אנו מודים מיכאל Lelek, Orestis Faklaris, ניקולס Bourg לדיון פורה, אנדריי Aristov, אלנה Rensen לעזרה עם טכניקה סופר רזולוציה, דני Seetharaman עבור קריאה זהירה של כתב היד. אנו להכיר בהכרת תודה UtechS BioImaging פוטוני (Imagopole) Citech של מכון פסטר (פריז, צרפת), כמו גם את רשת תשתית צרפת-BioImaging הנתמכים על ידי הסוכנות מחקר לאומי צרפתי (ANR-10-INSB-04; השקעות לעתיד), ולא את Région ile-de-(תוכנית Domaine d'Intérêt Majeur-Malinf) לשימוש של המיקרוסקופ Elyra. עבודה זו נתמכה על ידי הסרטן le ליגה חדר מרווח וחדיש, הסוכנות מחקר לאומי צרפתי (ANR-16-CE13-0019).

<ol>
	<li>Herrmann, H., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+Filaments:+Structure+and+Assembly.">Intermediate Filaments: Structure and Assembly.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (11), (2016).</li><li>Huber, F., Boire, A., Lopez, M. P., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+crosstalk:+when+three+different+personalities+team+up.">Cytoskeletal crosstalk: when three different personalities team up.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 39-47 (2015).</li><li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+filaments+in+cell+migration+and+invasion:+the+unusual+suspects.">Intermediate filaments in cell migration and invasion: the unusual suspects.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 102-112 (2015).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li><li>Gevaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nobel+Prize+in+Chemistry:+seeing+the+nanoscale.">Nobel Prize in Chemistry: seeing the nanoscale.</a> Nat Nanotechnol. 9 (11), 878 (2014).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Test+samples+for+optimizing+STORM+super-resolution+microscopy.">Test samples for optimizing STORM super-resolution microscopy.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li><li>Dempsey, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+user's+guide+to+localization-based+super-resolution+fluorescence+imaging.">A user's guide to localization-based super-resolution fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 561-592 (2013).</li><li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes.">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).</li><li>Chazeau, A., Katrukha, E. A., Hoogenraad, C. C., Kapitein, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+neuronal+microtubule+organization+and+microtubule-associated+proteins+using+single+molecule+localization+microscopy.">Studying neuronal microtubule organization and microtubule-associated proteins using single molecule localization microscopy.</a> Methods Cell Biol. 131, 127-149 (2016).</li><li>Olivier, N., Keller, D., Rajan, V. S., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+buffers+for+3D+STORM+microscopy.">Simple buffers for 3D STORM microscopy.</a> Biomed Opt Express. 4 (6), 885-899 (2013).</li><li>Eliasson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermediate+filament+protein+partnership+in+astrocytes.">Intermediate filament protein partnership in astrocytes.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).</li><li>Leduc, C., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microtubule-associated+motors+drives+intermediate+filament+network+polarization.">Regulation of microtubule-associated motors drives intermediate filament network polarization.</a> J Cell Biol. 216 (6), 1689-1703 (2017).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vimentin+Intermediate+Filaments+Template+Microtubule+Networks+to+Enhance+Persistence+in+Cell+Polarity+and+Directed+Migration.">Vimentin Intermediate Filaments Template Microtubule Networks to Enhance Persistence in Cell Polarity and Directed Migration.</a> Cell Syst. 3 (5), 500-501 (2016).</li><li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-Orientation:+Quantifying+Simultaneous+Co-Localization+and+Orientational+Alignment+of+Filaments+in+Light+Microscopy.">Co-Orientation: Quantifying Simultaneous Co-Localization and Orientational Alignment of Filaments in Light Microscopy.</a> PLoS One. 10 (7), e0131756 (2015).</li><li>Yang, Z., Wang, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein:+from+intermediate+filament+assembly+and+gliosis+to+neurobiomarker.">Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker.</a> Trends Neurosci. 38 (6), 364-374 (2015).</li><li>Maslehaty, H., Cordovi, S., Hefti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symptomatic+spinal+metastases+of+intracranial+glioblastoma:+clinical+characteristics+and+pathomechanism+relating+to+GFAP+expression.">Symptomatic spinal metastases of intracranial glioblastoma: clinical characteristics and pathomechanism relating to GFAP expression.</a> J Neurooncol. 101 (2), 329-333 (2011).</li><li>Hol, E. M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+and+the+astrocyte+intermediate+filament+system+in+diseases+of+the+central+nervous+system.">Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the astrocyte intermediate filament system in diseases of the central nervous system.</a> Curr Opin Cell Biol. 32, 121-130 (2015).</li><li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytoma+grade+IV+(glioblastoma+multiforme)+displays+3+subtypes+with+unique+expression+profiles+of+intermediate+filament+proteins.">Astrocytoma grade IV (glioblastoma multiforme) displays 3 subtypes with unique expression profiles of intermediate filament proteins.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2081-2088 (2013).</li><li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment.">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141 (6), 629-638 (2014).</li><li>Whelan, D. R., Bell, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy:+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters.">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5, 7924 (2015).</li><li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ThunderSTORM:+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging.">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li><li>Olivier, N., Keller, D., Gonczy, P., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+3D-STORM+imaging+through+improved+buffers.">Resolution doubling in 3D-STORM imaging through improved buffers.</a> PLoS One. 8 (7), e69004 (2013).</li><li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy.">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies.">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nat Commun. 6, 7933 (2015).</li><li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+image+resolution+in+optical+nanoscopy.">Measuring image resolution in optical nanoscopy.</a> Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).</li><li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT.">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

שלבים קריטיים בפרוטוקול
אנו מציגים כאן פרוטוקול אשר ממזערת חפצים של תמונות dSTORM של microtubules, IFs גלייה. חפצים יכולים להיווצר בכל צעד של הכנת הדוגמא, הדמיה: יציבות, חסימת, immunolabeling, להיסחף במהלך הרכישה, בלתי אופטימאליים מהבהב תנאים23. אנחנו ברשימה להלן השלבים ?...

Cytoplasmic ביניים (IFs) זיריהם nm 10-קוטר הומו - או heteropolymers של קבוצת תאים סוג משנה ספציפית של אם חלבונים. IFs להשתתף מגוון רחב של פונקציות הסלולר כגון תגובות תנועתיות, התפשטות, מתח התא. תפקידם מפתח מודגשת על ידי העובדה כי מחלות אנושיות יותר מ-90 נגרמות ישירות על ידי מוטציות בחלבונים אם; למשל, שינויים בהרכב אם מלווה בצמיחה הגידול והפצת1,2,3. שם גדל ראיות שלוש מערכות שלד התא לעבוד בשיתוף פעולה כדי הפונקציות הסלולר כגון תא קיטוב, מחלקת ההגירה2,3. מאז יש זוג חזק בין אדריכלות מרחבי פונקציות, זה הכרחי לקבל תובנות בארגון המבני של IF זיריהם אחרים ולהבין טוב יותר את cytoskeletal צולבות לדבר. מאמר זה מספק פרוטוקול לבצע את dSTORM כפול-צבע (ישיר סטוכסטי אופטי שחזור מיקרוסקופ) טכניקה רזולוציה סופר4 , איך זה משמש כדי לחקור את האינטראקציה בין אם ו microtubules, קבוע, תרבותי תאים ובדו מימד (2D).
פותחו מספר שיטות זיהוי סופר האחרונות בעשור התגליות שם היו על המקור של פרס נובל לכימיה בשנת 20145. בין כל שיטות אלה שקרים השיטות מבוססות על לוקליזציה מולקולה בודדת כמו פאלם6 (Photo-Activated לוקליזציה מיקרוסקופ) העושה שימוש photoswitchable פלורסנט חלבונים, סופה7 עם זוגות של fluorophores או dSTORM4 עם fluorophores קונבנציונלי. כל שיטות אלה מבוססות על אותו עיקרון אשר מורכב (i) הבורר של רוב הכתבים פלורסנט למצב "כבוי" "(הלא-פלורסנט), (ii) ההפעלה סטוכסטי של קבוצת משנה של אותם לתוך פלורסנט המדינה כדי להתאים לשפה שלהם מיקום מרחבי עם דיוק ננומטר, וכן (iii) החזרה על התהליך הזה על מנת להפעיל כמה שיותר קבוצות משנה של fluorophores ככל האפשר. תמונה סופית הוא שיחזר באמצעות כל הגרסא המקומית של מולקולות מופעל, מתן החלטה לרוחב ל ~ 20-40 ננומטר. מספר מערכות אופטיות ממוסחר ומאפשר דקל/סופה זמינים כעת עבור ביולוגים לניסויים שגרתית. . מערכת אחת כזאת שימשה ללמוד איגוד מבניים microtubules, IFs. בין כל מולקולה בודדת המבוסס על לוקליזציה השיטות, הטכניקה dSTORM כפול-צבע נבחר, כי זה גם מתאים להתבונן אזורים מחליפי דק מאוד (< 1 מיקרומטר) של תאים חסיד יכולה לספק שיפור משמעותי של רזולוציית תמונה השקעה מינימלית של זמן וכסף. אכן, dSTORM היא טכניקה צדדי ונוח מאוד תואם תקן צבעים אורגניים בשימוש שגרתי עבור צביעת סלולרית ו- immunofluorescence.
בעוד תמונות dSTORM צבע אחד הם פשוטים יחסית להשיג באמצעות fluorophore את, Alexa6478, dSTORM צבע כפול דורש כדי למטב את תנאי הניסוי כך שני צבעי יכולה למצמץ כראוי במאגר שבחרת, במיוחד כאשר יש מוגבלת עוצמת הלייזר. ניירות מעולה כבר זמינים על שיטות כדי להגדיר צבע רב הדמיה עם dSTORM9,10,11,12,13, הניירות האלה להסביר בפירוט את מקורות אפשריים רזולוציית תמונה מפורק והאיורים וכן כיצד להתגבר עליהם. מאמר זה, התנאים ניסיוני אופטימלית קיבוע תאים, immunostaining, הכנת הדוגמא, הדמיה רכישה ושחזור תמונות מתוארות על מנת לרכוש תמונות של רשתות צפופות אם cytoplasmic microtubules ב גלייה עם dSTORM צבע כפול. בקצרה, שיטת החילוץ/קיבוע המתוארים Chazeau ואח12 היה מותאם גלייה ומשמש בצעד קיבוע שאחרי, ריכוז נוגדנים ממוטבת, מאגר סערה עם 10 מ מ MEA שמתואר דמפסי9 ואח שהיה מצא אופטימלי כדי להפוך את ניסיוני להגדיר סוג הדגימה.
גלייה אקספרס בעיקר שלושה סוגים של חלבונים אם: vimentin, nestin ו- GFAP (חלבון fibrillary חומצי גליה). חלבונים אלה שלושה הראו להם במשותף פולימריזציה האסטרוציטים14. הראנו קודם לכן באמצעות רזולוציה סופר מובנה תאורה מיקרוסקופ (SR SIM) כי ניתן למצוא חלבונים אם שלושת אלה באותה נימה אם יחיד, כי הם מציגים את דומה הפצה ודינמיקה תאי גליה 15. בשל הדמיון בין החלבונים אם שלוש, vimentin מכתים שימש ככתב עבור הרשת אם כל. שימוש dSTORM, הצלחנו לפתור כמה צרורות אם טופס לאורך microtubules, דבר שלא היה אפשרי עם עקיפה מוגבלת מיקרוסקופ טכניקות15. תצפיות אלה עשוי לעזור כדי להבין איך vimentin IFs תבנית microtubules ולווסת את מסלול הצמיחה שלהם, לקידום שמירה על ציר קוטביות במהלך ההעברה תא16. תמונות ברזולוציה סופר סיפק מידע מפתח האינטראקציה הדדית של שתי תת-מערכות cytoskeletal, והביא תובנה הקישור בין האגודה מרחבי פונקציה מקומיים אשר יכול להיות הסלולרי-סוג ספציפי17. באופן כללי, ניתן להשתמש בצבעים dual dSTORM ללמוד crosstalk בין אלמנטים cytoskeletal או סוגים אחרים של organelles, ובלבד תנאים טובים immunostaining נגישים מבחינת צפיפות וספציפיות. טכניקה זו יהיה שימושי כדי לאפיין טוב יותר את השינויים שלד התא במהלך astrogliosis, ב גליובלסטומה, הגידול הנפוץ ביותר, ממאיר ביותר של מערכת העצבים המרכזית, איפה הביטוי של חלבונים אם שינו 18 ,19,20,21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Media (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41090-028</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non essential amino acid</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140-050</td>
			<td>cell culture 1/100e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>cell culture 1/100e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F&#339;tal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>cell culture 1/10e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,05 % Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td>11540486</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip 18 mm n&#176;1,5H</td>
			<td>Marienfield/Dominic dutsher</td>
			<td>900556</td>
			<td>coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde (PFA) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>non ionic surfactant. Used for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium borohydride (NaBH4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>452904-25ML</td>
			<td>cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>sample passivation 3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-Vimentin (V9) antibody produced in mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6630</td>
			<td>primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti alpha tubulin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>MCA77G</td>
			<td>primary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10635923</td>
			<td>secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10226162</td>
			<td>secondary antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamlide magnetic chamber</td>
			<td>Live Cell Instrument</td>
			<td>CM-B18-1</td>
			<td>magnetic sample holder, maximum volume 1,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cysteamine (MEA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30070</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>sigma</td>
			<td></td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9322</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (trizma)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>for the blinking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash-N-Dry&#160;coverslip rack</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z688568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonic cleaner</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-335-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging intermediate filaments and microtubules with 2-dimensional direct stochastic optical reconstruction microscopy

שלד התא, המורכב אקטין שמתרגם microtubules, חוטים ביניים (אם), ממלא תפקיד מרכזי בשליטה על צורת התא קוטביות, תנועתיות. הארגון של רשתות אקטין, microtubule נחקרה בהרחבה, אבל זה של IFs לא עדיין במלואו מאופיין. אם יש קוטר ממוצע של 10 ננומטר וטופס רשת חובק הציטופלסמה של התא. הם קשורים פיזית עם אקטין, microtubules דרך המנועים המולקולריים, cytoskeletal linkers. חזק זו בלב מנגנוני הרגולציה להבטיח ברגולציה מתואמת של שלוש הרשתות cytoskeletal הדרושים עבור רוב הפונקציות התא. לכן חשוב להמחיש IFs לבד וגם עם כל אחד cytoskeletal הרשתות האחרות. עם זאת, אם רשתות הן וצפופה רוב סוגי תאים, במיוחד בתאי גליה, מה שהופך את הרזולוציה שלה מאוד קשה להשיג עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית רגילה (לרוחב ברזולוציה של ~ 250 ננומטר). ישיר סטוכסטי אופטי שחזור מיקרוסקופ (dSTORM) היא טכניקה המאפשרת רווח רוחבי ברזולוציה של סדר גודל אחד. כאן, אנו מראים כי dSTORM הלטראלי הרזולוציה מספיקה לפתור הארגון צפופה של הרשתות אם ושל, בפרט, אם חבילות סביב microtubules. איגוד חזק כזה סביר להניח להשתתף בוויסות מתואמת של שתי רשתות אלה מאי, להסביר איך vimentin IFs תבנית לייצב את הארגון microtubule וכן יכולת להשפיע microtubule תלויים vesicular סחר. באופן כללי יותר, אנו מראים איך התצפית של שני רכיבים cytoskeletal בטכניקה בצבעים dual dSTORM מביאה תובנה חדשה שלהם אינטראקציה הדדית.

מיקרוסקופ מצויד עם 50 mW 405 ננומטר ו- 100 מגוואט 488, 561, 642 nm solid-state לייזרים, EMCCD 512 x 512 מצלמה, אלפא מתכננים Apo 100 X / 1.46 אובייקטיבית, הלהקה לעבור 570-650 / ארוך מסננים פליטה 655 שימשו את התוצאות נציג שיובאו להלן.
איור 1A נותן דוגמא של מולקולה ?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy at JoVE.com

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

הדמיה חוטים ביניים Microtubules עם מיקרוסקופ 2-ממדי ישירה שחזור אופטי סטוכסטי

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים קבוע

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

imaging-intermediate-filaments-microtubules-with-2-dimensional-direct

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  Institut Pasteur. המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לתת את התנאים ניסיוני אופטימלית של הכנת הדוגמא ייבוא תמונות ושיחזור על מנת לבצע צבע כפול 2D תמונות dSTORM של microtubules חוטים ביניים בתאים קבוע

Video: Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

טיפול ניקוי נאות של המיקרוסקופ

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

הרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ אור

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

הדמיה Exocytosis בתאים עם הפרעה דו רשתית מיקרוסקופית TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

הדמיה ישירה של סידן ER עם ממוקד esterase מושרה טעינת צבע (טד)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

הקפאה בלחץ גבוהה טנדם ומהיר הקפאת חילוף של צמח רקמות למיקרוסקופים אלקטרונים חודרים

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...