אנחנו רוצים להכיר בואן אנתוני שקופיות אשר שימשו השוואה side-by-side האדם השני, כמו גם סברינה נולאן שקופיות אשר שימשו כמו השלישי אנושי-לצד השני השוואה מיקרוסקופ.

1. הכנת שקופית אינדיה אינק
<ol><li>פיפטה 10 µL מדגם cryptococcal לשקופית. כל זן שמרים מעגלית תפעל אך עבור ניסוי זה H99 היה המתח היחידים בשימוש. הערה: אם המדגם הוא ישירות מתוך תרבות המדיה, דילול 1:2 עם PBS או מים יכול לסייע למנוע את הדיו הודו הצליעה.</li>
	<li>פיפטה 2 µL של כתם דיו הודו על המדגם ומערבבים על ידי דוחף את הטיפ פיפטה לדגימת ופיזית נע בתנועה סיבובית להופעת הדיו הודו המתפלג.</li>
	<li>הצב של coverslip על המדגם על-ידי החזקת הקצה השמאלי של coverslip מפני השטח של השקופית, ואז בעדינות ובצורה שווה להורדת הנגדי של coverslip על המדגם.</li>
	<li>לאפשר את השקופית מהאוויר להתייבש במשך 5 דקות.</li>
	<li>בעדינות להחיל שכבה של לק coverslip הגבול טופס גושפנקה ולשמר את הכתם אינדיה אינק.</li>
</ol>2. הדמיה שקופיות
<ol><li>מקום שקופיות מיקרוסקופ שדה בהיר עם המצלמה המצורף, המרת פיקסלים-כדי-מיקרו-ידוע. התאם מסננים, מטרות וחדות כך תא קפסולות ברורים ולא תא הגופות להקות ממוקד, כהה. הערה: שונים מסננים, מטרות והגדרות ניגודיות יעבוד אבל 20 x אובייקטיבי, Ph1 מסנן ו- 2 x 2 binning מומלץ.</li>
	<li>ודא שדה הראיה צפוף אבל לא כבדה ומזיהום עם התאים cryptococcal, עם ניגודיות ברורה בין כמוסה תא ורקע, וממוקד כראוי עם גוף התא דמיינו כלהקה כהה. הערה: המספר המדויק של תאים עבור תמונה אופטימלית ישתנו בהתאם לדוגמה המטרה בשימוש. ההיבטים החשובים הם כדי להבטיח התאים אינם מקובצים באשכולות או חופפים, כי המטוסים מוקד תא ולא ישתנו באופן משמעותי, וזה משמעותי דיו הודו כתם בבירור ברקע (לפחות 25% של השדה).</li>
	<li>לשמור תמונות ספריה בודדת עם כותרות ברורות, האלגוריתם מדידה יופעלו על תמונות ספריה בודדת, נתוני הפלט ימוינו לפי השמות של קבצי התמונות.</li>
</ol>3. אלגוריתם ההתקנה
<ol><li>התקנת פייתון גירסה 2.7 מ</li>
	<li>התקן ספריות פיתון נוספים על ידי הפעלת הפקודות "פיפ להתקין את הכרית", "פיפ להתקין את openpyxl".</li>
	<li>התקנת MATLAB בהתאם להוראות המפורטות ב</li>
	<li>מבנה הספרייה פיתון MATLAB על-ידי ביצוע ההוראות המפורטות ב- https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.</li>
	<li>להוריד את הקבצים הדרושים שלוש הכלולות בחומרים של כתב יד זה משלים ("QCA.py", "Analysis2.m" ו- "TestRun.m"). הערה: קבצים אלה ניתן לחילוץ לכל מקום, אבל שלושתן חייב להיות באותה ספריה.</li>
</ol>4. שימוש באלגוריתם
<ol><li>הפעל את היישום על-ידי לחיצה כפולה על QCA.py. הערה: היישום עשוי להימשך מספר דקות כדי להתחיל. קובץ ה-"QCA.py" מכיל את מבנה תוכנית שקוראת את הקבצים "דדי כהן" כדי להפעיל את האלגוריתם בפועל.</li>
	<li>בצע את השלבים המפורטים בתכנית.<ol>
<li>הקלט סוג הסיומת של קבצי התמונות ולפניהם תקופה, כשהם מופרדים באמצעות תווי נקודה-פסיק (ex. ". TIF;. jpeg") ואז לחץ לחצן Enter .</li>
		<li>בחר את הספריה שבה ממוקמים את קובצי התמונה על-ידי לחיצה על לחצן בחר מדריך ובחירת התיקיה המכילה את התמונות.</li>
		<li>צור הרשימה של קבצי תמונה בספריה על-ידי לחיצה על לחצן צור רשימת התמונה . התמונות יפורטו בתיבת הטקסט לימין. לסקור, ודא שהרשימה מדויקים ומלאים.</li>
		<li>בחר תמונה אקראית מתוך הרשימה שתשמש תצוגה מקדימה על-ידי לחיצה על לחצן בחר תמונה אקראית . הערה: אם התמונה היא אפשרות לפתוח עקב "שגוי תמונת מצב שגיאה", האלגוריתם ימשיכו לפעול כראוי למרות לא מציג את התמונה. לאחר שלב 4.2.7, עדיין להציג תמונת הבדיקה.</li>
		<li>קלט מיקרוסקופ אובייקטיבית, binning הגדרות. אם הגדרות ברירת המחדל אינם תואמים המיקרוסקופ משמש, בחר מותאמת אישית פיקסל המרה"ולהזין פיקסל-כדי-אום ההמרה עבור קבצי תמונה. לאחר הבחירה, לחץ על כפתור חישוב המרה ולהבטיח שההמרה היא הנכונה לפי תיבת הטקסט בצד הימין. הערה: להחליפן בתמונות המוצגות באיור 1 חושבו עם 40 x הגדלה ו 2 x 2 binning שנבחר.</li>
		<li>קלט פרמטרי האלגוריתם לזיהוי עיגול.<ol>
<li>קלט את רדיוס מינימום ומקסימום לזיהוי איתור קפסולה החיצוני כערכים Min ו- Max כמוסה רדיוס. מגוון קטן יותר יאפשר תוצאות מדויקות יותר.</li>
			<li>קלט את רדיוס מינימום ומקסימום לזיהוי לגילוי גוף התא כערכים Min ו- Max גוף התא Radius. הערה: כל ארבעת ערכים אלה צריכים להיות מספרים המייצגים את הערכים המתאימים שלהם בפיקסלים, על פי תמונות המקור.</li>
			<li>הזז את המחוונים כמוסה ורגישות לגוף התא כדי להתאים את סף הרגישות של האלגוריתם. רגישות נמוכה יהיה נוקשה, להפחית את זיהוי מעגל חיובי כוזב, אך עלולה גם לאתר פחות עיגולים אמיתיים. לעומת זאת, רגישות גבוהה יגדל שיעור גילוי, אך עלולה גם במעגלים חיובי כוזב. הערה: נציג התוצאות התקבלו עם מינימום רדיוס קפסולה של 7, רדיוס קפסולה מקסימלית של 45, הגוף מינימום רדיוס של 4, הגוף המרבי ברדיוס של 30, רגישות קפסולה של 87, ורגישות הגוף של 87.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בדוק את הפרמטרים בתמונה שנבחרו באקראי על ידי לחיצה על לחצן הפעל בדיקת . התוצאות יוצגו במרכז העליון של התוכנית, החלפת התמונה המקורית. אם התוצאות נראות מדויק, מומלץ לבחור תמונה אקראית נוספים כדי לנסות כמו גם להבטיח שערכי הפרמטרים יתאימו לכל התמונות שנבחרו.<ol>
<li>להגדיל את מספר הגופות, קפסולות זוהה באופן חזותי לבחון החוגים יופיעו כדי להתאים כראוי. מספר הגופות בתוך קפסולות זוהה יוצג בתיבת הטקסט לימין. אחרת, לשנות את הפרמטרים אלגוריתם עד התוצאות מדויקות. הערה: עיגולים צבעוניים עבים הם רק. כדי לעזור עם פריט חזותי. החוגים בפועל שנוצר למדידה הוא עקומה מתמטית מחושב על ידי האלגוריתם של HCT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להפעיל את אלגוריתם זיהוי על הספריה כולה של קבצי תמונה על-ידי לחיצה על לחצן להתחיל בניתוח . כל תמונה ינותחו ויציג התוכנית "סיים" בתיבת הטקסט ימינה כאשר יש כבר ניתחו את כל התמונות.</li>
		<li>לחץ על הלחצן התאמה וניקוי . זה תואם הגופות שזוהו תא הקפסולות שזוהו שהם מתגוררים, לחשב את רדיוס קפסולה נכון על-ידי חיסור מהגוף כמוסה. הערה: אם האלגוריתם נמצא בשימוש כדי לזהות קרינה פלואורסצנטית או מצב אחר שבו מעגל היחידה היא מזוהה שלב זה הוא מיותר. במקום לחץ על הגופים למשוך רק או לחצן קפסולות למשוך רק כדי לאסוף את הנתונים רק את הכחול או רק את עיגולים ירוקים, בהתאמה. חשוב לציין כי אם רק אחזור הנתונים קפסולה הרדיוס יפנה מהרדיוס הכולל של התא כפי הרדיוס של גוף התא לא יכול להיות מופחתים.</li>
		<li>לאתר את הנתונים הושלמה בקובץ "CleanedOuput.csv" בספריית תמונות. אם רק חתיכה אחת של נתונים נבחרה, יסומנו כסעיפים את הקובץ "CleanedBodies.csv" או "CleanedCapsules.csv".</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

השלבים הקריטיים של טכניקה זו מכין את השקופית אינדיה אינק, רכישת תמונות מיקרוסקופ. בעוד האלגוריתם נבדק בהצלחה עם מגוון רחב של טכניקות שקופיות ותמונה הפרוטוקול המומלץ מתואר בכתב היד. הקפסולה רב-סוכר מזוהה בהתבסס על הכללת חלקיקי דיו הודו מהתחום של הקפסולה, כמו חלקיקי האלה גדולות מדי לחדור לר...

קריפטוקוקוס neoformans היא פטרייה פתוגניים נמצאו ubiquitously ברחבי העולם המשויך מחלות אנושיות בעיקר באוכלוסיות immunosuppressed. Neoformans ג שהבולט מהווה גורם משמעותי סך מקרי המוות השנתי ב אפריקה שמדרום לסהרה עקב מחלה זיהומית1. הביטוי הקליני העיקריים של זיהום cryptococcal הוא meningoencephalitis, אשר עוקב אחר הפלישה של מערכת העצבים המרכזית על ידי תחבורה נגוע מקרופאגים (הסוס הטרויאני באופן) או מעבר ישיר של מחסום הדם - מוח. Neoformans ג מבטא מספר גורמים התקפה אלימה, כולל היכולת לשכפל את טמפרטורת גוף נורמלית, פעילות אוראז, melanization, ואת היווצרות קפסולה רב-סוכר2. הקפסולה רב-סוכר מורכב חוזרות glucuronoxylomannan glucoronoxylomannangalactan פולימרים והפונקציות כמחסום מגן נגד גורמי עקה ו מארח תגובות חיסוניות2.
למרות הגודל לגודל הקפסולה cryptococcal רב-סוכר לא עקבי שויכה התקפה אלימה, יש ראיות כי זה גורם פתוגנזה2,3,4,5, 6,7. גודל קפסולה מזוהה עם דלקת קרום המוח פתולוגיה6, יכול להשפיע על מקרופאג היכולת לשלוט קריפטוקוקוס זיהום5, יכול לגרום לאובדן של התקפה אלימה אם נעדר8. לפיכך, מדידות גודל קפסולה נפוצים במחקר cryptococcal, אבל יש fieldwide אין תקן שיטת מדידה קפסולה.
כיום, neoformans ג רב-סוכר קפסולה המדידה מבוססת על מדידות ידניות של תמונות מיקרוסקופ, השיטות המדויק של רכישות התמונה והן מידה משתנים על פני מעבדות9,10, 11. הדאגה המיידית לשיטה זו היא כי מספר מחקרים דורשים הרכישה של אלפי מדידות, מה שהופך ולשמירה על רמת דיוק ואמינות קשה. יתר על כן, גם כאשר מתפרסמות התוצאות, יש לעיתים קרובות תיאור לקוי של שיטת מדידה. פרסומים רבים לא מסבירים איך המדידות שלהם התקבלו, איזה מטוס מוקד שימש, איך הם קבעו את הסף עבור זיהוי קפסולה, בין אם הם השתמשו רדיוס או קוטר, בין אם הם השתמשו מדידה אחת או בממוצע מספר, או אחרים פרטים. כמה פרסומים היחידה המדינה שלהם לשיטה כמו איזו תוכנית ששימשה, למשל, "Adobe Photoshop CS3 שימש כדי למדוד את התאים"11. חוסר פירוט תקנון ודיווח באפשרותך להפוך הפארמצבטית קשה אם לא בלתי אפשרי. הבדלים הראייה האנושי, בהירות המחשב, ההגדרות מיקרוסקופ, שקופיות תאורה, גורמים אחרים יכולים להשתנות לא רק בין יחידים אלא בין דגימות, ואילו חישובים בהתבסס על יחסי גודל של פיקסל ערכי העוצמה יישאר קבוע, החלים בין הדגימות. טכניקה זו נוצר בהקשר של מתן טכניקה סטנדרטית, מדויק, מהיר ופשוט למדוד גדלים קפסולות של שדה שבו היה קודם.
כאמור, האלגוריתם CHT ותיקה, קבצי script כדי לזהות באופן אוטומטי את העיגולים נכתבו לפני. שיטה זו משפרת בשני תחומים איפה סקריפטים אחרים יפול קצר. ראשית, גילוי פשוט עיגולים אינה מספיקה, כי עם תאים cryptococcal שני מעגלים נפרדים חייב להתגלות אחד ביחס לשני. שיטה זו במיוחד מזהה תא גופות בתוך קפסולות מפלה בין השניים, מבצעת את החישובים רק על זוגות הגוף-קפסולת הרלוונטיים. שנית, אפילו כאשר בעקבות באותו פרוטוקול, חוקרים שונים יגיעו עם שונה רכשה תמונות. בכך שהוא מאפשר את השליטה חוקר כל פרמטר אלגוריתם, כלי זה יכול להיות מותאם כדי להתאים למגוון רחב של שיטות רכישה. יש צורך היקף מתוקננת, המטרה, סינון וכן הלאה.
טכניקה זו ניתן בקלות ליישם בכל מצב שבו החוקר צריך לזהות החוגים בתוך תמונה בניגוד עם הרקע שלהם. שניהם עיגולים בהיר יותר וכהה יותר הרקע שלהם יכול להתגלות, ספרתי, נמדד בעזרת טכניקה זו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

מטרת טכניקה זו היא לספק תהליך עקבי, מדויק, הניתנים לניהול והגמישים עבור מספרים גדולים של מדידות קפסולה רב-סוכר.
ראשית, תמונת הסף נוצר בהתבסס על ערכי העוצמה מחושב באופן ייחודי עבור כל תמונה. לאחר מכן, עיגולים מזוהים בהתבסס על הניגוד בין אובייקט לבין רקע בעזרת האלגוריתם מעגל האף טרנספורמציה (CHT) ומבוססת. לבסוף, תא שזוהו קפסולות של גופים מתאימים על פי קואורדינטות מרכז ואת גודל הרדיוס, הנתונים מיוצאים אל המשתמש בגיליון לניהול.
היתרונות של שיטה זו הם פשוטים אך משמעותי. הראשון, כי חישובים אלה מבוצעים על ידי אלגוריתם מאשר אדם דיוק ואמינות הוגדלה. אין שום ירידה הדיוק או המהימנות בין כמה דוגמאות מנותחות. שנית, גישה זו מבססת על סטנדרטי פוטנציאליים עבור השדה קריפטוקוקוס במקום המצב הנוכחי שבו מדידה קפסולה משתנה על ידי המעבדה. שלישית, מכיוון שטווח המידות קפסולה ידני הם איטי ומונוטוני, אוטומציה מאפשר מדידות מהירה על מספר גדול של תאי שמרים בתורו המקל על תפוקה גבוהה ניתוח נתונים וסטטיסטיקות חזק יותר ויותר.
המגבלות הגדולות של טכניקה זו בא איך הפונקציות אלגוריתם. ראשית, האלגוריתם יפיק רק מעגלים. בעוד קריפטוקוקוס תאים וכמוסות שלהם לקחת על מורפולוגיה מעגלית של, זה יהיה קשה ליישם טכניקה זו לאיתור אובייקט שאינו עגול. שנית, בשל כמה עיגולים מזוהים האלגוריתם CHT יכול לזהות עצום עיגולים המדומה המבוססת על הקצוות החיצוניים של מעגלים באשכולות. עם זאת, גופות תא מטעים המוצגים נתפס בתוך המעגל מדומה בקלות ועוזרת להסיר ערכות הנתונים הנוצרת.
טכניקה זו מיועד למדידת הקפסולות רב-סוכר מעגלית של מינים קריפטוקוקוס בהתבסס על מיקרוסקופיית שדה בהיר דיו הודו; אבל זה יכול להיות מיושם על חדות אחרות מבוסס אובייקט עגול מדידות.

תמונות מתקבלים לראשונה על ידי מיקרוסקופ של דיות שקופיות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר בשילוב עם מצלמה (איור 1א'). חשוב לקבוע תאים נפרדו, בצפיפות נמוכה מספיק לא להכריע בתחום התצוגה, כמו גם באשר להשתמש הכתם מספיק כדי ליצור ניגודיות בין תאים לבין הרקע. כ...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body at JoVE.com

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

מדידה אוטומטיות של Cryptococcal מינים רב-סוכר כמוסה וגוף התא

טכניקה זו מתאר של אצווה אוטומטיות מעבד שנועד למדוד את רדיוס כמוסה וגוף רב-סוכר. אמנם תוכנן בתחילה למדידות קפסולה קריפטוקוקוס neoformans מעבד התמונות האוטומטי ניתן גם ליישם אחרים ניגוד המבוסס על זיהוי אובייקטים מעגלית.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.2K Views.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. טכניקה זו מתאר של אצווה אוטומטיות מעבד שנועד למדוד את רדיוס כמוסה וגוף רב-סוכר. אמנם תוכנן בתחילה למדידות קפסולה קריפטוקוקוס neoformans מעבד התמונות האוטומטי ניתן גם ליישם אחרים ניגוד המבוסס על זיהוי אובייקטים מעגלית.

Video: Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

מדידה של זיהום γHV68 ב עכברים

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

גודל ענייני: מדידה של הקפסולה בקוטר של neoformans קריפטוקוקוס

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

מדידה טמפרטורת גוף העכבר באמצעות מד חום אינפרא אדום במהלך אנפילקסיס מערכתית פסיבי והערכה אלרגיה למזון

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various pathologies such as cancer, atherosclerosis and diabetes. We have previously shown that dysfunction of the Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)/ Kelch-like erythroid cell-derived protein 1 (Keap1) signaling pathway leads to extreme ROS imbalance during cutaneous wound healing in diabetes. Since ROS levels are an important indicator of progression of wound healing, specific and accurate quantification techniques are valuable. Several in vitro assays to measure ROS in cells and tissues have been described; however, they only provide a single cumulative measurement per sample. More recently, the development of protein-based indicators and imaging modalities have allowed for unique spatiotemporal analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is a luminol derivative that can be used for both in vivo and in vitro chemiluminescent detection of ROS generated by NAPDH oxidase. L-012 emits a stronger signal than other fluorescent probes and has been shown to be both sensitive and reliable for detecting ROS. The time lapse applicability of L-012-facilitated imaging provides valuable information about inflammatory processes while reducing the need for sacrifice and overall reducing the number of study animals. Here, we describe a protocol utilizing L-012-facilitated in vivo imaging to quantify oxidative stress in a model of excisional wound healing using diabetic mice with locally dysfunctional Nrf2/Keap1.

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

We describe a non-invasive in vivo imaging protocol that is streamlined and cost-effective, utilizing L-012, a chemiluminescent luminol-analog, to visualize and quantify reactive oxygen species (ROS) generated in a mouse excisional wound model.

אין ויוו הדמיה של מינים חמצן תגובתי ב מאתר פצע מודל

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...