מריה באומגרטן (IQ ביוטכנולוגיה פלטפורמה, זיהום ברפואה, אוניברסיטת לונד) הוא הודה עבור ביצוע ואספקת סריקה micrographs אלקטרון. עבודה זו נתמך על ידי מענקים שוודית המחקר המועצה Formas (2017-00100) במסגרת האירופית השלישית משותפת תכנות היוזמה בשיחה ההתנגדות מיקרוביאלית (JPIAMR) "דינמיקה שידור". התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, פרשנות, כתיבה, הכנה של כתב היד, ההחלטה להגיש, או ההחלטה לפרסם את עבודותיהם.

1. שינוי של זכוכית שער גולשת (תבנית בולים)
<ol><li>כדי לנקות את פתקי כיסוי זכוכית, לטבול אותם ברצף 10 מ"ל של 1.0 M HCl, מים יונים ו- 1.0 M של NaOH, בהתאמה, 10 דקות בכל שלב בניקוי אולטראסוני בטמפרטורת החדר.<ol>
<li>יבש את פתקי כיסוי זכוכית עם גז חנקן. הערה: שער גולשת עוברות ייבוש על ידי אידוי תחת זרם של חנקן גזי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטבול את פתקי כיסוי מיובשים והשלמת ב 10% (v/v), 10 מ ל תמיסת 3-אמינו-propyl-triethoxysilane (APTES) אתנול עבור h 1 כדי להציג את קבוצות אמינו על פני השטח כיסוי זכוכית, בטמפרטורת החדר.<ol>
<li>יש לשטוף את שער גולשת עם מים יונים.</li>
		<li>יבש את שער גולשת עם גז חנקן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטבול את פתקי כיסוי APTES-השתנה ב- 5% (v/v), 10 מ ל תמיסת גלוטראלדהיד במאגר פוספט 10 מ מ (pH 7.4) כבר שעתיים על מנת להפעיל את הקבוצות אמינו על פני השטח,6,בטמפרטורת החדר15.<ol>
<li>יש לשטוף את שער גולשת עם מאגר פוספט 10 מ מ (pH 7.4) כדי להסיר את עודפי גלוטראלדהיד מפני השטח.</li>
		<li>יבש את שער גולשת עם גז חנקן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין 1.0 מ"ל של תבנית (חלבון/bacteriophage) פתרון במאגר פוספט 10 מ מ (pH 7.4) בריכוז 0.1 מ"ג/מ"ל. הערה: להמיס 0.1 מ"ג חלבון ב- 1.0 מ"ל של מאגר פוספט (10 מ מ, pH 7.4). אם יש צורך, ספקטרופוטומטרים (280 ננומטר) יכול לשמש כדי לקבוע ריכוז חלבון.<ol>
<li>ירידה µL 200 של פתרון זה תבנית על גבי פתקי כיסוי שונה, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: הפתרון תבנית עודף יכול לשמש כדי להכין חותמות תבנית יותר 1-2 כדי לשמש ללימודי אפיון.</li>
		<li>יש לשטוף את שער גולשת עם מאגר פוספט 10 מ מ (pH 7.4) כדי להסיר את התבנית לא מאוגד מפני השטח. הערה: כדי לשטוף את האלקטרודות, לשטוף אותם עם מאגר פוספט (10 מ מ, pH 7.4) ב-30 s.</li>
		<li>יבש את שער גולשת עם גז חנקן. הערה: שער גולשת לאחסן ב 4 ° C עד שהם משמשים שלב הפילמור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. שינוי של אלקטרודות זהב קיבולי
<ol><li>כדי לנקות את האלקטרודות, לטבול האלקטרודות בגביע, קטן באופן רציף, המכיל 5 מ של אתנול (70%), יונים מים אצטון, יונים, פתרון פיראניה חומצי (H 3:1,2וכו4:2O H2, וי/v), ויונים מים, בהתאמה במשך 10 דקות בכל שלב, בניקוי אולטראסוני בטמפרטורת החדר.<ol>
<li>יבש האלקטרודות עם גז חנקן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>על מנת לבצע את electropolymerization של tyramine, הכן 8 מ של פתרון tyramine 10 מ 10 מ מ פוספט מאגר (pH 7.4) המכיל אתנול (2 מ"ל)15. הערה: הנפח הכולל של הפתרון tyramine חייב להיות 8 מל בסך הכל כולל 2 מ"ל אתנול.<ol>
<li>לבצע סריקות voltammetric מחזורית (15 מחזורים) בפתרון זה באמצעות potentiostat של כיסוי פוטנציאלי בטווח של 0 - 1.5 V (Ag/AgCl) ושיעור סריקה של mV/s 5030.</li>
		<li>לשטוף עם מים יונים האלקטרודות.</li>
		<li>יבש האלקטרודות עם גז חנקן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטבול את האלקטרודות בתמיסה המכילה 30 מ מ acryloyl כלוריד, trimethylamine 30 מ מ בטולואן (Vסה כ = 5 מ"ל) בטמפרטורת החדר למשך הלילה6,15,30.<ol>
<li>לשטוף עם מים יונים האלקטרודות. הערה: כדי להבטיח הסרה טוב יותר של unreacted acryloyl כלוריד, trimethylamine שאריות, זה גם אפשרי לשטוף את השטח עם NaOH לאחר מים יונים.</li>
		<li>יבש האלקטרודות עם גז חנקן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנת תבנית טבוע קיבולי אלקטרודות זהב
<ol><li>
הכנת bacteriophage טבוע קיבולי אלקטרודות זהב
	<ol>
<li>לפני הפילמור, להכין פתרון מונומר המכילה מונומר (N-hydroxymethyl אקרילאמיד) ו מחדש (פוליאתילן גליקול-400-dimethacrylate) על יחס של 1:5 (מול/mol) ב 1 מ"ל של 10 מ מ פוספט מאגר (pH 7.4). הערה: הפתרון מונומר מכיל מונומר מחדש ניתן להשתמש ביחס שונה, או הסוגים של מונומר, מחדש יכול להשתנות על פי התבנית עבור אופטימיזציה של אינטראקציה מסוימת.</li>
		<li>להוסיף 1 מ ג של צילום-יוזם לתוך פתרון זה. הערה: אם הפילמור מבוצע תחת אור UV, לשמש לאחר מכן היוזם צילום חייב ליזום את הפילמור. אם הפילמור מתבצע על ידי רדיקלים חופשיים פלמור, יש לשנות את הסוג של היוזם.</li>
		<li>פיפטה 1.5 µL של פתרון זה על פני האלקטרודה ששונה זהב זהב. הערה: משטח זהב של האלקטרודה מוצג סכמטי באיור1.</li>
		<li>להביא את החותמת תבנית בקשר עם הפתרון מונומר על פני האלקטרודה זהב.</li>
		<li>ליזום את הפילמור UV (365 nm, 400 W) וימשיכו למשך 15 דקות31. הערה: UV הפילמור מתבצע בתוך ארון הקירור אשר מוגדר--25 ° C לפני ביצוע הפילמור. לאחר מכן, האור האולטרה סגול לריפוי המערכת מופעלת, הפילמור נמשך למשך 15 דקות לפני לכבות את האור UV לריפוי המערכת.</li>
		<li>הסר את תבנית חותמת פני השטח באמצעות מלקחיים. הערה: בעת הסרת תבנית החותמת מפני השטח, הסרט פולימריים על פני עלולים להינזק. לכן, החותמת יש להסיר מן השטח מאוד לאט ובזהירות ללא שימוש בכוח.</li>
		<li>לשטוף את השטח אלקטרודה עם מים יונים, לייבש אותו עם גז חנקן.</li>
		<li>לטבול האלקטרודות ב 1 מ"ל של 1 מ מ 10-מוכן אתנול במשך 20 דקות על מנת לכסות pinholes על פני האלקטרודה dodecanethiol.</li>
		<li>לשטוף את האלקטרודות עם מים יונים ויבש האלקטרודות עם גז חנקן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנה של חלבון טבוע קיבולי אלקטרודות זהב
	<ol>
<li>לפני הפילמור, להכין פתרון מונומר המכיל מונומרים (אקרילאמיד: 54 מ ג; N-hydroxymethylacrylamide: µL 140; N-isopropylacrylamide: 85.6 מ ג), מחדש (methylenebisacrylamide: 9.5 מ ג) בשנת 820 µL של מים אולטרא טהורים30,32.</li>
		<li>להכין 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) במים אולטרא טהורים.</li>
		<li>להוסיף 20 µL של הפתרון TEMED הפתרון מונומר ולטהר עם גז חנקן במשך 5 דקות.</li>
		<li>הכינו 10% (w/v) אמוניום persulphate (APS) במים אולטרא טהורים.</li>
		<li>הוסף 20 µL של הפתרון APS בתוך תמיסת מונומר.</li>
		<li>פיפטה µL 1.5 של הפתרון מונומר על גבי המשטח ששונה אלקטרודה זהב.</li>
		<li>להביא את החותמת תבנית במגע עם המשטח שטופלו מונומר.</li>
		<li>ומתחילים הפילמור בטמפרטורת החדר במשך 5 שעות. הערה: עבור הכנת טבוע חלבון אלקטרודות זהב, במקום UV-פלמור, חינם-רדיקלי הפילמור בטמפרטורת החדר (25 ° C) מתבצע באמצעות APS-TEMED כזרז היוזם.</li>
		<li>הסר את תבנית חותמת פני השטח בקפידה באמצעות מלקחיים.</li>
		<li>לשטוף את האלקטרודה עם מים יונים ויבש עם גז חנקן.</li>
		<li>לטבול האלקטרודות ב 1 מ"ל של 1 מ מ 10-מוכן אתנול במשך 20 דקות על מנת לכסות pinholes על פני האלקטרודה dodecanethiol.</li>
		<li>לשטוף את האלקטרודות עם מים יונים ויבש האלקטרודות עם גז חנקן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. אפיון של המשטח אלקטרודה בסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)
<ol><li>הר דגימות על מחזיקי אלומיניום עם סרט דביק פחמן.</li>
	<li>מעיל האלקטרודות עם פלדיום nm 10/גולד....</li>
	<li>לבחון את האלקטרודות עם-SEM.</li>
</ol>5. בזמן אמת קיבולי מדידות עם תבנית טבוע קיבולי אלקטרודות זהב
<ol><li>הכנס את הדומיננטיות אלקטרודות זהב קיבולי בתא אלקטרוכימי זרימה משולב של ביוסנסור קיבולי.</li>
	<li>להכין 100 מ של התחדשות מאגר (25 מ מ גליצין-HCl, pH 2.5, כולל 50 מ"מ Tween-20), מאגר הפעלה 1 ליטר (עבור bacteriophage טבוע המערכת: 10 מ מ פוספט, pH 7.4; למערכת טבוע חלבון: 50 מ מ טריס-HCl, pH 7.4).</li>
	<li>להתחיל את הניתוח עם ההזרקה של התחדשות מאגר לחדש את המערכת ואת מאגר פועל כדי equilibrate מחדש את המערכת במשך 25 דקות.</li>
	<li>להכין את התבניות התקנית פתרונות בטווח ריכוז הרצוי בניהול מאגר. הערה: להכין מלאי של הפתרון תבנית תחילה על ידי המסת 0.1 מ ג חלבון, או כ 108 pfu bacteriophages, במאגר פוספט 1.0 מ"ל (10 מ מ פוספט, pH 7.4). לאחר מכן, הכן את פתרונות סטנדרטיים עבור עקומת כיול על ידי עשר דילולים 10-fold רציפים מהפתרון מניות. פתרונות אלה ינותחו עם החיישן קיבולי בשלב 5.5. ריכוז החלבון ניתן למדוד באמצעות ספקטרופוטומטרים (280 ננומטר). על מנת למדוד את ריכוז bacteriophage, שיטה אגר שכבה כפולה יכול לשמש, אשר מתואר ב פרטים בעבר19.</li>
	<li>מזריקים µL 250 של אלה פתרונות סטנדרטיים ברצף למערכת התנאים האופטימליים (קצב הזרימה: 100 µL/min, טמפרטורה: 25 ° C). הערה: ביישום זה, הפתרונות חלבון סטנדרטית הוכנו בטווח ריכוז של 1.0 x 10-4 - 1.0 x 10-14, בעוד הריכוזים bacteriophage היו טווח 1.0 x 101 - 1.0 x pfu5 10/mL.... הפתרונות היו להציב את השסתום הזרקה, ברצף מוזרק לתוך המערכת, הזרקת הדגימות ב triplicates באמצעות המשאבה המזרק השסתום מרובה. הירידה קיבול לאחר הזרקת פתרונות סטנדרטיים הנובעים הכריכה של התבנית כדי חללים הדומיננטיות מנוטרת באופן אוטומטי על ידי התוכנה של המכשיר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+albumin+concentration+by+MIP-QCM+sensor.">Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor.</a> Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+Biosensors.">Capacitive Biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. P., Huo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+detection+limits+of+enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISA)+and+bioanalytical+techniques+in+general.">Predicting detection limits of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and bioanalytical techniques in general.</a> The Analyst. 139 (2), 439-445 (2014).</li><li>Mattiasson, B., Teeparuksapun, K., Hedstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+binding+assays+for+detection+and+quantification+of+trace+impurities+in+biotechnological+production.">Immunochemical binding assays for detection and quantification of trace impurities in biotechnological production.</a> Trends in Biotechnology. 28 (1), 20-27 (2010).</li><li>Limbut, W., Hedstr&#246;m, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+biosensor+for+detection+of+endotoxin.">Capacitive biosensor for detection of endotoxin.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (2), 517-525 (2007).</li><li>Ert&#252;rk, G., Berillo, D., Hedstr&#246;m, M., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact-BSA+imprinted+capacitive+biosensor+for+real-time,+sensitive+and+selective+detection+of+BSA.">Microcontact-BSA imprinted capacitive biosensor for real-time, sensitive and selective detection of BSA.</a> Biotechnology Reports. 3, 65-72 (2014).</li><li>Arshady, R., Mosbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+substrate-selective+polymers+by+host-guest+polymerization.">Synthesis of substrate-selective polymers by host-guest polymerization.</a> Macromolecular Chemistry and Physics. 182 (2), 687-692 (1981).</li><li>Andersson, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imprinting:+developments+and+applications+in+the+analytical+chemistry+field.">Molecular imprinting: developments and applications in the analytical chemistry field.</a> Journal of chromatography. B, Biomedical sciences and applications. 745 (1), 3-13 (2000).</li><li>Li, X., Husson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+molecular+imprinting+approach+to+produce+optical+biosensor+recognition+elements.">Two-dimensional molecular imprinting approach to produce optical biosensor recognition elements.</a> Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 22 (23), 9658-9663 (2006).</li><li>Alexander, C., Davidson, L., Hayes, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+polymers:+artificial+molecular+recognition+materials+with+applications+in+synthesis+and+catalysis.">Imprinted polymers: artificial molecular recognition materials with applications in synthesis and catalysis.</a> Tetrahedron. 59 (12), 2025-2057 (2003).</li><li>Kryscio, D. R., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+imprinted+thin+polymer+film+systems+with+selective+recognition+for+bovine+serum+albumin.">Surface imprinted thin polymer film systems with selective recognition for bovine serum albumin.</a> Analytica Chimica Acta. 718, 109-115 (2012).</li><li>Inerowicz, H. D., Howell, S., Regnier, F. E., Reifenberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiprotein+immunoassay+arrays+fabricated+by+microcontact+printing.">Multiprotein immunoassay arrays fabricated by microcontact printing.</a> Langmuir. 18 (13), 5263-5268 (2002).</li><li>Lin, H. Y., Hsu, C. Y., Thomas, J. L., Wang, S. E., Chen, H. C., Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microcontact+imprinting+of+proteins:+The+effect+of+cross-linking+monomers+for+lysozyme,+ribonuclease+A+and+myoglobin.">The microcontact imprinting of proteins: The effect of cross-linking monomers for lysozyme, ribonuclease A and myoglobin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22 (4), 534-543 (2006).</li><li>Liao, P. C., Tyan, Y. C., Wang, C. Y., Hsu, J. F., Chou, T. C., Lin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+binding+selectivity+of+molecularly+imprinted+polymer+artificial+antibodies+by+mass+spectrometry-based+profiling+system.">Assessing the binding selectivity of molecularly imprinted polymer artificial antibodies by mass spectrometry-based profiling system.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 91 (2), 597-604 (2009).</li><li>Ert&#252;rk, G., Hedstr&#246;m, M., T&#252;mer, M. A., Denizli, A., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+prostate-specific+antigen+detection+with+prostate-specific+antigen+imprinted+capacitive+biosensors.">Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors.</a> Analytica Chimica Acta. 891, 120-129 (2015).</li><li>Ert&#252;rk, G., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+imprinting+to+microcontact+imprinting-A+new+tool+to+increase+selectivity+in+analytical+devices.">From imprinting to microcontact imprinting-A new tool to increase selectivity in analytical devices.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1021, 30-44 (2016).</li><li>Ert&#252;rk, G., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imprinting:+The+Creation+of+Biorecognition+Imprints+on+Biosensor+Surfaces.">Molecular Imprinting: The Creation of Biorecognition Imprints on Biosensor Surfaces.</a> Advanced Molecularly Imprinting Materials. , 523-560 (2017).</li><li>Janczuk-Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-period+fiber+grating+sensor+for+detection+of+viruses.">Long-period fiber grating sensor for detection of viruses.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 250, 32-38 (2017).</li><li>Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+bacteriophages+by+double+agar+overlay+plaque+assay.">Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay.</a> Methods in Molecular Biology. 501, 69-76 (2009).</li><li>Meillan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayer+for+AFM+measurements+of+Tobacco+Mosaic+Virus+(TMV)+at+the+atomic+level.">Self-assembled monolayer for AFM measurements of Tobacco Mosaic Virus (TMV) at the atomic level.</a> RSC Adv. 4 (23), 11927 (2014).</li><li>Ymeti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+ultrasensitive+virus+detection+using+a+Young+interferometer+sensor.">Fast, ultrasensitive virus detection using a Young interferometer sensor.</a> Nano Letters. 7 (2), 394-397 (2007).</li><li>Wei, Y., Wong, L. P., Toh, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuel+cell+virus+sensor+using+virus+capture+within+antibody-coated+nanochannels.">Fuel cell virus sensor using virus capture within antibody-coated nanochannels.</a> Analytical Chemistry. 85 (3), 1350-1357 (2013).</li><li>Guliy, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunodetection+of+bacteriophages+by+a+piezoelectric+resonator+with+lateral+electric+field.">Immunodetection of bacteriophages by a piezoelectric resonator with lateral electric field.</a> Applied biochemistry and microbiology. 52 (4), 457-463 (2016).</li><li>Reta, N., Michelmore, A., Saint, C., Prieto-Sim&#243;n, B., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+silicon+membrane-modified+electrodes+for+label-free+voltammetric+detection+of+MS2+bacteriophage.">Porous silicon membrane-modified electrodes for label-free voltammetric detection of MS2 bacteriophage.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 80, 47-53 (2016).</li><li>Ert&#252;rk, G., &#214;zen, H., T&#252;mer, M. A., Mattiasson, B., Denizli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+imprinting+based+surface+plasmon+resonance+(SPR)+biosensor+for+real-time+and+ultrasensitive+detection+of+prostate+specific+antigen+(PSA)+from+clinical+samples.">Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 224, 823-832 (2016).</li><li>Lebogang, L., Mattiasson, B., Hedstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+sensing+of+microcystin+variants+of+Microcystis+aeruginosa+using+a+gold+immunoelectrode+modified+with+antibodies,+gold+nanoparticles+and+polytyramine.">Capacitive sensing of microcystin variants of Microcystis aeruginosa using a gold immunoelectrode modified with antibodies, gold nanoparticles and polytyramine.</a> Microchimica Acta. 181 (9-10), 1009-1017 (2014).</li><li>Loyprasert, S., Hedstr&#246;m, M., Thavarungkul, P., Kanatharana, P., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-attomolar+detection+of+cholera+toxin+using+a+label-free+capacitive+immunosensor.">Sub-attomolar detection of cholera toxin using a label-free capacitive immunosensor.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 25 (8), 1977-1983 (2010).</li><li>Teeparuksapun, K., Hedstr&#246;m, M., Wong, E. Y., Tang, S., Hewlett, I. K., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+detection+of+HIV-1+p24+antigen+using+nanofunctionalized+surfaces+in+a+capacitive+immunosensor.">Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen using nanofunctionalized surfaces in a capacitive immunosensor.</a> Analytical Chemistry. 82 (20), 8406-8411 (2010).</li><li>Labib, M., Hedstr&#246;m, M., Amin, M., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+capacitive+biosensor+for+detection+of+staphylococcal+enterotoxin+B.">A capacitive biosensor for detection of staphylococcal enterotoxin B.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 393 (5), 1539-1544 (2009).</li><li>Ert&#252;rk, G., Hedstr&#246;m, M., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+real-time+assay+of+trypsin+by+using+molecular+imprinting-based+capacitive+biosensor.">A sensitive and real-time assay of trypsin by using molecular imprinting-based capacitive biosensor.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 86, 557-565 (2016).</li><li>Ert&#252;rk, G., Uzun, L., T&#252;mer, M. A., Say, R., Denizli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fab+fragments+imprinted+SPR+biosensor+for+real-time+human+immunoglobulin+G+detection.">Fab fragments imprinted SPR biosensor for real-time human immunoglobulin G detection.</a> Biosensors &amp; Bioelectronics. 28 (1), 97-104 (2011).</li><li>El-Sharif, H. F., Phan, Q. T., Reddy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+selectivity+of+hydrogel-based+molecularly+imprinted+polymers+(HydroMIPs)+following+buffer+conditioning.">Enhanced selectivity of hydrogel-based molecularly imprinted polymers (HydroMIPs) following buffer conditioning.</a> Analytica Chimica Acta. 809, 155-161 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Salmonella+Typhimurium+on+Spinach+Using+Phage-Based+Magnetoelastic+Biosensors.">Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).</li><li>Chin, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+small+quantities+of+specific+bacteria+using+phage-based+wireless+biosensors.">Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors.</a> 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).</li><li>Park, M. -. K., Chin, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approach+of+a+Phage-Based+Magnetoelastic+Biosensor+for+the+Detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+in+Soil.">Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).</li><li>Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -. K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-Based+Biosensor+and+Optimization+of+Surface+Blocking+Agents+to+Detect+Salmonella+typhimurium+on+Romaine+Lettuce.">Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce.</a> Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).</li><li>Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+the+bacteriophage+DNA+fraction+of+environmental+samples.">Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples.</a> Plos One. 6 (3), 17549 (2011).</li><li>Lood, R., Ert&#252;rk, G., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+antibiotic+resistance+spreading+in+wastewater+treatment+plants+-+bacteriophages+as+a+much+neglected+potential+transmission+vehicle.">Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle.</a> Frontiers in microbiology. 8, (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאשר שיטה זו מתבצעת, ישנם כמה צעדים קריטי כי יש לקחת בחשבון בעת בעקבות הפרוטוקול. צעד קריטי הוא הצעד ניקוי עם פתרון פיראניה חומצי. שלב 2.1 אינו יכול להיות יותר מ- 10 דקות. הפתרון תבנית עבור שלב 1.4 יחרוג מ- 0.1 מ"ג/מ"ל, מאז ערכים אלה מוטבו בעבר. Voltametric מחזורית סריקות אינו יכול לחרוג 15 מחזורים על מנת לקבל את העובי האופטימלי. עבור שלב 3.1.3, 1.5 µL הוא ערך מיטבי. ערך זה אינו יכול להיות גבוה יותר עבור הסוג המסוים הזה של האלקטרודה. אם UV לריפוי מערכת יש כוח של 400 W, ואז הפילמור יש לבצע לכל היותר 10-15 דקות. ברגע APS (היוזם) מתווסף הפתרון לאחר TEMED, השלב שלאחר מכן חייב להתבצע מהר מאוד להימנע הפילמור מיידית (שלב 3.2.5).
אחד השלבים הקריטיים ביותר הוא הסרת תבנית החותמת מפני השטח לאחר הפילמור UV. אם שלב זה לא מתבצע כהלכה, קיים סיכון כי הסרט פולימריים על פני האלקטרודה ניתן להסיר עם החותמת. לכן, מומלץ לטבול האלקטרודה ואת החותמת חלבון על גבי בתמיסה של מים לאחר הפילמור, ולאחר מכן להסיר את החותמת באיטיות ובזהירות מפני השטח (שלב 3.1.6).
מבוסס על התבנית המשמשת, שינויים ב ' סוג ' יחס של מונומרים בשימוש (מונומר תפקודית ו מחדש) עשויים להידרש, מבחינת יצירת רגישות גבוהה יותר. זה חייב להיקבע מדעית. עוד יותר, הכריכה זיקה של המולקולה תבנית בדרך כלל כרוך במספר אינטראקציות שונות בו זמנית. לכן, זה עלול להוביל לבעיות במהלך השלבים התחדשות. אם התבנית מאוגד אינו משתחרר מפני השטח כראוי, זה עשוי להשפיע על שימושית של האלקטרודה לצורך ניתוח נוסף. אלה הזיקות רב-נקודתי עלול לגרום גם מ מחייב דרך האינטראקציות החלשות. במערכות כאלה, שאינם ספציפיים האיגוד יכול להתרחש, אשר יכולים להשפיע באופן שלילי על סלקטיביות של מערכת ה-16. אלו הם נפוצים, גנרל, מגבלות של השיטה.
מלבד אלה מגבלות מסוימות, יש המון יתרונות השיטה דנו על פני שיטות קיימות. בעוד RIAs ELISAs, מדידות fluorometric רגישים מאוד, הם דורשים השימוש של חומר עם תוויות (תבנית או גלאי), בעוד החיישן הוא לחלוטין ללא תווית. שיטות אלה הם גם יותר יקרים ולגזול. בגישה ביוסנסור מאפשר מהירה, במקביל סינתזה של מיליוני הוראות בשניה בקומפוזיציות שונות בה זמן זהה16. מאז רק כמה microliters של מונומר פתרון נדרשת הכנה, השיטה היא נוחה בעת שימוש מונומרים מוגבל יקר או אחרת. אלקטרודות MIP עוד, יחיד יכול לשמש כ- 80 ניתוחים ללא ירידה משמעותית הביצועים, אשר גבוה משמעותית מאשר אחרים בשיטות הקיימות30. שיטות קיימות גם סובל, בדרגות שונות, של רגישות נמוכה, סלקטיביות, בעוד השיטה המתוארת מאפשר זיהוי, כימות של מולקולות בטווח pM עם סלקטיביות גבוהה.
בשל עלות-תועלת, להקל על הפעלת המכשיר, זיהוי רגיש בזמן אמת תוך זמן קצר לעומת שיטות קיימות, ביולוגיים הם מאוד מבטיח נקודת-של טיפוח מערכות זיהוי בתנאי שדה; למשל, עבור ניטור סביבתי, יישומים במדינות מתפתחות. ביישומים רבים בתוך האבחון של המחלה, זיהוי בזמן אמת, רגיש, סלקטיבי, מהירה של סמן בתערובת מורכבת כגון סרום הוא נדרש15,25. כאן, ביולוגיים נעלים על שיטות קיימות, בפרט, בשל החוסן ואת הרגישות שלהם. במיוחד עבור זיהוי מדבקים, bacteriophages נחשבים לאחרונה רכיב biorecognition חלופי עבור ביולוגיים עקב שלהם מארח חיידקים ירידה לפרטים33,34,35. החלפת נוגדנים עם bacteriophages הוא מבטיח מאוד על מנת להפחית את העלות, להגדיל עוד יותר את יציבות36. מערכת כזו גם יאפשר זיהוי, כימות מסוים phages הסביבה, מדגימות קליניים. בשל השכיחות של bacteriophages, ואת יכולתם מגלי חיידקים עמידות לאנטיביוטיקה גנים37,38, השיטה עשוי להיות יקר ללמוד את התפשטות בקטריאלי עמיד.

כימות של מולקולות משמש בתחומים שונים מחקר רבים בתוך המדע, באמצעים כמו רדיו אימונולוגי (RIA) או אליסה1. חלק שיטות אלו דורשות שכותרתו מגיב כמו radioisotope או אנזים הנקרא נוגדן/אנטיגן, מה שהופך אותם מהגידולים ולגזול עם הליכים מורכבים2. עוד יותר, החוסן, סלקטיביות ורגישות של שיטות אלה אינן מספיקות עבור כל ניתוח; בפרט הם לא מספיק כאשר כמויות attogram צריך להיות מנותח, ולא pictogram כמויות3. למטרה זו, ביולוגיים השיגו עניין רב4,5, במיוחד בשילוב עם הטבעה מולקולרית עבור חוסן מוגברת.
הטבעה מולקולרית מסתמך על יצירת חללים על-ידי polymerizing מונומרים פונקציונלי סביב התבנית6, ביצירת אתרים מלאכותי זיהוי הדומים באופן מושלם את תבנית7. טכניקה זו שימש עבור מספר יישומים, כולל מערכות והפרדה אנליטית, אלא גם biorecognition אלמנטים ביולוגיים8,9,10. עם זאת, יש עדיין קשיים בעיצוב של פולימרים הדומיננטיות מולקולרי (מיליוני הוראות בשניה) עבור תבניות macromolecular11,של חלבונים ותאים -12. בגלל זה, חוקרים רבים התמקדו החתמה החלבון תבנית ישירות על גבי מצע, ובכך ליצור משטח תוכר על ידי חלבון המטרה12. טכניקה זו ציפוי פני השטח המשמש עבור העסקת זיהוי חללים עבור מולקולות גדולות וההרכבות כולל חלבונים נקראת החתמה13,14microcontact. ההליך הכללית של השיטה תלויה הפילמור בין משטחים שני - חותמת תבנית, תמיכה פולימר - שעליו התבנית הספוחה על פני15,אחד16, והוא הביא במגע פני השטח שטופלו מונומר. על ידי כך נוצר סרט פולימרי דק על התמיכה באמצעות UV-הפילמור. לבסוף, התבנית מוסר, כשמאחוריו תבנית חללים מסוימים על פני השטח של האלקטרודה הדומיננטיות. בשיטה זו יש כמה יתרונות כולל אובדן פעילות מופחתת של המולקולה הדומיננטיות, כמו גם דרישת גם בכמויות קטנות מאוד של תבנית מולקולות של החתמה לעבד16,17. לפיכך, משטחים אלה חסכונית, יציבה, רגיש, סלקטיבי יכולים להיווצר על משטחים חיישן, מיקוד כל תבנית לבחירה של המשתמש.
זיהוי חלבונים יחיד, הרבה יותר גדול ובמקרו-מולקולות ביולוגיות, כולל וירוסים יכול לשמש את החיישן. קבוצה מסוימת של וירוסים צובר ריבית האחרונות הוא bacteriophage, אשר הוא וירוס שמדביק חיידקים. זיהוי מהיר ורגיש bacteriophages חשוב במהלך ביוטכנולוגי ותהליכים ביולוגיות על מנת לקבוע זיהומים חיידקיים תרבויות עם bacteriophages18. וזמינותו הביולוגית הנפוצות ביותר לגילוי bacteriophage היא שכבה כפולה אגר שיטת19, שהיא מייגעת וצורכת זמן. נעשו מספר נסיונות לפתח הרומן כלי אבחון לאיתור וירוסים (bacteriophages כולל) כגון כוח אטומי (AFM) מיקרוסקופיה20, אינטרפרומטריה21, אלקטרוכימיה22חיישן מערכת23, 24. הרבה עבודה התמקדו ביולוגיים בשל יתרונות כמו להיות קלה לתפעול, רגישה מאוד, מסוגל בזמן אמת מידה15,25. סוג מסוים של ביוסנסור מבוסס על שינויים קיבול. אלה ביולוגיים קיבולי הם החיישנים אלקטרוכימי למדוד שינויים במאפייני מבודד כאשר analyte אינטראקציה עם רכיב biorecognition על פני חיישן, גרימת ירידה קיבול2,4 . ביולוגיים קיבולי שימשו איתור analytes שונים כמו אנטיגנים, נוגדנים, חלבונים ו מטאל יונים6,26,27,28. סוגים אלה של ביולוגיים יש יתרונות רבים כמו במהירות הטבועה, רגישות גבוהה, פשטות, עלות נמוכה, קל מניפולציה מדידה בזמן אמת ללא תיוג29.
השיטה המתוארת במסמך זה נועד לאפשר זיהוי, כימות של מולקולות נמוך-שופע בדגימות מאוד מורכבים, ללא הצורך בשימוש כל תיוג. בפרט, הטכניקה שימושית ביותר בטווח אטו-picogram של מולקולות, איפה מסחרית קיימים כלים אחרים להיכשל באופן מדויק quantitate היעד שלהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:753px;" width="754">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Cover slips</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:224px;">102222</td>
			<td style="width:167px;">protein stamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-500ML</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:147px;">Branson Ultrasonic</td>
			<td>BRANSONIC M1800- E</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648-100ML</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EtOH</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>1009836010</td>
			<td>rinsing/cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glutaraldehyde</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-100ML</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acetone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850-1L-M</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2SO4</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741-100ML</td>
			<td>piranha solution</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2O2</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-500ML</td>
			<td>piranha solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tyramine</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T90344-5G</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CompactStat</td>
			<td style="width:147px;">Ivium Technologies</td>
			<td>CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Platinum Counter Electrode Kit</td>
			<td style="width:147px;">Equilabrium</td>
			<td>AFCTR5</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference Electrode</td>
			<td style="width:147px;">Equilabrium</td>
			<td>RREF0021</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acryloyl chloride</td>
			<td style="width:147px;">EMD Millipore</td>
			<td>8.00826.0100</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">triethylamine</td>
			<td style="width:147px;">EMD Millipore</td>
			<td>8.08352.0100</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">toluene</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-100ML</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-hydroxymethyl acrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>245801-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">poly ethylene glycol-400-dimethacrylate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>409510-250ML</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896-50G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV polymerizator</td>
			<td style="width:147px;">Dymax</td>
			<td style="width:224px;">Dymax 5000ECE</td>
			<td>UV-polymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168777-1EA</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1-dodecanethiol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>471364-100ML</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-hydroxymethylacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>245801-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-isopropylacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>415324-50G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-500G</td>
			<td>cross-linking monomer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetrametyhlethyldiamine (TEMED)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td>catalyst</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ammonium persulphate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Capacitive biosensor</td>
			<td style="width:147px;">CapSenze</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:147px;">Merck</td>
			<td>1042011000</td>
			<td>regeneration buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>regeneration buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;&#8226; 2H2O</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>567547-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4&#160;&#8226; 2H2O</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>567549-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DELPHI correlative light and electron microscope</td>
			<td style="width:147px;">Phenom-World</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capacitive gold electrodes</td>
			<td>CapSenze Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#39;-azobis(2-methypropionitrile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441090-25G</td>
			<td>photo-initiator</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">CapSenze Smart Software</td>
			<td style="width:147px;">CapSenze Biosystems</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td style="width:167px;">software program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasensitive detection of biomarkers by using a molecular imprinting based capacitive biosensor

היכולת לזהות quantitate מולקולות בפתרונות מורכבים תמיד היה מאוד מבוקש בתוך מדעי הטבע; בשימוש עבור זיהוי סמנים ביולוגיים, מזהמים, מולקולות אחרות של עניין. טכניקה נפוץ למטרה זו הוא מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay (אליסה), שבו סוג נוגדן אחד לעיתים קרובות מכוונת מולקולה יעד ספציפיות, נוגדן שכותרתו השני משמש לאיתור נוגדן ראשוני, המאפשר כימות מוחלטת של biomolecule במחקר. עם זאת, השימוש של נוגדנים כרכיבים זיהוי מגביל את היציבות של השיטה; כמו גם הצורך של שימוש בתווית מולקולות. כדי להתגבר על מגבלות אלה, הטבעה מולקולרית יושם, ביצירת אתרים מלאכותי זיהוי משלים המולקולה תבנית ולאחר obsoleting את נחיצות באמצעות נוגדנים עבור איגוד הראשונית. עוד יותר, רגישות גבוהה יותר, הנוגדן שכותרתו משני יכול להיות מוחלף על ידי ביולוגיים להסתמך על קיבול עבור כימות של מולקולת המטרה. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לשם במהירות, ללא תווית זיהוי של quantitate מולקולות נמוך-בשפע (חלבונים ווירוסים) בדגימות מורכבים, עם רגישות באופן משמעותי יותר. מערכות הזיהוי בשימוש נפוץ, כגון אליסה. זה כל מתווך על ידי הטבעה מולקולרית בשילוב ביוסנסור קיבוליות.

לפי הפרוטוקול, לפי איור 1, אלקטרודה זהב חשופות יוטבע עם תבנית, המייצג את מבנה biomacromolecule. אלקטרודה זו ניתן ליישם ביוסנסור קיבולי (איור 2), המאפשר יישום יציב של תבנית אל האלקטרודה, מדידת שינויים קיבול על הכריכה של התבנית.
ייצוג סכמטי של החיישן קיבולי מוצג באיור2. המשאבה centris, האחראית על הזרקת רציפה של המאגר המצטבר (10 מ מ פוספט, pH 7.4), המאגר התחדשות (25 מ מ גליצין-HCl, pH 2.5) במהלך התחדשות לתוך התא זרימה, ניתן לראות בבירור הדמות. התא זרימה מורכב עבודה, הפניה, מונה אלקטרודות. השסתום הזרקת מורכב של חלבונים רגיל/bacteriophage פתרונות, אשר עוברים degasser קודם, לאחר מכן מוזרק ברצף לתוך המערכת. ברגע הפתרונות מגיעים האלקטרודה עובד נוסף בתא זרימה, התוצאה נעשה בזמן אמת. הערכים קיבול יכול להיות רשום על-ידי ביצוע את sensorgrams על מסך המחשב.
איור 3 ו- 4 איור מתארים את ההבדלים בין פני השטח של אלקטרודות זהב ולא מוטבעים. שלב אפיון זה חשוב לוודא כי ישנם חללים פולימריים, רואים חספוס על פני האלקטרודה לאחר ההטבעה. מלבד SEM, ישנן גם שיטות אחרות אפיון כולל AFM, מדידות זווית מגע, ellipsometry וכדומה, אשר יכול לשמש כדי לאפיין את השטח לאחר ההטבעה. מאת בדרך זו, זה יכול להיות הבטיחו כי תהליך החתמה היא מוצלחת, כי תבנית חללים נוצרות על פני השטח. בתוך חללים אלו, באפשרותך לאגוד התבנית עם ירידה לפרטים גבוה ואהדה.
אחרי הזרקת פתרונות סטנדרטיים למערכת קיבולי, ממוצע של שני המקראות מחושב באופן אוטומטי על ידי התוכנה, כיול הגרפים התקבלו על ידי מתכנן שינוי קיבוליות לעומת הריכוז analyte. הירידה רשום קיבול עלתה מן הכריכה של התבנית. מולקולות נוספות אשר נקלטות על האלקטרודה זהב על פני השטח, גבוה יותר הקטנת קיבוליות הכולל, על פי העיקרון הכללי של מדידות קיבולי. איור 5 ו- 6 איור להראות כי עם הגדלת ריכוז analyte, ΔC מגביר כצפוי. על ידי ניתוח גרפים אלה ניתן להעריך את הטווח הדינמי (שביניהן הוא הטווח ריכוז איפה המערכת שימושית לצורך זיהוי מטרה ספציפית), המגבלה של זיהוי (לוד). על פי איור 6, החיישן קיבולי bacteriophage טבוע יכול לזהות bacteriophages בטווח ריכוז של 101 - pfu5 10/mL, שערכו לוד pfu/mL 10 במחקר זה. איור 5 ו- 6 איור האר בצורך של מדידת עקומת כיול באותו מרווח נדרש גם ריכוז תבנית אמור, מאז ליניאריות של הרגרסיה עשויים להשתנות על פני ריכוז ( איור 5), או יש מדרונות שונים (איור 6). יש גם לציין כי בשל ריכוזים נמוכים בשימוש המערכת היא מאוד רגיש לתנודות (עכירות, לדוגמה, אוויר טיוטה, וכו '), לכן מומלץ לרוץ לפחות triplicates כדי להפחית את הפוטנציאל של כולל ליניאריים . מאותה סיבה, סטיית התקן יכול להיות משמעותי למדי עבור דגימות מדולל מאוד, כפי שניתן לראות באיור 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig1.jpg"> איור 1 . ייצוג סכמטי microcontact החתמה שיטה. (א) הכנת פתקי כיסוי זכוכית (תבנית בולים), (B) הכנת האלקטרודות זהב קיבולי, (ג) microcontact החתמה של התבנית על גבי משטח זהב אלקטרודה דרך UV-פלמור, ו- (ד) הסרת תבנית מהמשטח אלקטרודה (לשכפל מ Ertürk. et al., ביוטכנולוגיה דוחות 2014 (3): 65-72 עם הרשאה). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig2.jpg"> באיור 2. ייצוג סכמטי של החיישן קיבולי. הפריסה הכללית של החיישן קיבולי השתמשו במחקר זה (לשכפל מ Ertürk. et al., ביוטכנולוגיה דוחות 2014 (3): 65-72 עם הרשאה). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig3.jpg"> איור 3. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של חלבון טבוע אלקטרודות. תמונות SEM של (A) אלקטרודה זהב חשופות (סולם בר = 20 מיקרומטר), וחרוטות (B) חלבון קיבולי אלקטרודה זהב (מידה בר = 10 מיקרומטר). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig4.jpg"> באיור 4. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של bacteriophage טבוע אלקטרודות. תמונות SEM של אלקטרודה זהב חשופות (סולם בר = 20 מיקרומטר) (A), וחרוטות bacteriophage קיבולי אלקטרודה זהב ב רמות הגדלה שונות (6600 x, סולם בר = 10 מיקרומטר) (B), ו 11, 500 X, סולם בר = 5 מיקרומטר) (ג); החיצים מציינות מודבקת bacteriophages). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig5.jpg"> איור 5. אפקט של מאגר הרכב לתרשימים כיול. כיול גרף המציג את השינוי בקיבול לעומת ריכוז חלבון בתנאים אופטימליים (הפעלת מאגר: 50 מ מ טריס-HCl, pH 7.4; התחדשות מאגר: 25 מ מ גליצין-HCl, pH 2.5 כולל 50 מ"מ Tween-20; קצב הזרימה: 100 µL/min, נפח דגימה: 250 µL; T: 25 ° C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig6.jpg"> איור 6. עקומת כיול נציג עבור ובמקרו-מולקולות ביולוגיות גדולות. גרף כיול המציגות את השינוי קיבוליות לעומת ריכוז bacteriophage בתנאים אופטימליים (הפעלת מאגר: 10 מ מ פוספט, pH 7.4; התחדשות מאגר: 25 מ מ גליצין-HCl, pH 2.5 כולל 50 מ"מ Tween-20; קצב הזרימה: 100 µL/min, נפח דגימה: 250 µL; T: 25 ° C) <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor at JoVE.com

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

כאן, אנו מציגים פרוטוקול זיהוי, כימות של מולקולות בשפע נמוך פתרונות מורכבים באמצעות מולקולרית החתמה בשילוב ביוסנסור קיבול.

זיהוי העדינה של סמנים ביולוגיים באמצעות הטבעה מולקולרית מבוסס ביוסנסור קיבולי

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

ultrasensitive-detection-biomarkers-using-molecular-imprinting-based

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  Lund University. כאן, אנו מציגים פרוטוקול זיהוי, כימות של מולקולות בשפע נמוך פתרונות מורכבים באמצעות מולקולרית החתמה בשילוב ביוסנסור קיבול.

Video: Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

איתור של יקוציט האדם Antigen Biomarkers בסרטן שד ניצול הטכנולוגיה biosensor ללא תווית

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

זיהוי נוגדן Anti-aquaporin-4 G בנסיוב אדם על ידי Assay מבוססת-תא

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous aspiration of cells and/or microorganisms from palpable masses, organs or effusions (fluid accumulation in a body cavity) using a thin needle similar to the regular needle used for the venous puncture. The material collected by FNA is in general highly cellular, and the retrieved aspirate is then smeared, air dried, wet-fixed, stained and observed under a microscope. In the clinical context, FNA is an important diagnostic tool that serves as a guide to the appropriate therapeutic management. Because it is simple, fast, minimally invasive and requires limited investment in the laboratory and human resources, it is extensively used by veterinary practitioners, mostly in domestic, but also in farm animals. In studies using animal models, FNA has the advantage that it can be performed repeatedly in the same animal, enabling longitudinal studies through the collection of cells from tumors and organs/tissues over the course of the disease. In addition to routine microscopy, retrieved material can also be used for immunocytochemistry, electron microscopy, biochemical analysis, flow cytometry, molecular biology or in vitro assays. FNA has been used to identify the protozoan parasite Trypanosoma brucei in the gonads of infected mice, opening the possibility for a future diagnosis in cattle.

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration is a technique, whereby cells are obtained from a lesion or organ using a thin needle. Aspirated material is smeared, stained and examined under a microscope for diagnosis or used for molecular biology, cytometry or in vitro analysis. It is cheap, simple, quick and causes minimal trauma.