Name: automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
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Vorremmo ringraziare Anthony Bowen cui vetrini sono stati utilizzati come un secondo confronto side-by-side umano così come Sabrina Nolan cui vetrini sono stati utilizzati come un terzo umano side-by-side e un secondo microscopio confronto.

1. preparazione dell'inchiostro di India Slide
<ol><li>Pipettare 10 µ l di campione criptococcico in una diapositiva. Qualsiasi ceppo di lievito circolare funzionerà, ma per questo esperimento H99 era l'unico sforzo utilizzato. Nota: Se il campione è direttamente da terreni di coltura, diluizione 1:2 con PBS o acqua può aiutare a prevenire l'inchiostro di India da aggregazione.</li>
	<li>Pipettare 2 µ l di macchia di inchiostro di India sul campione e miscelare fisicamente spingendo la punta della pipetta per il campione e lo spostamento in un movimento circolare fino a quando l'inchiostro di India appare uniformemente distribuita.</li>
	<li>Porre un coprivetrino sopra il campione tenendo premuto il bordo sinistro del coprivetrino contro la superficie della diapositiva, quindi delicatamente e uniformemente abbassando il lato opposto del coprivetrino sopra il campione.</li>
	<li>Asciugare all'aria per 5 min.</li>
	<li>Applicare delicatamente un leggero strato di smalto a bordo del vetrino coprioggetti per formare un sigillo e preservare la macchia di inchiostro di India.</li>
</ol>2. imaging diapositiva
<ol><li>Mettere i vetrini in un microscopio a campo luminoso con un accessorio della fotocamera e conversione pixel-per-micron noti. Regolare contrasto, obiettivi e filtri in modo che capsule di cella sono chiari e corpi cellulari sono concentrati, scuri bande. Nota: Vari filtri, gli obiettivi e le impostazioni di contrasto funzionerà ma un 20x obiettivo, Ph1 filtro e 2 x 2 binning è raccomandato.</li>
	<li>Assicurarsi che il campo visivo è denso ma non sovrappopolata con cellule criptococciche, con netto contrasto tra cella capsula e sfondo e correttamente focalizzato con il corpo della cella visualizzato come una banda scura. Nota: Il numero esatto delle cellule per un'immagine ottimale variano a seconda dell'obiettivo utilizzato e campione. Gli aspetti importanti sono affinché le cellule non sono in cluster o sovrapposti, che i piani focali delle cellule non variano significativamente, e che non vi è significativa dell'inchiostro di India macchia chiaramente visibile sullo sfondo (almeno il 25% del campo).</li>
	<li>Salvare le immagini in una singola directory con titoli chiari, come l'algoritmo di misurazione verrà eseguito su immagini in un'unica directory e i dati di output saranno organizzati in base ai nomi dei file immagine.</li>
</ol>3. algoritmo Setup
<ol><li>Installare la versione di Python 2.7 da</li>
	<li>Installare le librerie python aggiuntive eseguendo i comandi "pip installare cuscino" e "pip install openpyxl".</li>
	<li>Installare MATLAB seguendo le istruzioni riportate in</li>
	<li>Costruire la libreria python MATLAB seguendo le istruzioni fornite alle https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.</li>
	<li>Scaricare i tre file necessari inclusi in materiali di questo manoscritto supplementari ("QCA.py", "Analysis2.m" e "TestRun.m"). Nota: Questi file possono essere estratti in qualsiasi posizione, ma tutti e tre devono essere nella stessa directory.</li>
</ol>4. utilizzo dell'algoritmo
<ol><li>Eseguire l'applicazione facendo doppio clic su QCA.py. Nota: L'applicazione potrebbe richiedere alcuni minuti per iniziare. Il file "QCA.py" contiene la struttura del programma che chiama i file di "m" per eseguire l'algoritmo effettivo.</li>
	<li>Attenersi alla procedura descritta nel programma.<ol>
<li>Input del tipo di estensione dei file di immagine preceduta da un periodo e separati da punti e virgola (ex. ". TIF;. JPEG") quindi fare clic sul pulsante di invio .</li>
		<li>Scegliere la directory in cui si trovano i file di immagine facendo clic sul pulsante Seleziona cartella e selezionando la cartella che contiene le immagini.</li>
		<li>Generare l'elenco di file di immagine nella directory facendo clic sul pulsante Generate Image List . Le immagini saranno elencate nella casella di testo a destra. Esaminare e verificare che l'elenco è accurato e completo.</li>
		<li>Selezionare un'immagine casuale dall'elenco per utilizzare come anteprima facendo clic sul pulsante Seleziona immagine casuale . Nota: Se l'immagine è in grado di aprire a causa di un "errore di modalità immagine non corretta", l'algoritmo continuerà a funzionare correttamente nonostante non visualizzazione dell'immagine. Dopo passo 4.2.7, continuerà a visualizzare l'immagine di prova.</li>
		<li>Obiettivo del microscopio e binning impostazioni di input. Se le impostazioni predefinite non corrispondono il microscopio utilizzato, selezionare "Custom Pixel conversione" e la conversione pixel-per-um per i file di immagine di input. Una volta selezionato, fare clic sul pulsante di Conversione di calcolare e verificare che la conversione viene corretta secondo la casella di testo sulla destra. Nota: Immagini rappresentative, illustrate nella Figura 1 sono state calcolate con 40 x ingrandimento e 2 x 2 binning selezionato.</li>
		<li>Inserire i parametri dell'algoritmo per il rilevamento di cerchio.<ol>
<li>Il raggio minimo e massimo rilevabile per la rilevazione di capsula esterna come voci di Min e Max capsula Radius in ingresso. Una gamma più ridotta vi permetterà di ottenere risultati più accurati.</li>
			<li>Il raggio minimo e massimo rilevabile per il rilevamento del corpo cellulare come voci di Min e Max corpo cellulare Radius in ingresso. Nota: Tutti e quattro di queste voci deve essere numeri che rappresentano i rispettivi valori in pixel, secondo le immagini sorgente.</li>
			<li>Spostare i cursori di capsula e la sensibilità del corpo cellulare per regolare la soglia di sensibilità dell'algoritmo. Una bassa sensibilità sarà rigorosa e ridurre il rilevamento di falsi positivi cerchio, ma potrebbe anche rilevare meno reale cerchi. Al contrario, un'alta sensibilità aumenterà il tasso di rilevazione, ma può anche provocare falsi positivi cerchi. Nota: I risultati rappresentativi sono stati ottenuti con un raggio minimo capsula di 7, raggio massimo capsula di 45, raggio minimo corpo di 4, raggio massimo del corpo di 30, capsula sensibilità di 87 e sensibilità del corpo dell'87.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verificare i parametri dell'immagine selezionato casualmente facendo clic sul pulsante Esegui Test . I risultati verranno visualizzati in alto al centro del programma, sostituendo l'immagine originale. Se i risultati sono accurati, si consiglia di selezionare un'immagine casuale aggiuntiva per cercare anche di garantire che i parametri selezionati si adattano a tutte le immagini selezionate.<ol>
<li>Massimizzare il numero di corpi e capsule rilevati e controllare visivamente se i cerchi sembrano adattarsi correttamente. Il numero di corpi all'interno di capsule rilevati verrà visualizzato nella casella di testo a destra. In caso contrario, modificare i parametri dell'algoritmo fino a quando i risultati sono accurati. Nota: La spessa cerchi colorati sono solo per aiutare con visualizzazione. I cerchi effettivi generati per la misura è una curva matematica calcolata dall'algoritmo HCT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire l'algoritmo di rilevamento per l'intera directory dei file di immagine facendo clic sul pulsante Analisi di iniziare . Ogni immagine sarà analizzata e il programma visualizzerà "finito" nella casella di testo a destra quando tutte le immagini sono state analizzate.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante corrispondenza e pulitura . Questo abbinare corpi cellulari rilevati alle capsule rilevati in che risiedono e calcolare il vero raggio capsula sottraendo corpo dalla capsula. Nota: Se l'algoritmo viene utilizzato per rilevare la fluorescenza o un'altra situazione in cui un solo cerchio è rilevato questo passaggio è inutile. Invece di scegliere i Corpi solo tirare o il pulsante Solo tirare capsule per raccogliere i dati per solo il blu o solo i cerchi verdi, rispettivamente. È importante notare che se solo il capsula dati viene recuperati il raggio farà riferimento al raggio totale della cella come il raggio del corpo cellulare non potrebbe essere sottratta.</li>
		<li>Individuare i dati completati nel file "CleanedOuput.csv" nella directory delle immagini. Se solo un pezzo di dati è stato selezionato, il file sarà marcato "CleanedBodies.csv" o "CleanedCapsules.csv".</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

I punti critici di questa tecnica sono preparando la diapositiva di inchiostro di India e acquisendo le immagini del microscopio. Mentre l'algoritmo è stato testato con successo con una varietà di tecniche di diapositiva e immagine il protocollo raccomandato è descritto in questo manoscritto. Capsula del polisaccaride viene rilevata basato sull'esclusione delle particelle di inchiostro di India dal dominio della capsula come queste particelle sono troppo grandi per penetrare la rete di fibrille di polisaccaride. L'esc...

Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno trovato ubiquistmente intorno al globo che è associato con la malattia umana soprattutto in popolazioni immunosuppressed. C. neoformans in particolare rappresenta una causa significativa del totale dei decessi annuali nell'Africa subsahariana, a causa di malattie infettive1. La manifestazione clinica principale dell'infezione criptococcica è meningoencefalite, che segue l'invasione del sistema nervoso centrale con i mezzi in macrofagi infetti (Trojan horse maniera) o traversate dirette della barriera sangue - cervello. C. neoformans esprime numerosi fattori di virulenza, compresa la possibilità di replicare a temperatura del corpo umano, attività ureasica, melanizzazione e la formazione di una capsula del polisaccaride2. Capsula del polisaccaride è composto di ripetizione glucuronoxylomannan e polimeri glucoronoxylomannangalactan e funzioni come una barriera protettiva contro fattori come lo stress ambientale e host le risposte immunitarie2.
Sebbene la dimensione della dimensione della capsula del polisaccaride criptococcica non è sempre stata associata con virulenza, c'è prova che è un fattore nella patogenesi2,3,4,5, 6,7. Taglia capsula è associato con la meningite patologia6, possa influenzare la capacità dei macrofagi di controllare Cryptococcus infezione5e può provocare la perdita di virulenza se assenti8. Quindi, capsula dimensione misurazioni sono comuni nella ricerca criptococcica, ma non c'è nessun fieldwide standard per un metodo di misurazione capsula.
Attualmente, c. neoformans polisaccaride capsula misurazione si basa su misurazioni manuali di immagini di microscopia, e i metodi esatti delle acquisizioni di misura e di immagine variano attraverso laboratori9,10, 11. Un immediato interesse per questo metodo è che alcuni studi richiedono l'acquisizione di migliaia di misurazioni individuali, che rende difficile il mantenimento di accuratezza e affidabilità. Inoltre, anche quando i risultati sono pubblicati, c'è spesso insufficiente descrizione del metodo di misurazione. Molte pubblicazioni non spiegano come le loro misure sono state ottenute, che piano focale è stato utilizzato, come hanno determinato la soglia per l'identificazione di capsula, se hanno usato il raggio o il diametro, se hanno utilizzato una misurazione o una media diversi, o altri dettagli. Alcune pubblicazioni solo stato loro metodo come programma che è stato utilizzato, ad esempio, "Adobe Photoshop CS3 è stato usato per misurare le cellule"11. Questa mancanza di standardizzazione e reportistica di dettaglio può fare la riproducibilità difficile se non impossibile. Differenze di vista umana, luminosità computer, impostazioni di microscopio, far scorrere l'illuminazione e altri fattori possono variare non solo tra gli individui, ma anche tra i campioni, considerando che i calcoli basati su rapporti di valori di intensità di pixel rimarrà costanti e applicabile tra i campioni. Questa tecnica è stata generata nel contesto di fornire una tecnica standardizzata, precisa, rapida e semplice per misurare le dimensioni di capsule per un campo in cui non c'era nessuno prima.
Come accennato in precedenza, l'algoritmo CHT è consolidata e gli script per rilevare automaticamente i cerchi sono stati scritti prima. Questo metodo migliora nelle due aree dove altri script sarebbe caduta breve. In primo luogo, rilevare semplicemente cerchi non è sufficiente, perché con le cellule criptococciche due distinti cerchi devono essere rilevate in relazione reciproca. Questo metodo specificamente rileva corpi cellulari all'interno di capsule, discrimina tra i due ed esegue calcoli solo sulle coppie di corpo-capsula pertinenti. In secondo luogo, anche quando seguendo il protocollo stesso, diversi investigatori finirà con diversi acquisito immagini. Consentendo il controllo di investigatore sopra ogni parametro algorithm, questo strumento può essere regolato per soddisfare una vasta gamma di metodi di acquisizione. Non c'è nessuna necessità di un ambito standardizzato, obiettivo, filtro e così via.
Questa tecnica può essere applicata facilmente a qualsiasi situazione in cui lo sperimentatore deve rilevare cerchi all'interno di un'immagine che contrastano con il loro background. Entrambi i cerchi più leggeri e più scuri che può essere rilevato il loro background, contati e misurato utilizzando questa tecnica.

<table><tbody><tr><td>India Ink</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>261194</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td>25x75x1</td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-B</td><td>22x22-1</td></tr><tr><td>Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td><td>Sally Hansen</td><td>N/A</td><td>109 invisible</td></tr><tr><td>SAB Media</td><td>Sigma</td><td>S3306</td><td></td></tr><tr><td>Cryptotoccus neoformans</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td>H99 strain</td></tr><tr><td>Olympus AX70 Microscope</td><td>Olympus</td><td>AX70TRF</td><td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td></tr><tr><td>Qimaging Retiga 1300</td><td>Qimaging</td><td>N/A</td><td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Most recent version recommended</td></tr><tr><td>Python Programming Language</td><td>Python</td><td>N/A</td><td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Most recent version recommended</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr></tbody></table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

Lo scopo di questa tecnica è quello di fornire un processo coerenza, preciso e maneggevole per un gran numero di misure di capsula del polisaccaride.
In primo luogo, un'immagine di soglia viene generata in base ai valori di intensità in modo univoco calcolato per ogni immagine. Quindi, cerchi vengono rilevati basato sul contrasto tra oggetto e sfondo utilizzando l'algoritmo di trasformazione di Hough cerchio (CHT) ben consolidata. Infine, rilevato cellulare capsule e corpi sono abbinati secondo le coordinate del centro e la dimensione del raggio, e i dati vengono esportati per l'utente in un foglio di calcolo gestibile.
I vantaggi di questa tecnica sono semplici ma significativi. Primo, perché questi calcoli vengono eseguiti da un algoritmo piuttosto che un essere umano sia di precisione e di affidabilità sono aumentati. Non c'è nessun declino nella precisione o affidabilità indipendentemente da quanti campioni vengono analizzati. In secondo luogo, questo approccio costituisce una potenziale procedura operativa standard per il campo di Cryptococcus invece la situazione attuale, dove la capsula misura varia da laboratorio. In terzo luogo, dato che misure capsule manuali sono lento e monotono, l'automazione consente misure rapide su grandi numeri di cellule di lievito che a sua volta facilita l'elevato throughput dati analisi e statistiche sempre più potenti.
Le limitazioni principali di questa tecnica provengono da come le funzioni di algoritmo. In primo luogo, l'algoritmo genererà solo cerchi. Mentre le cellule Cryptococcus e loro capsule assumono una morfologia circolare, sarebbe difficile applicare questa tecnica al rilevamento di oggetti non circolare. In secondo luogo, a causa di come vengono rilevati cerchi l'algoritmo CHT può rilevare enormi pseudo-cerchi basati sui bordi esterni di parecchi cerchi in cluster. Tuttavia, eventuali corpi cellulari travisati catturati all'interno del pseudo-cerchio di possono essere facilmente rilevati e rimossi dal set di dati risultante.
Questa tecnica è destinata a misurare le capsule di polisaccaride circolare di Cryptococcus specie basato su microscopia del campo luminoso dell'inchiostro di India; anche se potrebbe essere applicato ad altri contrasto base misure oggetto circolare.

Immagini in primo luogo sono ottenute mediante microscopia di inchiostro di India diapositive utilizzando un microscopio a campo chiaro accoppiato con una macchina fotografica (Figura 1A). È importante avere cellule separate e nella densità sufficientemente bassa non per sopraffare il campo di vista, anche quanto a utilizzare abbastanza macchia per creare contrasto tra cellule e sfondo. Come indicato nel protocollo, il numero esatto delle c...

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Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Misurazione automatica delle criptococcica capsula polisaccaridica di specie e corpo cellulare

Questa tecnica viene descritto un processore di immagine automatica in batch progettato per misurare i raggi di corpo e capsula del polisaccaride. Mentre inizialmente progettato per misurazioni capsule Cryptococcus neoformans , che il processore di immagine automatizzato può essere applicato anche ad altri rilevamento del contrasto basato di oggetti circolari.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.3K Views.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. Questa tecnica viene descritto un processore di immagine automatica in batch progettato per misurare i raggi di corpo e capsula del polisaccaride. Mentre inizialmente progettato per misurazioni capsule Cryptococcus neoformans , che il processore di immagine automatizzato può essere applicato anche ad altri rilevamento del contrasto basato di oggetti circolari.

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Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

Separando i batteri di capsula quantità utilizzando un gradiente di densità discontinua

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Ricerca

Genetica

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

L&#39;uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Immunologia e infezioni

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within a cell, tissue, organ, biological fluid, or organism. Metabolomics traditionally focuses on water-soluble metabolites. The water-soluble metabolome is the final product of a complex cellular network that integrates various genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic, and environmental factors. Hence, the metabolomic analysis directly assesses the outcome of the action for all these factors in a plethora of biological processes within various organisms. One of these organisms is the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a unicellular eukaryote with the fully sequenced genome. Because S. cerevisiae is amenable to comprehensive molecular analyses, it is used as a model for dissecting mechanisms underlying many biological processes within the eukaryotic cell. A versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of the water-soluble metabolome would provide the essential methodology for dissecting these mechanisms. Here we present a protocol for the optimized conditions of metabolic activity quenching in and water-soluble metabolite extraction from S. cerevisiae cells. The protocol also describes the use of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of the extracted water-soluble metabolites. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics described here is versatile and robust. It enables the identification and quantification of more than 370 water-soluble metabolites with diverse structural, physical, and chemical properties, including different structural isomers and stereoisomeric forms of these metabolites. These metabolites include various energy carrier molecules, nucleotides, amino acids, monosaccharides, intermediates of glycolysis, and tricarboxylic cycle intermediates. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics is sensitive and allows the identification and quantitation of some water-soluble metabolites at concentrations as low as 0.05 pmol/&#181;L. The method has been successfully used for assessing water-soluble metabolomes of wild-type and mutant yeast cells cultured under different conditions.

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol for the identification and quantitation of major classes of water-soluble metabolites in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The described method is versatile, robust, and sensitive. It allows the separation of structural isomers and stereoisomeric forms of water-soluble metabolites from each other.

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Biochimica

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Bioingegneria

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly developing resistance to the first and the second line of antifungals. Cp is frequently isolated from hands and skin surfaces, as well as the GI tract. Colonization by Candida predisposes individuals to invasive bloodstream infections. To successfully colonize or invade the host, yeast must be able to rapidly adhere to the body surfaces to prevent elimination by host defense mechanisms. Here we describe a method to measure adhesion of Cp to immobilized proteins under physiologic fluid shear, using an end-point adhesion assay in a commercially available multichannel microfluidic device. This method is optimized to improve reproducibility, minimize subjectivity, and allow for the fluorescent quantification of individual isolates. We also demonstrate that some clinical isolates of Cp show increased adhesion when grown in conditions mimicking a mammalian host, whereas a frequently used lab strain, CDC317, is non-adhesive under fluid shear.

<meta charset="utf8"></head><body>Adesione della parapsilosi da Candida all'albumina sierica bovina sotto taglio fluido

Adhesion is an important first step in colonization and pathogenesis for Candida. Here, an in vitro assay is described to measure adhesion of C. parapsilosis isolates to immobilized proteins under fluid shear. A multichannel microfluidics device is used to compare multiple samples in parallel, followed by quantification using fluorescence imaging.

Adesione della parapsilosi da Candida all'albumina sierica bovina sotto taglio fluido

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo per la co-coltura di cianobatteri secernenti saccarosio con partner fungini

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being explored as a method for solar-driven bioproduction. One approach involves the use of CO2-fixing cyanobacteria that secrete organic carbon to support the metabolism of a co-cultivated heterotroph, which in turn transforms the carbon into higher-value goods or services. In this protocol, a technical description to assist the experimentalist in the establishment of a co-culture combining a sucrose-secreting cyanobacterial strain with a fungal partner(s), as represented by model yeast species, is provided. The protocol describes the key prerequisites for co-culture establishment: Defining the media composition, monitoring the growth characteristics of individual partners, and the analysis of mixed cultures with multiple species combined in the same growth vessel. Basic laboratory techniques for co-culture monitoring, including microscopy, cell counter, and single-cell flow cytometry, are summarized, and examples of nonproprietary software to use for data analysis of raw flow cytometry standard (FCS) files in line with FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) principles are provided. Finally, commentary on the bottlenecks and pitfalls frequently encountered when attempting to establish a co-culture with sugar-secreting cyanobacteria and a novel heterotrophic partner is included. This protocol provides a resource for researchers attempting to establish a new pair of co-cultured microbes that includes a cyanobacterium and a heterotrophic microbe.

<meta charset="utf8"></head><body>Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

This protocol provides a comprehensive guideline for the setup and quantitative monitoring of co-cultures, including photoautotrophic sugar-secreting cyanobacteria and heterotrophic yeasts.

Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Misurazione automatica delle criptococcica capsula polisaccaridica di specie e corpo cellulare

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Separando i batteri di capsula quantità utilizzando un gradiente di densità discontinua

L'uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

Adesione della parapsilosi da Candida all'albumina sierica bovina sotto taglio fluido

Adesione della parapsilosi da Candida all'albumina sierica bovina sotto taglio fluido

Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero

Assemblaggio e quantificazione di co-colture che combinano lieviti eterotrofi con cianobatteri fototrofi secernenti zucchero