow. The protocol described here enables complete automation of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments. 
In this study, we describe a high-throughput approach to prepare high quality DNA libraries from freshwater samples that can be applied also to other environmental samples. We used an indirect approach to concentrate bacterial cells from environmental freshwater samples; DNA was extracted using a commercially available DNA extraction kit, and DNA libraries were prepared using a commercial transposon-based protocol. DNA fragments of 500 to 800 bp were gel size selected using Ranger Technology, an automated electrophoresis workstation. Sequencing of the size-selected DNA libraries demonstrated significant improvements to read length and quality of the sequencing reads.

This manuscript describes an automated gel size selection approach for purifying DNA fragments for next-generation sequencing. The Ranger Technology provides complete automation of the entire process of agarose gel loading, electrophoretic analysis, and recovery of targeted DNA fragments allowing for high-throughput and high quality next-generation sequencing libraries.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

Çevre

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Genetik

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Ampirik, Metagenomic ve bilgisayar teknikleri mekanizma hangi mantar ilaçları uzlaşma arı sağlık ile aydınlatmak

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data may include mobile genetic elements, such as plasmids and extrachromosomal phage, that contribute to the dissemination of antimicrobial resistance and further complicate treatment of urinary tract infection (UTI). In addition to providing fine resolution of genome structure, complete, closed genomes allow for the detailed comparative genomics and evolutionary analyses. The generation of complete genomes de novo has long been a challenging task due to limitations of available sequencing technology. Paired-end Next Generation Sequencing (NGS) produces high quality short reads often resulting in accurate but fragmented genome assemblies. On the contrary, Nanopore sequencing provides long reads of lower quality normally leading to error-prone complete assemblies. Such errors may hamper genome-wide association studies or provide misleading variant analysis results. Therefore, hybrid approaches combining both short and long reads have emerged as reliable methods to achieve highly accurate closed bacterial genomes. Reported herein is a comprehensive method for the culture of diverse urinary bacteria, species identification by 16S rRNA gene sequencing, extraction of genomic DNA (gDNA), and generation of short and long reads by NGS and Nanopore platforms, respectively. Additionally, this method describes a bioinformatic pipeline of quality control, assembly, and gene prediction algorithms for the generation of annotated complete genome sequences. Combination of bioinformatic tools enables the selection of high quality read data for hybrid genome assembly and downstream analysis. The streamlined approach for the hybrid de novo genome assembly described in this protocol may be adapted for the use in any culturable bacteria.

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

This protocol details a comprehensive approach for the culturing, sequencing, and de novo hybrid genome assembly of urinary bacteria. It provides a reproducible procedure for the generation of complete, circular genome sequences useful in studying both chromosomal and extrachromosomal genetic elements contributing to urinary colonization, pathogenesis, and antimicrobial resistance dissemination.

Kısa ve Uzun Süredir Okunan Dizileme Teknolojilerini Kullanarak İdrar Bakterilerinin Tam Genomlarının Üretilmesi için Hibrit De Novo Genom Montajı

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

<meta charset="utf8"></head><body>Tıbbi Bitkiler için DNA Barkodlaması: Tanımlama ve Filogenetik Analiz

Application of DNA Barcoding to Identify Medicinal Plants

Medicinal plants are valuable resources globally and are used worldwide to maintain health and treat disease; however, the presence of adulteration obstructs their development. DNA barcoding, a technique for species identification by standard DNA regions, facilitates prompt and accurate identification of traditional medicinal plants. The process of DNA barcoding entails six basic steps: 1) processing the medicinal plants, 2) extracting high-quality total DNA from the medicinal plants using centrifugal column method, 3) amplifying target DNA region internal transcribed spacer 2 (ITS2) with universal primers of plants and performing Sanger sequencing, 4) splicing and aligning sequence to obtain the target sequence, 5) matching the barcode sequence against the barcode library for identification, 6) aligning sequence, comparing intraspecific and interspecific variation, constructing phylogenetic neighbor-joining tree. As shown in the results, the universal primer can amplify the target region. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) demonstrates the percentage identified was 100%, and the neighbor-joining tree demonstrates that the splicing sequences were clustered with the A. sinensis OR879715.1 clade, and the clade support value is 100. This protocol provides a reference for applying DNA barcoding technology as an effective method to identify medicinal plants and adulterants.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Tıbbi Bitki Tanımlamanın Verimliliğini Artırmak için DNA Barkod Teknolojisinden Yararlanma

The present protocol describes the use of DNA barcoding technology to authenticate plant-based medicinal materials, and the medicinal plant Angelica sinensis (Oliv.) Diels was identified as an example.

Tıbbi Bitkileri Tanımlamak için DNA Barkodlama Uygulaması

Medicinal plants are valuable resources globally and are used worldwide to maintain health and treat disease; however, the presence of adulteration ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Sağlam DNA izolasyon ve yüksek işlem hacmi sıralama kitaplığı inşaat sulak numuneler için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Uzun Okuma Dizi Yapmak İçin Küllemesi Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA saflaştırılması

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Ampirik, Metagenomic ve bilgisayar teknikleri mekanizma hangi mantar ilaçları uzlaşma arı sağlık ile aydınlatmak

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Kısa ve Uzun Süredir Okunan Dizileme Teknolojilerini Kullanarak İdrar Bakterilerinin Tam Genomlarının Üretilmesi için Hibrit De Novo Genom Montajı

Tıbbi Bitkileri Tanımlamak için DNA Barkodlama Uygulaması

Tıbbi Bitkileri Tanımlamak için DNA Barkodlama Uygulaması

Tıbbi Bitkileri Tanımlamak için DNA Barkodlama Uygulaması

Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem