המחברים מבקשים להודות לטראוויס וילר ומכונת חנות במחלקה לביולוגיה של תא ופיזיולוגיה, אוניברסיטת פיטסבורג לבניית שלב מדגם cryo-הקרינה, Changlu טאו ונג שו באוניברסיטה למדע והטכנולוגיה של סין לטכנית סיוע, וד&quot;ר תרזה Brosenitsch לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות (GM082251 &amp; GM085043).

1. תרבות הלה סלולרי על פחמן מצופה, זהב רשתות Finder EM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרשות זוהרות פחמן בצד של R2-200 רשת / 2 Quantifoil זהב EM Finder רשת מתחת לגיל 25 אמפר עבור 25 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל רשת EM עם פיברונקטין, על ידי אותו צף, פחמן בצד למטה, על רביב μl 40 מ&quot;ל של תמיסת פיברונקטין 50 מיקרוגרם /, ואחר כך לחטא אותו תחת אור UV במשך שעה 2 במכסת מנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי הלה על גבי רשת בצפיפות של 2 x 10 4 תאים / מ&quot;ל (סה&quot;כ תרבות מ&quot;ל 2) בצלחת תרבות זכוכית תחתונה ולגדל את התאים על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, DMEM בתוספת 4.5 G / L L-גלוטמין וגלוקוז, 10% חום מומת עוברי עגל בסרום, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, וסטרפטומיצין מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​100, לכ -18 שעות. תאים הלה נגועים אחרי תרבות O / N. </li></ol> 2. הידבקות ב-HIV-1 ו-Live-תא הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף גשש תא ניאון (אדום CMTPX, μl / 2 1 מ&quot;ל) לתוך תרבות זכוכית התחתונהצלחת (משלב 1.3) ו דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, כדי לאפשר את קח של צבע פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS ולהוסיף 50 בינונית טרי מחומם מראש μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על החדר לחיות התאים, על 37 מעלות צלזיוס, של מיקרוסקופ סורק Confocal Swept שדה. לבחור שדות מרובים (10-15 עמדות) המכילים תאים / רבוע 1-3, עם התאים בין שני שלבי מיטוזה כאשר הם רוב ההתפשטות החוצה ושטוח (ראה איורים 2 ג ו 2d), שכן cryoEM דורש אזורים קטנים יחסית של מדגם. אחסן את העמדות הללו להדמית עתיד (שלב 2.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את התאים עם חלקיקי VSV-G פסאודו הוקלד HIV-1 המכילים GFP-VPR (אנו משתמשים 40 μl של מדגם המכיל 40 ng / ml של p24). כאשר מוסיפים את חלקיקי הנגיף לתחתית הצלחת, יש להיזהר שלא להפריע לרשת א&quot;מ, שכן העמדות להדמיה כבר נבחרו ומאוחסן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר תוספת של virions, לאסוף TIשלי לשגות תמונות במהירות גבוהה 3D confocal, בעמדות שנבחרו קודם לכן (משלב 2.3) דקות 20-40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות confocal נרכשו באמצעות MetaMorph ונותחו על ידי מעקב אחר חלקיקי 3D אוטומטי לדינמיקת חלקיק יחידה באמצעות תוכנת Imaris (ראה איור 1). מכיוון שאנו נמצאים correlating ההתנהגות הדינמית של השתברות מוגבלת HIV-1 חלקיקים בעלי ultrastructure סלולרי, לחיות תאי הדמיה זמן לשגות ומעקב אחר חלקיקי 3D הם קריטיים לתוצאות. עם זאת, למבנה גדול וסטטית, תמונת הקרינה פשוט (בלי לחיות תאים) תהיה מספיק לניתוח גומל. </li></ol> 3. לדוגמא הכנת EM קפוא התייבשות כדי למזער את השהות בין האוסף של תמונת confocal האחרונה וcryo-הקיבעון של המדגם, Vitrobot פיי (או מכשיר vitrification אחר) צריך להיות יזם ומוכן לצעד-הקפאה באוסף של תמונות לחיות תאי confocal הקרינה.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התקן vitrification ולהגדיר טמפרטורת האקלים שלה ל -22 מעלות צלזיוס, לחות היעד ל -100%, בפעם סופג עד 7 שניות, ואת ההמתנה ולנקז עת לשנייה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תיבת האחסון ברשת דיואר הבוכנה ולהכין אתאן נוזל קר. הר דיואר על גבי מכשיר vitrification. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר לחיות תאי ההדמיה confocal (סעיף 2), מניח את צלחת התרבות על בלוק קרח נחושת מקורר ולהעביר אותו לחדר הכנת מדגם cryoEM. טען את רשת EM על גבי פינצטה מיוחדת ולמחוק במהירות את כל סוגי המדיה ברשת. סופג מתבצע באופן ידני, עם נייר סינון, שלאחריו 4 μl של פתרון חרוז זהב 15 ננומטר מעורבב עם 0.2 מיקרומטר microspheres ניאון ממוקמת מייד ברשת. את חרוזי הזהב משמשים כסמני fiducial לסייע אוסף טומוגרפית נתונים ויישור. Microspheres הניאון משמשות סיוע מתאם בין תמונות ניאון וcryoEM (ראה איורים 2 ג-2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את פינצטה על מכשיר vitrification ולהורות למכשיר למחוק ולצלול בהקפאת אתאן הנוזלי 16. הפרמטרים הסופגים המותאמים להשגת התוצאה הטובה ביותר הם: זמן כתם, 7 שניות; כתם אופסט, 0; זמן ניקוז, 1 שניות; טמפרטורה, 22 מעלות צלזיוס, ולחות, 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרשת קפוא התייבשות לבעל cryoEM הדמיה cryoET מיידית, או לאחסון חנקן נוזלי דיואר לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 4. מיקרוסקופ אור Cryo-הקרינה מערכת קאמרית בית בנוי, cryo-הקרינה מדגם ובמה (איור 3) נדרשה לבצע צעדים 4.1-4.10. התוכניות המפורטות והתיאור של השלב ניתן למצוא ביוני et al. -15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא חנקן נוזלי דיואר עצמי דחוס עם חנקן נוזלי לפחות 2 שעות לפני תחילת מיקרוסקופ אור cryo-הקרינה (ראה איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר cryo-F homebuiltשלב luorescence מדגם 15 (איור 3) על גבי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי הפוכה, כגון אולימפוס IX 71. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את כניסת החנקן הנוזלית של שלב cryo-המדגם לדיואר עצמי הדחוס ולמקם את שקע הגנת הצפת החנקן הנוזלי לתוך המכל מתאים. חבר קו גז חנקן יבש לשרוול ממוקם מעל עדשת המטרה לשמור על העדשה חמה וחופשי של כפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פלטפורמת גוש נחושת (חץ שחור באיור 3) לתוך תא cryo-השלב לטעינת רשת המדגם קפוא התייבשות. להתקרר ולמלא את התא של נחושת cryo-הבמה עם חנקן נוזלי דרך קו היניקה מדיואר המילוי עצמי בלחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר cryo-השלב מגיע לטמפרטורת חנקן נוזלית (ב~ 4-6 דקות), להעביר את קופסא אחסון הרשת (משלב 3.5) לcryo-הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רשת המדגם קפוא התייבשות לתוך מחסנית דגימת EM ברחוב הנחושת וקליפ גרםלהיפטר במקום באמצעות C-טבעת (אם שימוש במחסנית מיקרוסקופ Polara), או למקם את טבעת נחושת מראש מקוררת על גבי (ראש החץ שחור באיור 3D), כדי לשמור את הרשת במקום וגם לאחזור קל של הרשת לאחר הדמיה cryo-הקרינה (אם למיקרוסקופ אלקטרונים cryo-הלא Polara). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המחסנית (משלב 4.6) בחדר הפנימי של cryo-השלב (לבן ראש החץ באיור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחפש ולמצוא את אותם חלקיקי וירוס מנתוני ההדמיה לחיות התאים. מאז רשת EM יש אינדקס, זה פשוט למקם אותו החלקיק על הרשת בשתי תמונות לחיות תאים ותמונות cryo-תפרחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות GFP cryo-DIC ובעמדות המזוהות תחת cryo-תנאי השימוש במיקרוסקופ אור עם עדשת מטרת עבודה ארוכה (2.7-4 מ&quot;מ). במהלך ההדמיה cryo-הקרינה, מעת לעת לבדוק את רמת החנקן הנוזלית בcryo-הבמה ולמלא אותו, לפי צורך, כדי לשמור על הבמה המדגם מתחת -170° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת ההדמיה cryo-הקרינה, יחזור בזהירות את מחסנית הדגימה לפלטפורמת בלוק הנחושת ולאחסן את המחסנית בחנקן נוזלי דיואר לניתוח cryoET עתיד עם מערכת Polara. אם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים cryo-הלא Polara, להסיר את טבעת הנחושת, לאחזר את רשת המדגם, למקם אותו בתיבת אחסון רשת, ולאחסן את הדגימה בחנקן נוזלי עד דיואר הדגימה נבדקה על ידי cryoET. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח נתונים, חופף את תמונות cryo-DIC וGFP הנרכשים (מצעד 4.9, ראה איור 4) ולתאם את עמדותיהם של אותות ה-GFP בתמונת cryo-הקרינה עם אלה שהושגו בסדרה לחיות תאי ההדמיה. </li></ol> 5. Cryo-טומוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מחסנית המדגם לתחנת cryo-העברת מיקרוסקופ אלקטרונים מצוידים באקדח פליטת שדה, כגון מיקרוסקופ G2 Polara. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצב במינון נמוך, חיפוש בהגדלה של 140X, IDEntify ולשמור את ריבועי הרשת הכלולות שלה (מצעד 4.11) לקובץ במה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מצב במינון נמוך, חיפוש בהגדלה של 3500 X, להוסיף 100 מיקרומטר אובייקטיבי צמצם, חיפוש ולשמור את כל העמדות המתואמות עם אותות GFP לתוך קובץ שלב שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מצב במינון נמוכה, חשיפה, מוצא את אזור ריק כדי להתאים את עוצמת קרן למינון של דואר 1 או 2 - / a 2 ולחדד את ציר ההטיה, באמצעות פונקצית y הבמה, על ידי שריפה משם הקרח באזור פחם לא חשוב עם כמה חרוזי זהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מצב במינון נמוך, פוקוס, להתאים את מרחק המוקד ל~ 3 מיקרומטר ולהתאים את הזווית כדי ליישר את הכיוון של התמקדות להיות מקביל לציר ההטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מצב במינון נמוך, חיפוש, זוכרים עמדות נשמרו (משלב 5.3), להתאים את גובה eucentric דגימה ולבדוק את טווח ההטיה לאזור של עניין. לרכוש תמונת הקרנה עם אלקטרונים במינון נמוך מאוד (1 ~ דואר - / a 2) בשעה 8 עד 10 מיקרומטר defocus, בexposמצב יור, כדי לאשר את חלקיקי נגיף בקורלציה לטומוגרפיה קריו אלקטרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למצב במינון נמוך, פוקוס. בתפריט פונקציות אוטומטי TEM, להקדים את גובה eucentric האוטומטי ולהתמקד בפונקציות את אזור המיקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את הפרמטרים לרכישה להטות-Series. לאיור 4 במאמר זה, זוויות הטיה החל ± 70 מעלות, מתחת ומעל 45 מעלות, בגיל 3 ו -2 ° ° מרווחי הטיה, בהתאמה, היו בשימוש, עם 6 מיקרומטר defocus וכ 70 דואר - מינון כולל של 2 /. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.7 ו -5.8 לכל העמדות שנשמרו. תוכנת טומוגרפיה אצווה יכולה לשמש לאיסוף נתונים אוטומטי במספר עמדות כדי להגדיל את התפוקה. </li></ol> 6. שחזור תלת ממדי באמצעות IMOD 17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הסדרה להטות הגולמית כדי להתאים את ערכי צפיפות המינימום ומקסימום ולקבוע אם יש כל תצוגה שלא להיכלל בשל שינוי תמונה גדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל eTomo ופנל tomogram התקנת שימוש בסוג ציר, גודל פיקסל, קוטר fiducial, וכו &#39;. לאחר מכן ליצור תסריטי com. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את החלון הראשי כך שיכולים להיות מותאמים בכמה שלבים של חישוב tomogram / אחריו בו זמנית. שנה את הפרמטרים הדרושים ולבצע את התוכניות הספציפיות הנדרשות על ידי כל צעד בתהליך (ראה שיעור eTomo, <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הסופי, ליצור ערימה מיושרת מלאה (עם שגיאת שיורי ממוצע פחות מ 0.6) ולשחזר tomograms באמצעות אלגוריתם בחזרה הקרנה משוקלל בIMOD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Denoise אזורים פוטנציאליים של עניין באמצעות תכנית 3D קוי אניסוטרופי דיפוזיה קצה שיפור מיושמת בIMOD עם פרמטרים מתאימים כדי לשפר את החדות והבהירות. </li></ol>

<ol>
	<li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cells+at+the+nanoscale.">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li><li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry.">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells.">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).</li><li>Arhel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+four-dimensional+tracking+of+cytoplasmic+and+nuclear+HIV-1+complexes.">Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes.</a> Nature Methods. 3, 817-824 (2006).</li><li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages.">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Koch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+fusion+of+pseudotyped+HIV-1+particles+in+real+time+by+live+cell+microscopy.">Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy.</a> Retrovirology. 6, 84 (2009).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr.">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li><li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography.">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li><li>Sartori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy:+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).</li><li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching.">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li><li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells.">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).</li><li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells.">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li><li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography.">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li><li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors.">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li><li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy.">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li><li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy.">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

יש לנו הצגנו סדרה פשוטה של ​​פרוטוקולים כדי לספק גישה גומלת מתקדמת כדי לנתח את האירועים הסלולר דינמיים באמצעות זמן לשגות הדמיה confocal, לחיות תאי הקרינה ואחרי cryoET. ההתפתחות המתודולוגית שלנו כדי לתאם לחיות תאי ההדמיה 3D עם cryoET ברזולוציה גבוהה היא קריטית כדי לחקור בעיות ?...

Cryo-אלקטרון טומוגרפיה (cryoET) היא טכניקת הדמיה רב עוצמה המאפשרת הדמיה (3D) תלת ממדית של תאים ורקמות ומספקת תובנות לארגון של האברונים ילידים ומבנים הסלולר ברזולוציה מולקולרית למצב פיסיולוגי קרוב 1. עם זאת, בניגוד מיסוד הנמוך של דגימה קפוא התייבשות בלא כתם, בשילוב עם הרגישות לקרינה שלהם, הופך אותו לקשה לאתר תחומי העניין בתוך תא, ולאחר מכן ביצוע סדרת ההטיה בהצלחה מבלי לפגוע באזור היעד. על מנת להתגבר על בעיות אלה, גישה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופ אור ואלקטרונים היא הכרחית. תכונות ספציפיות מודגשות על ידי ניאון תיוג מזוהים וממוקמות על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי, ולאחר מכן את הקואורדינטות שלהן מועברות למיקרוסקופ האלקטרונים לרכישת נתונים 3D מבניים ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מסייעת גומלת איתור היעדreas של עניין לטפל. בשל הגבלה על עובי מדגם עם cryoEM (&lt;300 ננומטר), כיום רק את אזורי הפריפריה של התא מתאימים לניתוח מבנים על ידי 3D CryoET. בהמשך הפחתת העובי של דגימות קפוא hydrated על ידי זגוגית חתך 8 או על ידי cryo-אלומת יונים ממוקד (FIB) טחינה 9 הייתי להרחיב את היכולת של הדמיה גומלת. בעבר, שיטות גומלות היו בשימוש בעיקר כדי להקל על רכישת cryoET נתונים למבנים גדולים וסטטי 10-13. במחקרים אלה, cryo-שלבים יושמו לקבל רשתות cryoEM ולהתאים אותו גם מיקרוסקופ זקוף או מיקרוסקופ הפוכה 10,11,14. למרות מיתוג רשתות נראה פשוט למדי בעיצובים שלהם, יש העברה נוספת מעורבים לרשת EM צעדים, מגדיל את הסיכוי שהרשת עשויה להיות מעוות, פגומות ומזוהמת. לאחרונה הפגינו התקדמות טכנית במיקרוסקופיה המצטרפת שמאפשרת לנו לדמיין באופן ישיר אירועים דינמיים במהותם קשה לתפוס, כגון אינטראקציות תא מארחות HIV-1 ובשלבים מוקדמים של זיהום 15. אנחנו עשינו זאת על ידי תכנון ויישום שלב מדגם מיקרוסקופיה קריו אור שמתאים את עצמו מערכת מחסנית כדי למזער את נזק הדגימה עקב טיפול רשת, ובכך להקל מתאם. העיצוב שלנו כולל בעל מחסנית דגימה משולב, המאפשר גם מיקרוסקופיה קריו האור ואלקטרוני cryo-להתבצע, ברצף, באותו בעל דגימה, ללא העברת דגימה, ובכך לייעל את תהליך ההיווצרות. בנוסף, אנחנו גם יישמנו הליך התאמה מדויקת ואמין באמצעות חרוזים לטקס ניאון כסמני fiducial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine</td>
			<td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>HeLa cell culture on EM grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell tracker</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>C34552</td>
			<td>Red CMTPX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A gold conjugates</td>
			<td>Ted Pella, Inc., Redding, CA</td>
			<td>15822-1</td>
			<td>15 nm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &mu;m fluorescent microspheres</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>F8811</td>
			<td>Yellow-green fluorescent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal calf bovine serum</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>10082-139</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold quantifoil finder EM grids</td>
			<td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany</td>
			<td>R2/2 Au NH2 200 mesh</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td>
			<td>70011-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow-discharge device 100X</td>
			<td>EMS, Hatfield, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>300 keV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitrobot Mark III</td>
			<td>FEI, Hillsboro, OR</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX 71 microscope</td>
			<td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TiE microscope</td>
			<td>Nikon Instruments, Melville, NY</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sweptfield confocal microscope</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokai Hit live cell chamber</td>
			<td>Tokyo, Japan</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-fluorescence sample stage</td>
			<td>Home-made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative microscopy for 3d structural analysis of dynamic interactions

Cryo-אלקטרון טומוגרפיה (cryoET) מאפשרת הדמיה 3D של מבנים הסלולר ברזולוציה מולקולרית במצב קרוב לפיסיולוגי 1. עם זאת, להדמיה ישירה של מתחמים נגיפיים בודדים בסביבה התאית שלהם עם מארח cryoET מאתגרת 2, בשל האופי נדיר ודינמי של כניסת ויראלי, במיוחד במקרה של HIV-1. בעוד לחיות תאי הדמיה זמן לשגות הניבה מידע רב על היבטים רבים של המחזור של 3-7 HIV-1 החיים, המוענקת על ידי מיקרוסקופיה ברזולוציה לחיות תאים הוא מוגבל (~ 200 ננומטר). העבודה שלנו הייתה במטרה לפתח שיטת מתאם המאפשרת הדמיה ישירה של אירועים המוקדמים של HIV-1 זיהום על ידי שילוב של מיקרוסקופ אור ניאון לחיות תאים, מיקרוסקופיה קריו פלורסנט, וcryoET. באופן זה, ניתן להשתמש באותות בתאים חיים וcryo-ניאון כדי להנחות את הדגימה בcryoET במדויק. יתר על כן, מידע מבני מתקבל מcryoET יכול בהדואר השלים עם הנתונים הפונקציונליים הדינמיים שנרכש דרך לחיות תאי הדמיה של היעד מסומן ניאון. במאמר זה וידאו, אנו מספקים שיטות ופרוטוקולים מפורטות לחקירה מבנית של HIV-1 ואינטראקציות מארח תאים באמצעות הדמיה 3D גומלת במהירות גבוהה תאי חיים וניתוח מבני ברזולוציה גבוהה cryoET. תאים הלה נגועים בחלקיקי HIV-1 אופיינו לראשונה על ידי מיקרוסקופיה confocal לחיות תאים, ובאזור המכיל אותו החלקיק הנגיפי נותח ולאחר מכן על ידי טומוגרפיה קריו אלקטרון לפרטים מבניים 3D. המתאם בין שני סטים של נתוני הדמיה, דימות אופטי ואלקטרוני הדמיה, הושג באמצעות שלב מיקרוסקופ אור cryo-הקרינה בבנייה עצמית. הגישה המפורטת כאן תהיה בעל ערך, לא רק למחקר של אינטראקציות תא מארח, וירוס, אלא גם עבור יישומים רחבים יותר בביולוגיה של תא, כגון, סחר בקולט קרום תא איתות, ועוד רבים תהליכים תאיים דינמיים אחרים. &lt;/ P&gt;

כדי לאפיין את ההתנהגות הדינמית של חלקיקי הנגיף, תאי הלה עם HIV-1 היו צילמו על ידי מיקרוסקופ לחיות תאי confocal במהירות גבוהה ותנועות החלקיקים נותחו על ידי מעקב אחר חלקיקי 3D אוטומטי (איור 1). כדי להימנע מהפער הזמנים של כמה דקות שיכולים להתרחש בין אוסף של התמונה לחיות ...

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions at JoVE.com

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.

מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

correlative-microscopy-for-3d-structural-analysis-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.9K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.

Video: Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

לומד את ההרכב של עוריות Growth Factor Receptor בתאים השלמים באמצעות מתאם מיקרוסקופית

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

הכנת ג&#39;לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D<em&gt; In vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

מיקרוסקופי אלקטרונים בהירי-עור גומל באמצעות חלקיקי נקודה קוונטית

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

בניית גיליון מרובה שכבות תאי גזע Mesenchymal עם מערכת תרבות דינמית תלת-ממד

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

אנליזה סביבתית של מכני דינמי כדי לחזות את ההתנהגות ריכוך של השתלת עצבים

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

זן מבוקר של הידרוג'ל תלת מימדי תחת הדמיה מיקרוסקופית חיה

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...