אנו מודים לתוכנית הדוקטורט החיים מולקולרית (MOBI), המחלקה לביולוגיה-התיכון טנסי המדינה האוניברסיטה (MTSU) על מתן המימון למחקר זה. הפרויקט גם מומן בחלקו על ידי מענק לפרויקטים מיוחדים מוענק D.E.N. על ידי קרן MTSU.

הערה: neoformans ג . חיידק אבטחה ברמה 2 (BSL-2), בעובדים לזה לנקוט אמצעי זהירות נאותה. נהלים מפורטים על איך כדי בבטחה בעבודה עם פתוגנים BSL-2 ניתן למצוא באתר המרכז לבקרת מחלות של (CDC) באתר, אך חשוב לציין כי כל אדם לבוא במגע עם neoformans ג כראוי בקיצור בטיפול סוכני פתוגניים, רצוי שתלבש המתאים ציוד מגן אישי (PPE), בדרך כלל לטקס או nitrile כפפות. עוד יותר, רוטורים-צנטריפוגות צריך להחתם כדי למנוע חשוד דגימות ונוזלים יש לנקות באופן מיידי באמצעות פתרון של 10% מלבין28.
1. אינדוקציה כמוסה
הערה: כל השלבים צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר אלא אם נכתב אחרת.
<ol><li>תרבות neoformans ג בשמרים peptone דקסטרוז (YPD) מרק (pH 6.5 + /-0.2), דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות עד שהם נמצאים בשלב של יומן (כ ח 18-36).</li>
	<li>צנטריפוגה תאים ב x 870 g למשך 5 דקות ב 21 ° C, לשטוף שלוש פעמים בתמיסת פוספט buffered (PBS).</li>
	<li>השתמש של hemocytometer (או מונה הניתן תא אוטומטית) כדי למנות את התאים resuspend ב 2 x 105 תאים/2 מ ל תקשורתי חיוני מזערי של Dulbecco (DMEM).</li>
	<li>כדי לעודד את הקפסולה, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור 18 h. הערה: השילוב של העדר של חומרים מזינים בתקשורת ואת נוכחותם של CO2 מגרה צמיחה כמוסה neoformans ג .</li>
	<li>שלאחר הדגירה, לקצור את התאים על ידי צריך שתוציאו (לעיל) והסרה של כל 5-10 µL supernatant. במקביל, לקצור מדגם האו ם המושרה תא המתאימים עבור כל זן שברצונך למדוד. להשתמש כפקדים שלילי. הערה: כדורי התא יהיה קטן מאוד, עלול להיות קשה לראות. היה זהיר בעת כ רפה בעברית תגובת שיקוע.</li>
	<li>כתם דיו הודו (סעיף 2.1) או צבעי פלורסנט (סעיף 2.2).</li>
</ol>2. צביעת
<ol><li>
צביעת עם רק אינדיה אינק
	<ol>
<li>כדי להכתים את השמרים עם דיו הודו, resuspend בגדר, תגובת שיקוע הנותרים ולהוסיף 4μL (בערך חצי) של הבולם תא, 4μL של הודו דיו על זכוכית מיקרוסקופ. בעדינות לערבב ולהימנע קצף.</li>
		<li>החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לסגור קצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת עם רק צבעי פלורסנט
	<ol>
<li>כתם השמרים עם צבע פלורסנט-resuspend בגדר תא ב- PBS µL 50 עם 1% אלבומין שור (BSA).</li>
		<li>דגירה התרבות עם אמצעי אחסון שווה של Calcofluor לבן (CFW) (1 µg/mL), mAb כמוסה 18B7 (ראה טבלה של חומרים) מצומדת כדי AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) במשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>צנטריפוגה תאים ב x 870 g למשך 5 דקות ב 21 ° C שלאחר הדגירה, תשאף תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend תא גלולה ב- PBS 10 µL עם 1% אלבומין שור (BSA).</li>
		<li>פיפטה 8 µL של התא השעיה על זכוכית מיקרוסקופ.</li>
		<li>החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לסגור קצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צביעת עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט
	<ol>
<li>להשוות יותר ישירות את היעילות של דיו הודו מכתים לזה של צבעי פלורסנט, שיתוף כתם האוכלוסייה באותו תא עם שני סוגים של הכתם. לשם כך, תחילה תדגור תאים עם הקפסולה פלורסנט והן הכתם דופן התא, לפי שלבים 2.2.1 - 2.2.3</li>
		<li>בשלב הבא, פיפטה נפחים שווים (4 µL) של תא fluorescently ויטראז'ים ההשעיה, דיות על זכוכית. מערבבים בעדינות.</li>
		<li>החל coverslip של זכוכית 13 מ מ (עובי #1.5), לאטום את הקצוות עם איטום רעיל (ברור לק) כדי למנוע את הדגימה ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. התמונה רכישה/מיקרוסקופ
<ol><li>
הדמיה תאים מוכתמים אינדיה אינק.
	<ol>
<li>לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור רגיל (100 X הגדלה).</li>
		<li>תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי. הערה: מספר התאים לכל שדה ישתנו, זה מקובל. חשוב, עם זאת, חופפים את התאים להישמר לכל הפחות, כמו אלה שקשה למדוד (הן באופן ידני והן עם תוכנה אוטומטית). לניסויים אלה, נרכשו תמונות בעומק של 16 סיביות עם פעמים חשיפה ממוטבת כדי למקסם את הניגוד בתמונה תוך מזעור הטשטוש הנגרמת על ידי תנועות קטנות של התאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדמיה תאים צבעונית עם צבעי פלורסנט
	<ol>
<li>כדי דמות בתאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, פתח המיקרוסקופ תוכנות ליצירת תמונות ובחר המתאימים עירור, פליטה אורכי הגל עבור fluorophores בשימוש (CFW ו AF488 מתרגשים באמצעות 405nm את האורות 488 ננומטר, בהתאמה). לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ זריחה.</li>
		<li>תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי. הערה: מספר התאים לכל שדה ישתנו, זה מקובל. חשוב, עם זאת, חופפים את התאים להישמר לפחות כמו אלה שקשה למדוד (הן באופן ידני והן עם תוכנה אוטומטית).</li>
		<li>רוכשים סדרת תמונות z-מחסנית התאים כדי להבטיח כי הקוטר קפסולה המרבי עבור כל תא בתוך שדה נתון מתקבל.<ol>
<li>תוכנת שליטה של מיקרוסקופ, לחץ על שורת "z-מחסנית" כדי לפתוח את לוח הבקרה "z-מחסנית", ולאחר מכן בחר באפשרות "ראשון/אחרון" בפינה השמאלית העליונה של החלונית.</li>
			<li>השתמש הפקד בסדר-המוקד על המיקרוסקופ להתמקד ברמה שמתחת הרחב של תא יחיד שמרים, הקפסולות עבור כל בתוך שדה הראייה הנוכחי, לחץ על "הגדר הראשונה".</li>
			<li>להשתמש בפקד מיקוד פיין להתמקד מעל לנקודת הרחב ביותר של גוף התא באותו התא, של הקפסולה עבור כל התאים בתוך שדה הראייה הנוכחי ולחץ על "קבע אתמול".</li>
			<li>לאחר מכן, לחץ על "להתחיל ניסוי" בכרטיסיה "רכישת" לרכוש המחסנית-z עבור המיקום הנוכחי. חזור על התהליך-תפקידים מרובים עד z-אוסף תמונות של מינימום של 50 תאים להיות רכש. הערה: לניסויים אלה, חריר קונאפוקלית נקבע ל- 1.0, AU ו- z-סדרות חופפים של 10-20 פרוסות כיסוי 0.7 מיקרומטר נרכשו על המיקומים שנבחרו. AU = יחידת אוורירי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בשלב הבא, להמיר כל סדרה z-מחסנית לתחזיות העוצמה המקסימלית (MIP) באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה. הערה: מיליוני הוראות בשניה פרוייקט העוצמה הגבוהה ביותר-כל המטוס של תמונה מוערמים29. יצירת מיליוני הוראות בשניה מאפשרת לייצר ייצוג דו-ממדי של תמונות התואמות התאים המרבי, קוטר כמוסה בתוך הערימה תלת-ממד שנלכדו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הדמיה תאים צבעונית עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט
	<ol>
<li>לרכוש תמונות באמצעות widefield (40 X הגדלה) או מיקרוסקופ קונפוקלי (63 X או 100 X הגדלה). עבור תאים צבעונית עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט, לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ widefield מצויידים הבמה מבוקרת מחשב, שמן טבילה אובייקטיבי. הערה: המיקרוסקופ בשימוש צריך להיות נשלט באמצעות תוכנת הדמיה של CFW. קרינה פלואורסצנטית נרגש דרך מסנן עירור 340-380 nm, ויש הנפלטים אור שיזוהו דרך מסנן מכשול nm 435-485 שמשתקף במראה ודיקרואיק זוהר 400 ננומטר. זריחה AF488 יכול להיות שמחים דרך מסנן עירור 465-495 ננומטר, האור הנפלט יכול להתגלות דרך מסנן מכשול nm 515-555 שמשתקף במראה ודיקרואיק זוהר 505-nm.</li>
		<li>תמונת מינימום של 50 תאים לכל תנאי עבור כל שיטת ההגדלה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ידני מדידה של קפסולה
<ol><li>עבור תאים צבעונית עם דיו הודו או כתמים פלורסנט, להשתמש תוכנת המדידה תא כדי באופן ידני למדוד כמוסה ותא קוטר (ראה טבלה של חומרים). כדי לעשות זאת, עבור אל 'קובץ' > 'פתח תמונה' > "מדידה" ושימוש הסמן כדי לצייר קו ישר דרך נקודת הרחב ביותר של התא כולו (קוטר סה כ).</li>
	<li>לאחר מכן, לחץ שוב על "מידה", לצייר קו ישר דרך הגוף תא (גוף התא קוטר). הערה: מדידות הם שנשמר באופן אוטומטי אל התאים.</li>
	<li>חזור על תהליך זה עבור כל התאים (מינימום של 50/קבוצה).</li>
	<li>כדי לשמור תמונות, ברגע שהם נמדדים, לחץ על "קובץ" > "שמירה בשם" ותן שם את התמונות כראוי.</li>
	<li>בחר את הקבצים לאחרונה נמדד, ייצוא נתונים לתוכנת הגיליון האלקטרוני.</li>
	<li>לחשב את הקוטר קפסולה הממוצע באמצעות המשוואה: ([קוטר הכולל] - [גוף התא קוטר]).</li>
</ol>5. ממוכנות מדידה של קפסולה
הערה: למדידה אוטומטית מוצלחת, להשתמש בתמונות 16 סיביות עם רמה גבוהה של ניגוד, אשר מתמקדים כראוי יחד עם תוכנה ניתוח התמונה המתאימה (ראה טבלה של חומרים). כאשר הדמיה neoformans ג למדידה קפסולה, חשוב להתמקד על הטבעת כהה על הגבול בין התא לבין כמוסה. פעולה זו מאפשרת לתוכנה כראוי ניסחו את התא ואת כמוסה.
<ol><li>היפוך וליצור עותק של כל הודו דיו צבעונית תא תמונות בעזרת תוכנה לעריכת תמונות המתאימות (ראה טבלה של חומרים). כדי לעשות זאת, לחץ על 'קובץ' > 'פתח' כדי לפתוח הודו דיו צבעונית תמונות ולאחר מכן "לשלוט" + "אני" כדי להפוך את התמונה. לחץ על "קובץ" > "שמירה בשם" כדי לשמור את התמונה ההפוכה.</li>
	<li>כדי לייבא המקורי והן הפוך תמונות לתוך התוכנה לחץ על "קובץ" > "רצף לייבא" > "טען תמונה" > "הגדרת רצף (ידנית)" > "מידות (ערוץ)" > "יבא" > "החל". הערה: neoformans ג תא וגופי קפסולות ניתן לזהות, רעולי פנים באמצעות אלגוריתמים מסוימים - המכונה 'מתכונים' - המצורף לתוכנה.</li>
	<li>להשתמש במתכון "מנתח המושבה (זריחה)" על התמונה הפוכה לשם זיהוי של מסיכה בגוף התא ולאחר מכן לחץ על "החל". בתמונה ההפוכה, הטבעת כהה את הגבול של התא neoformans ג הופך בהיר יותר הקפסולה שמסביב.</li>
	<li>להשתמש במתכון "מנתח המושבה (זריחה)" על התמונה הפוכה כדי לפלח את הגופות תא neoformans ג מ קפסולות שלהם ולאחר מכן לחץ על "החל". זה יוצר מסכה ספירה. שינוי שם מסיכה זו ספירת "גוף התא" בלחיצה ימנית על הכרטיסיה בשם "ספירת המסכה". הערה: המתכון מורכב של מספר תמונות צעדים עיבוד: רקע להסרת, זיהוי אובייקט, האובייקט ההפרדה וסינון משנה.</li>
	<li>הבא, להשתמש במתכון "התפשטות תאים" על התמונה המקורית ויוכל להסתיר את הקפסולה ולאחר לחץ על "החל". זה יוצר מסכה ספירה. שינוי שם מסיכה זו ספירת "קפסולה" בלחיצה ימנית על הכרטיסיה בשם "ספירת המסכה".</li>
	<li>באמצעות את המתכון, 'כמוסת מחיצה', ליצור מסכה חדשה על גבי התמונה המקורית מחיצות קפסולות סמוכים אחד מהשני. כדי לעשות זאת, לחץ על "הקפסולה מחיצה" מתוך התפריט הנפתח מתכון. בתיבה מחיצה כמוסה, לבחור המסכה ספירת עכשיו ששמן שונה "(5.5)" קפסולה עבור אזור כמוסה. בחר המסכה ספירת עכשיו ששמם "גוף התא" אנוסים תאים (5.4). לבחור "אורגינל" עבור ערוץ קלט, ו- "יצירת מסכת קפסולה Partitioned. לחץ על "החל הערה: המתכון יוצר התא ואת קוטר קפסולה, המוגדר כממוצע של הצירים הארוכים והקצרים מעבר למרכז של התא, כמוסה, וכן אזור מדידות של זיהוי מסכות. למצוא את הפלט הממוקמים תחת הכרטיסיה גיליון אלקטרוני בתוכנה זו. חזור על תהליך זה עבור כל התמונות (מינימום של 50 תאים/קבוצה). הפרמטרים של המתכון יכול להיות מכוון כדי למטב את גילוי של תמונות בודדות או אופטימיזציה עבור איתור אצווה של תמונות מרובות. מדידות נוספות ניתן לחשב לפי מתכון ואפיון מקיף של התא לבין המורפולוגיה של הקפסולה.</li>
	<li>ייצוא נתונים לתוכנת הגיליון האלקטרוני של בחירה עבור ניתוח נוסף.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+life+of+Cryptococcus+neoformans.">The intracellular life of Cryptococcus neoformans.</a> Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).</li><li>Rajasingham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+disease+of+HIV-associated+cryptococcal+meningitis:+an+updated+analysis.">Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis.</a> Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).</li><li>Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+infections+in+HIV/AIDS.">Fungal infections in HIV/AIDS.</a> Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crisis+in+Infectious+Diseases:+2+Decades+Later.">Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later.</a> Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).</li><li>McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).</li><li>Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+versus+alternative+macrophage+activation:+the+Ying+and+the+Yang+in+host+defense+against+pulmonary+fungal+infections.">Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+and+melanin+formation+as+indicators+of+virulence+in+Cryptococcus+neoformans.">Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans.</a> Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).</li><li>Vecchiarelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+immunological+function+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).</li><li>Murphy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cryptococcal+antigens+on+cell-mediated+immunity.">Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity.</a> Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).</li><li>Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+structure+of+glucuronoxylomannan+in+isolates+from+patients+with+recurrent+cryptococcal+meningitis.">Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis.</a> Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).</li><li>Collins, H. L., Bancroft, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Cryptococcus+neoformans+impairs+antigen-specific+T-cell+responses.">Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses.</a> Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).</li><li>Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+sizes+of+Cryptococcus+neoformans+capsular+polysaccharide+on+phagocytosis.">Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis.</a> Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+ex+vivo+capsule+size+is+associated+with+intracranial+pressure+and+host+immune+response+in+HIV-associated+cryptococcal+meningitis.">Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+behavior+of+capsule+enlargement+by+Cryptococcus+neoformans.">Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).</li><li>O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+a+sword+and+a+shield.">The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield.</a> Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).</li><li>McClelland, E. E., Smith, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+specific+differences+in+the+immune+response+to+infection.">Gender specific differences in the immune response to infection.</a> Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).</li><li>McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+virulence+factor+expression+to+evolved+virulence+in+mouse-passaged+Cryptococcus+neoformans+lines.">Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines.</a> Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+capsule+growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+mammalian+serum+and+CO(2).">Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2).</a> Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).</li><li>Vartivarian, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cryptococcal+capsular+polysaccharide+by+iron.">Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron.</a> J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).</li><li>McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsule+structural+heterogeneity+and+antigenic+variation+in+Cryptococcus+neoformans.">Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).</li><li>Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+capsule+structure+evolution+in+vitro+and+during+murine+infection.">Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection.</a> Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).</li><li>Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).</li><li>Pontes, B., Frases, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+lessons+from+the+use+of+optical+tweezers+and+other+biophysical+tools.">The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools.</a> Front Microbiol. 6, 640 (2015).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+gene+expression+in+individual+cells+and+cell+compartments.">Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments.</a> J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).</li><li>Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+processing+and+analysis+of+dynamic+fluorescence+image+data.">Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data.</a> Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).</li><li>Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+live+cell+images:+Methods,+tools+and+opportunities.">Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities.</a> Methods. , 65-79 (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).</li><li>Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+intensity+projection+using+bidirectional+compositing+with+block+skipping.">Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping.</a> J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).</li><li>Janbon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+and+transcriptome+of+Cryptococcus+neoformans+var.+grubii+reveals+complex+RNA+expression+and+microevolution+leading+to+virulence+attenuation.">Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).</li><li>Bisson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

המחבר, Hoyin לאי, הוא מנהל המוצר ב DRVision אשר מפרסם התוכנה ניתוח התמונה האוטומטי, Aivia.

במשך עשרות שנים, כבר הקפסולה והמוקד העיקרי של המחקר הן mycologists והן קלינאים מעוניין neoformans ג cryptococcosis בשל תפקידה כגורם מרכזי התקפה אלימה על המחלה. באמצעות מיקרוסקופ כדי למדוד את ההבדלים בגודל קפסולה בין זנים, תחת גידול שונים תנאים יכול לספק מידע חשוב על המחלה ועל התגובות לגירויים שונים (כלומר, בתנאי סביבה שונים, טיפולים תרופות פוטנציאליות, וכו ') כאן, אנחנו המחולקות שיטה לזירוז הגידול של הקפסולה ב neoformans ג, שונה בהשוואה שני קפסולת פרוטוקולים מוכתמים. לבסוף, הראינו כיצד תמונה ניתוח תוכנה ניתן להשתמש כדי להפוך לאוטומטית את המדידה של קוטר קפסולה מתמונות של הודו דיו צבעונית תאים, הפקת התוצאות היו דומות לשיטות מדידה ידנית.
בניסויים שלנו, אנחנו לעומת שני זנים קליני, B18 ולא B52, עם H99S, זן מעבדה סטנדרטיים של גודל הידועים כמוסה18. צביעת שתי שיטות הראה כי המתח קליני, B52, היה הקוטר קפסולה הגדול של שלושה זנים נבדק. עם זאת, תוצאות מדידות פלורסנט הצליחו להבחין בין שני זנים עם גודל קטן יותר קפסולה איפה אינדיה אינק מדידות לא היו. התוצאות של שתי שיטות מכתים היו עקביים, רומז כי שניהם תקפים אך כי שימוש בתמונות של fluorescently צבעונית neoformans ג עשוי לאפשר רגישות מוגברת במדידת זנים עם הקפסולה קטן. שימוש מרבי תחזיות שנוצרו מתמונות z-מחסנית של fluorescently תאים מוכתם מאפשר לחוקרים להבטיח מדידות מדויקות קוטר קפסולה יכולים להתבצע גם כאשר התאים שבעורך נמצאים מטוסים מוקד שונים. מדידות אלה קשים יותר עבור neoformans ג עם תמונה באמצעות דיו הודו במיקרוסקופ אור רגיל. בתמונה נתון כלשהו, תאים סמוכים עלול לשבת מטוסים מוקד שונה מעט, ולכן קשה לפתרון במדויק לגבול גוף התא-קפסולת עבור כל התאים. זה יכול אולי לבלבל את היכולת של חוקרים לזהות שינויים קטנים בגודל קפסולה או הבדלים קטנים בין זנים.
לכל שיטה יש יתרונות משלה הטבועה. אינדיה אינק הוא הנפוץ ביותר בשימוש על ידי חוקרים בגלל שלה סבירים במיוחד, קלות שימוש, יציבות (זה לא להיפגם עם הזמן כמו כמה כתמים פלורסנט יכול). בגלל אינדיה אינק הוא כתם פשוטה, שלילי שזה יכול לשמש בשילוב עם מיקרוסקופים אור רגיל, אשר זמינים בקלות רבה יותר מאשר מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, אם לא נעשה שימוש ב- הפרופורציות הנכונות (הודו דיו: מאגר), הכתם ניתן ליצור רקע "כנוצה" כאשר תמונה, אשר יכול לסבך את ניתוח תמונות אוטומטית. בעוד יקרים ולגזול יותר לשימוש, צבעי פלורסנט יכול להיות יתרון עבור גמישותם, וכפי שנראה, הרגישות שלהם. הם שימושיים במיוחד לשקילת נטל גודל ותא קפסולה בניסויים המערבים neoformans ג יש כבר phagocytosed על ידי תאים חיסוניים, נחוצים עבור בחינה היסטולוגית של קפסולה neoformans ג דגימות רקמה (טכניקה לא שמתואר במאמר)32. אם מכתים עם צבעי פלורסנט, כגון calcofluor לבן או נוגדנים נגד מתויגות fluorescently-GXM, הוא בעייתי (למשלצביעת מספיקים), לחסרון זה ניתן בדרך כלל על-ידי מיטוב פרוטוקול מכתימים (הגדלת/הקטנת ריכוז ו/או הדגירה זמן עם לצבוע).
ללא קשר מכתים מתודולוגיה, אנו מוצאים כי אינדוקציה קפסולה והן לכידת תמונה נכונה הם שלבים קריטיים בפרוטוקול. פרוטוקול המתוארים במאמר זה היא אחת ממספר שיטות סטנדרטי עבור אינדוקציה קפסולה ב neoformans ג , שימש בהצלחה במעבדות שמרים במשך שנים רבות23. אינדוקציה כמוסה neoformans ג הוא CO2-תלויים ומתרחשת רק תחת תנאים מלחיץ23,33. לכן, זה קריטי כי זה מתרחשת ב- 5% CO2 מגשים באמצעות של מדיום הגידול לקוי מזין המתאים. אם יש חשד הקפסולה הזו לא המושרה לאחר תקופת דגירה (בדרך כלל ח 18-24) רגיל, צריך להשוות את התאים תרבות שליטה uninduced כי לא נחשף בתנאים מלחיצים. השוואה בין השניים יקבע אם תנאי הגיוס היה יעיל. אינדוקציה מוצלח הוא אחד שבו הרוב המכריע של תאים להפוך את הלקט גדול יותר, בהשוואה הפקד uninduced. כי לא כל התאים יניעו, התאים שברצונך למדוד צריך להיות ייצוג הטרוגנית של התאים הזמינים.
לא ניתן להפריז על חשיבות רכישת תמונה עקבית, במיוחד אם מדידה אוטומטיות היא המטרה. המוקד, ניגודיות, רקע זריחה, כמו גם עומק סיביות ותמונה הדחיסה של הקבצים הם שיקולים חשובים הכל. במידת האפשר, אשכולות גדולים של תאים לא לשבת בתוך מטוס מוקד בודד להימנע, למרות כמה הנצה ונוגע תאים מקובלים, יכולים להיות בלתי נמנע (כלל זה צריכה להיות מלווה גם ידני וגם אוטומטי מודדים). בעיה זו יכולה שיפרו במידה מסוימת כאשר באמצעות הדמיה קונאפוקלית של fluorescently צבעונית תאים. השימוש של z-במחסן לייצר תחזיות העוצמה המקסימלית יכול לאפשר מדידה מדויקת של תאים במטוסים מוקד שונים תמונה בודדת29. בנוסף, תמונות כדאי לרכוש במהירות לאחר הכנת המדגם. זה יכול להיות חשוב במיוחד עבור הודו דיו צבעונית דוגמאות כמו כאשר הם מתחילים להתייבש, הניגוד בין האלמנטים רקע וקידמה (התאים) יכולים להפחית תכונות בלתי רצויות רקע שעשויים להיות מוגברת, מה שמוביל מופחתת אוטומטיות פילוח של דיוק.
מידות קוטר קפסולה הן דבר שבשגרה בקהילה neoformans ג , אך עד לנקודה זו הם בדרך כלל בוצעו באופן ידני, אשר דורש זמן ניכר וכוח אדם. עם זאת, מדידות ידניות מתקבלות בשדה, תוצאות ניתן להשיג במחיר קטן. החידושים התמונה ניתוח תוכנה הפכו אותה אפשר לקחת את הצעדים הראשונים לקראת הפיכת מדידות אלה. טבעם של גוף התא neoformans ג , כמוסה - המופיעים בצורת מעגל בתוך מעגל - תמונות דו-ממדיות הופך את המדידה של הגדלים שלהם פשוטה יחסית לחבילות תוכנה פילוח תמונה אוטומטי, ללא צורך לפתח רומן אלגוריתמים. במקום זאת, על-ידי קישור קיימים אלגוריתמים, neoformans ג תאים, קפסולות, מקוטע, ועוזרת נמדד. באמצעות גישה זו, אנו יש אוטומטית את המידות של הקוטר כמוסה neoformans ג תאים מוכתמים צבע דיו הודו, כמוסה בשימוש הנפוץ ביותר, יש לי לעומת אלה למידות ידנית עבור ערכות הנתונים אותו. שיטה זו מציעה את היתרון של הפארמצבטית, הסרת הרבה טעות אנוש הקשורים מדידה ידנית תוך חיסכון הזמן חוקר. יתר על כן, מדידה נוספת שניתן לשלבן במינימום מאמץ שזרימת העבודה ניתוח אוטומטיות. אנו חשים כי ניתוח תמונות אוטומטית היא גישה מבטיח זה מאפשר לחוקרים למדוד מספר רב של neoformans ג כמוסה עם רמה גבוהה של דיוק ויעילות.
בסך הכל, הראו כיצד בהצלחה לגרום לצמיחה קפסולה ב neoformans ג, מכתים את הדגימות עם דיו הודו או צבעי פלורסנט, למדוד את קוטר הקפסולה באמצעות מדידות ידניים ואוטומטיים בירושלים ניתוח תמונה תוכנה. התוצאות שלנו מציע כי שתי השיטות של צביעת הינם בדרך כלל לייצר תוצאות עקביות (אם כי יש השתנות יותר עם מדידות דיו הודו). עוד יותר, גם ידני וגם אוטומטי שיטות מדידה יש את היכולת להבחין משתנה גדלים כמוסה.

משפיע על רבע מיליון אנשים כל שנה, וכתוצאה מכך 180,000 יותר מקרי מוות מדי שנה, קריפטוקוקוס neoformans הוא שמרים פתוגניים, תאיים, סוכן סיבתי של cryptococcosis1,2, 3. שנפגעו הם חולי HIV-חיוביות במדינות עניות שאין להם גישה מוכן לטיפול תרופתי, עושים אותם רגישים בחריפות המחלה4,5,6. נתוני ה-CDC מציינים כי ב אפריקה שמדרום לסהרה, neoformans ג הורג יותר אנשים שחפת מדי שנה, יותר מדי חודש יותר מכל התפרצות אבולה רשומה1. תוואי החשיפה השכיחה ביותר מתרחשת משאיפת נבגים מיובש השגורה הסביבה7. עם כניסתו אל הריאות, ישנם מספר גורמים התקפה אלימה אשר תורמים להצלחת neoformans ג בתוך אנשים נגועים. הקפסולה רב-סוכר נחשבת הגורם של החיידק העיקרי התקפה אלימה, כמו זנים acapsular אינן מידבק8.
הקפסולה cryptococcal מורכבת של שלושה מרכיבים עיקרון: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), ו- mannoproteins (MPs)9. בעוד MPs הם קלים יחסית רכיב הקשורים דופן התא של הקפסולה, הם immunogenic, יכול לקדם מענה בעיקר פרו דלקתיים9,10. לעומת זאת, GXM ו GalXM לעשות את החלק הארי של הקפסולה (> 90% לפי משקל) ויש תופעות לדיכוי המערכת החיסונית11. בנוסף השפעותיו immunomodulatory, הגדלה מהירה של ה קפסולה ויוו יוצר מחסום מכני בליעה על ידי המארח תאים phagocytic (קרי, נויטרופילים ומקרופגים)12. הקפסולה neoformans ג ו הסינתזה שלו הם מורכבים, אבל באופן כללי, הגדלת קוטר קפסולה הוא מתואם עם התקפה אלימה מוגברת6,13,14. נתון זה, חשוב לחוקרים neoformans ג שניתן יהיה במהירות ובדייקנות לכמת מדידות כמוסה.
תא neoformans ג והן כמוסה רב-סוכר שלה הם מבנים דינמיים ולהראות שינויים לאורך זמן15. הקפסולה יכול שינוי צפיפות, בגודל הרכבה בתגובה לשינויים17,1816,סביבת המחשב המארח. ברזל נמוך או רמות מזין, חשיפה סרום, ה-pH אנושי פיזיולוגי ו CO מוגבר2 ידועים ליזום צמיחה קפסולה16,18,19,20. יתרה מזאת, חוקרים יש הראו שינויים מבניים וכתוצאה מכך הבדלים משמעותיים immunoreactivity במהלך זיהום, ההלוואות יתרון כדי neoformans ג על המארח שלו21,22. דבר זה ידוע כי הארכיטקטורה של הקפסולה neoformans ג נותחה במגוון דרכים. מיקרוסקופ אלקטרונים, לדוגמה, חשפה כי הקפסולה יש מטריצה הטרוגנית עם שכבת צפיפות אלקטרונים הפנימית מתחת לשכבה החיצונית, יותר חדיר23. פיזור אור ושימוש של מלקחיים אופטיים אפשרו החוקרים להבהיר עוד יותר את מאפייני macromolecular24. ניתוח התוצאות של שתי מדידות פיזור אור סטטיים ודינמיים, אנו יודעים כי הקפסולה רב-סוכר יש מורכבות מסעף מבנה23. מלקחיים אופטיים שימשו כדי לבחון את הנוקשות של המבנה, כמו גם להעריך את תגובתיות של נוגדן24. אולם, ניתוח מועסקים לעיתים קרובות ביותר של הקפסולה neoformans ג הוא מידת גודלו.
כדי לכמת את גודל קפסולה, חוקרים משתמשים מה צריך להיות מדידה פשוטה: הקוטר ליניארי של הקפסולה. מיקרוסקופ דיגיטלי משמשים כדי ללכוד תמונות של neoformans ג מספר תאים (בדרך כלל מאות) צבעונית עם דיו הודו או צבעי פלורסנט. הגודל של כל תא בגוף, כמוסה שמסביב נמדד. הנתונים נאספים, קוטר ממוצע של הקפסולה מחושבת על-ידי חיסור הקוטר לגוף התא של הקוטר התא כולו (תאי גוף + כמוסה). עד לנקודה זו, מדידות אלה נעשו באופן ידני. בעוד בדרך כלל מדויק, בשיטה זו יש חסרונות לחוקרים. ערכות נתונים גדולות יכול לקחת ימים או אפילו שבועות כדי לנתח באופן ידני. כי מדידות אלה נעשים באופן ידני, סובייקטיביות, טעות אנוש משפיעה על התוצאה.
ניתוח אוטומטיות תמונות חישובית הפך כלי הכרחי עבור חוקרים בתחומים רבים של ביולוגיה מולקולרית של התא, המאפשר ניתוח מהיר ואמין יותר של תמונות ביולוגי 25,26,27. טכניקות ניתוח תמונה מדויקת יש צורך לכרות כמותיים של מה הם לעיתים קרובות ערכות נתונים מורכב ועמוק. עם זאת, כמה מדידות, במיוחד את המדידה של הקפסולה ג neoformans , היה קשה להפוך לאוטומטי. זיהוי במדויק את הממשק בין התא לבין קפסולה, אשר בדרך כלל מופיע כעיגול כהה כאשר צילמו על ידי מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, יכול להיות בעייתי לפתור באמצעות סף פשוטה. יתרה מזו, neoformans ג תאים בתרבות נוטים להתאחד ואת פילוח מדויק של התאים הוא הכרחי עבור מדידות מדויקות.
מטרת הפרויקט היתה להמחשת (i) אחד מהפרוטוקולים סטנדרטי עבור אינדוקציה קפסולה ב neoformans ג, (ii) השוואה וחדות אינדיה אינק ולפתח פלורסצנטיות צביעת דגים קפסולת מידות קוטר, (iii) פשוט, שיטות למדידת קוטר הקפסולה באמצעות תמונות של הודו דיו צבעונית תאים באמצעות ניתוח תמונה של התוכנה, ו, (iv) להעריך על יתרונותיה וחסרונותיה של מדידת קוטר קפסולה באופן ידני באמצעות תוכנה אוטומציה. לנו למצוא את זה אחת מהשיטות מכתימים שני, פלורסנט תיוג של דופן התא, כמוסה, בעוד אורכת זמן רב, סיפק את התוצאות הכי עקבי בין ניסויים. עם זאת, שתי השיטות אפשרו לנו להבחין בהצלחה בין מעבדה קלינית neoformans ג זנים מפגין אחר קפסולת גדלים. יתר על כן, הצלחנו להפוך לאוטומטי את המדידה של קוטר קפסולה של הודו דיו צבעונית תמונות גיליתי שזו אלטרנטיבה מעשית מדידה ידנית של הקפסולה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Capsule Induction</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C. neoformans cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&#160; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>CL5335-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend XTR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">India ink</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-910-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcofluor white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2855-18</td>
			<td>#1.5 thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clear nail polish or other non-toxic sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Acquisition&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil</td>
			<td>Cargille&#160;</td>
			<td>16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope with immersion oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope with oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope software</td>
			<td>Zen 2009</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Widefield imaging software</td>
			<td>Nikon Elements (Nikon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capsule Measurement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image editing software</td>
			<td>Photoshop (Adobe)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software for manual measurement</td>
			<td>Axiovision (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis software for automated meesurement</td>
			<td>Aivia (DRVision Technologies)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet software</td>
			<td>Excel (Microsoft)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

הקפסולה רב-סוכר של קריפטוקוקוס neoformans היא הגורם העיקרי התקפה אלימה ולמד ביותר בדרך כלל ההיבטים של שמרים החולני הזה. גודל קפסולה יכולה להשתנות בין זנים, יש את היכולת לצמוח במהירות כאשר הציג בפני תנאים מזין מלחיץ או נמוך, יש כבר בקורלציה חיובית עם זן התקפה אלימה. מסיבות אלו, הגודל של הקפסולה הוא עניין רב לחוקרים neoformans ג . הצמיחה של הקפסולה ג neoformans הנגרמת במהלך הבדיקה פנוטיפי כדי לעזור להבין את ההשפעות של טיפולים שונים על שמרים או גודל ההבדלים בין זנים. כאן נתאר באחת השיטות סטנדרטי של קפסולה אינדוקציה והשווה שני המקובלים שיטות של צביעת ומדידת קוטר קפסולה: אינדיה אינק (i), כתם שלילי, בשימוש יחד עם מיקרוסקופ אור קונבנציונלי ו (ii) שיתוף מכתים עם צבעי פלורסנט הן של דופן התא והן את הקפסולה ואחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית. לבסוף, אנו מראים איך מדידה של קוטר קפסולה מדגימות שהוכתמו אינדיה אינק יכול להיות אוטומטי באמצעות ניתוח תמונות חישובית.

כדי להמחיש אינדוקציה קפסולה תא מכתים, הדמיה, טכניקות מדידה, היינו שלושה זנים של neoformans ג: המעבדה משותף, מאופיין היטב להתאמץ, H99S30ושני זני קלינית מבודדת בעבר קוטר קפסולה לא ידוע, B18 ולא B5231.
זרימת העבודה של אינדוקציה קפסולה, צביעת ייבוא תמונות באמצעות דיו הודו מוצג איור 1A. תמונות שנלקחו כל שלושה זנים מוצגים איור 1B והאיות שלאחר אינדוקציה. החוקר תדע אם אינדוקציה הקפסולה הייתה הצלחה על-ידי השוואת התאים שעברו אינדוקציה קפסולה לאלה מתרבות אותו לא. עלייה בגודל ברור הוא בדרך כלל ניכרת רוב זני שלאחר אינדוקציה, למרות כמה זנים תערוכת כמוסות קטנות באופן טבעי גם לאחר אינדוקציה (ראו תמונות של B18 ב איור 1B). יצוין, אינדוקציה קפסולה ייכשל אם שיורית מדיה עשירים לא מוסר לפני הגיוס או אם CO2 אינה קיימת. במקרים אלה, יתקיימו העלאות קפסולה גודל צנוע בלבד (אם בכלל). קטרים מכל שלושה זנים נמדדו באופן ידני, התוצאות מוצגות באיור איור 1C. בשני הניסויים שלוש, לא היה הבדל בגודל בין H99S לבין B18. עם זאת, הבדל משמעותי בגודל נצפתה באופן עקבי בין הזנים הגדולים, B52, ו H99S B18 (p < 0.001 ו- p < 0.001, בהתאמה, התאמת הריבועים רגיל לבדוק עם ניגודים פשוטה, גודל המדגם = 50 תאים/מתח ).
איור 2A מתארת את זרימת העבודה של אינדוקציה קפסולה, צביעת ייבוא תמונות באמצעות שני צבעי פלורסנט, אחד עבור הקפסולה (18B7-AF488) ואחד על קיר התא (Calcofluor לבן). תמונות נלכדו כמו z-ערימות עבור כל שלושה זנים שלאחר אינדוקציה, המבטיח כי הקוטר המרבי כמוסה וגוף התא נכבשה עבור כל תא ניתן למדוד (איור 2B). Z-מחסנית כל עובדה לייצר תחזיות העוצמה המקסימלית, דחיסת הערימה תלת-ממדי לתוך תמונה דו-ממדית לפני ניתוח (איור 2C). אלה אז נמדדו באופן ידני (איור דו-ממדי). בניגוד המדידות עבור הודו דיו צבעונית תאים, פלורסנט מכתים זמין לנו להפלות בין כל שלושה זנים על בסיס שלהם קוטר קפסולה בכל שלושת חוזר של הניסוי. הנה, מצאנו B18 שיש הקוטר הקטן ביותר קפסולה ואת B52 הגדול (p < 0.001 להשוואות כל, מבחן הריבועים הפחותים סטנדרטי עם אפקטים פשוטים, לטעום גודל = 50 תאים/זן).
להעריך עוד שתי שיטות של צביעת כמוסה neoformans ג , מידות כל שלושה זנים הושוו. היה הבדל משמעותי בין הגדלים הקפסולה באמצעות שתי שיטות של צביעת (איור 3A) (ANOVA כמנבאים עם אפקטים פשוטים, לטעום גודל = 50 תאים/זן). מסקנה זו היה בקנה אחד עם הממצאים של ניסוי נפרד שבו המתח מעבדה, H99S, היה מוכתם במשותף עם הודו דיו, צבעי פלורסנט (איור 3B-C). עם זאת, היתה השתנות גדולה יותר בין ניסויים באמצעות דיו הודו, כפי שמעידה העובדה כי רק אחד מכל שלושה ניסויים הראו הבדל משמעותי בגודל קפסולה בין H99S לבין B18, לעומת ההבדל המשמעותי שנצפו בין אלה זנים של כל 3 ניסויים פלורסנט (דמותתלת-ממד-E) (ANOVA כמנבאים עם אפקטים פשוטים, לטעום גודל = 50 תאים/זן).
הודו דיו צבעונית תמונות העונים על הקריטריונים המפורטים ב הפרוטוקול (סעיף 5) ניתן למדוד באמצעות מערכת אוטומטית. זרימת העבודה המוצגת באיור 4A מדריכים למשתמש דרך השלבים צורך לנצל את המתכונים נועד למדוד את הקפסולה ג neoformans . לאחר פיתוח זרימת העבודה, היא אומתה על ידי מדידת מצבור של תמונות קיימות של neoformans ג תאים על ידי שלושת החוקרים בשיטות ידניים ואוטומטיים. היו שם אין הבדלים משמעותיים בין המדידות של החוקר כאשר נעשה באופן ידני, כך גם היה כאשר המדידות נעשו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה האוטומטי (איור 4B) (ANOVA, גודל המדגם = 50 תאים/חוקר). עם זאת, היה קטן אבל הבדל משמעותי בגודל קפסולה דיווח בין שתי השיטות ANOVA (איור 4C), גודל המדגם = 150 תאים/קבוצה. קוטר קפסולה היה עקבי מעט קטן יותר. כאשר נמדד באמצעות אוטומציה מאשר מדידות ידניות (0.3 מיקרומטר, p < 0.001). בנוסף, כאשר משווים בין מדידות גודל קפסולה שנעשו על ידי חוקרים נפרד מן הצילומים תמונה זהה, השגיאה הסטנדרטית היה קטן יותר כאשר התמונה ניתוח תוכנה שימש על כימות במקום בשיטות ידניות, שזה מרמז יותר מדידות מדויקות, לשחזור באמצעות השיטה האוטומטית. למדידת מוצלחת אוטומטיות, תאים חייב להיות בפוקוס, מדיום כמוסה גדול ואני לא להגזים מקובצים באשכולות (איור 4D). מצאנו כי תמונות לקוי ממוקד של תאים באשכולות עם כמוסות קטנות לא ניתן באופן אוטומטי למדוד בתוכנה. עם זאת, אנו טוענים כי אלה עשויים גם להיות מאתגר כדי למדוד באופן מדויק תוך שימוש בשיטות ידניות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57171/57171fig1.jpg"> איור 1 : דיו הודו מכתים למדוד Neoformans ג הקפסולה. (א) ייצוג סכמטי של מדידה כמוסה neoformans ג על ידי צביעת אינדיה אינק. בקצרה, קפסולה ביטוי מושרה באמצעות מניעת מזון וחשיפה CO2, התאים נמצאים resuspended בדיו הודו, רכוב על מדרון זכוכית. תמונות של תאים מוכתם נרכשים על ידי מיקרוסקופ אור, עם שדות שאו שנבחר על ידי המשתמש או על ידי אריח-סריקה באמצעות שלב מחשב הנשלט. תמונות באפשרותך להיות מנותח באופן ידני או מעובד סגמנטציה אוטומטיות וניתוח. (B) תמונות של המתח מעבדה נפוץ, H99S, שני זנים קליני, B18 ולא B52, אינדוקציה והאיות שלאחר כמוסה. סולם העמודות מייצגות 10 מיקרומטר (ג) גרף של נציג התנסה בסה כ מציג קוטר קפסולה של כל שלושה זנים מוכתם אינדיה אינק ונמדד באופן ידני (שגיאה מיוצג כ שגיאה סטנדרטית (SE)). מובהקות סטטיסטית מציינים כדלקמן: *, p < 0.05; * *, p < 0.01; ו * * *, p < 0.001. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57171/57171fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57171/57171fig2.jpg"> איור 2 : צביעת פלורסנט למדוד Neoformans ג הקפסולה. (א) ייצוג סכמטי המדידה כמוסה neoformans ג Calcofluor לבן (CFW), 18B7-AF488 מכתים משותפת. לאחר אינדוקציה קפסולה, מכתים, התאים רכוב, עם תמונה על-ידי סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר. כמו תאים עשוי להיות במישורים מוקד שונים, z-במחסן נרכשים-לכל תפקיד. אלה מעובדים לייצר תחזיות העוצמה המקסימלית יכול לשמש כדי למדוד במדויק את הקוטר קפסולה המרבי עבור כל תא. (B) תמונות של המתח מעבדה נפוץ, H99S, שני זנים קליני, B18 ולא B52, פוסט-קפסולת השראה. הערה: גודל העמודות מייצגות 10 מיקרומטר לכל התמונות. (ג) מקסימום עוצמת תחזיות של fluorescently הנקרא neoformans ג תאים. (ד) גרף של ניסוי נציג מציג באופן ידני נמדד קוטר קפסולה של כל זני שלושה מוכתם CFW ו 18B7-AF488 (שגיאה מיוצג כ שגיאה סטנדרטית (SE)). מובהקות סטטיסטית מציינים כדלקמן: *, p < 0.05; * *, p < 0.01; ו * * *, p < 0.001. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57171/57171fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57171/57171fig3.jpg"> איור 3 : השוואה של תוצאות בין אינדיה אינק מכתים פלורסנט. (א) ניתוח של שלושה זנים neoformans ג צבעונית עם דיו הודו או צבעי פלורסנט, n = 3 (שגיאה מיוצג כ שגיאה סטנדרטית (SE)). (B) תמונות של יחיד neoformans ג תא צבעונית עם אינדיה אינק, שני צבעי פלורסנט (סולם בר מייצגת מיקרומטר 13). קווים אופקיים לגדור את הקצוות של הקפסולה, קווים אנכיים לגדור את הקצוות של גוף התא. (ג) כימות של ניסוי נציג של H99S מוכתם במשותף עם דיו הודו וגם צבעי פלורסנט (שגיאה מיוצג כ שגיאה סטנדרטית (SE)). (D, E) תיאור של קוטר קפסולה השתנות בין ניסויים אינדיה אינק (D) וניסויים פלורסנט (E). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57171/57171fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57171/57171fig4.jpg"> איור 4 : ניתוח חישובית של Neoformans ג קוטר קפסולה מתמונות של הודו דיו צבעונית תאים. (א) ייצוג סכמטי של סגמנטציה ומדידה הקפסולה ג neoformans באמצעות שיטת מדידה אוטומטיות (ראה טבלה של חומרים). השוואה (B) של קפסולה מדידות שבוצעו על-ידי חוקרי נפרדים 3 באמצעות ידני (ידני 1-3) בשיטות אוטומטיות (אוטומטית 1-3). כל חוקר בשימוש של מטמון זהה של תמונות neoformans ג בשתי השיטות (שגיאה מיוצג כ StDev). (ג) בשילוב ממוצע של מדידות ידניות ומדידות אוטומטיות (שגיאה מיוצג כ שגיאה סטנדרטית (SE)). דוגמאות הן האידיאל (D) ו- (E) לא אידאליות תמונות של neoformans ג. Non-אידיאלי תמונות לא ניתן למדוד בהצלחה בתוכנה. מובהקות סטטיסטית מציינים כדלקמן: *, p < 0.05; * *, p < 0.01; ו * * *, p < 0.001. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57171/57171fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

גודל ענייני: מדידה של הקפסולה בקוטר של neoformans קריפטוקוקוס

הקפסולה רב-סוכר הוא הגורם העיקרי התקפה אלימה , קריפטוקוקוס neoformans , גודלו בקורלציה עם זן התקפה אלימה. מידות קוטר קפסולה משמשים בבדיקות פנוטיפי וכדי להעריך את היעילות הטיפולית. כאן מוצגת שיטה סטנדרטית האינדוקציה קפסולה, שתי שיטות של צביעת ומדידת קוטר מושווים.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K Views.  Middle Tennessee State University. הקפסולה רב-סוכר הוא הגורם העיקרי התקפה אלימה , קריפטוקוקוס neoformans , גודלו בקורלציה עם זן התקפה אלימה. מידות קוטר קפסולה משמשים בבדיקות פנוטיפי וכדי להעריך את היעילות הטיפולית. כאן מוצגת שיטה סטנדרטית האינדוקציה קפסולה, שתי שיטות של צביעת ומדידת קוטר מושווים....

Video: Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

מדידה של Cytosolic Ca 2 + ב lymphatics כויץ מבודד

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

מדידה של זיהום γHV68 ב עכברים

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

מדידה של Allodynia משושים בדגם Murine של ערמונית קטריאלי

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

חזותי exocytosis ללא ממס של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em&gt; מהמקרופאגים שימוש דיגיטלי אור מיקרוסקופית

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות האינטגרציה של HIV-1 Preintegration מכלולים

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

מדידה אוטומטיות של Cryptococcal מינים רב-סוכר כמוסה וגוף התא

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...