Maria Baumgarten (plataforma de biotecnologia IQ, infecção de medicina, Universidade de Lund) é reconhecido pela execução e fornecer varredura micrografias de elétron. Este trabalho foi apoiado por subsídios de pesquisa Sueco The Conselho Formas (2017-00100) como parte da terceira comum programação iniciativa europeia na chamada de resistência antimicrobiana (JPIAMR) "Dinâmica de transmissão." Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, interpretação, escrita, preparação do manuscrito, decisão de submeter ou a decisão de publicar o trabalho.

1. modificação de lamínulas de vidro (modelo selos)
<ol><li>Para limpar as lamínulas de vidro, mergulhe-os sequencialmente em 10 mL de HCl 1,0 M, água deionizada e 1,0 M de NaOH, respectivamente, por 10 min em cada etapa em um líquido de limpeza ultra-sônico à temperatura ambiente.<ol>
<li>Seque as lamínulas de vidro com gás nitrogênio. Nota: As lamínulas são secas por evaporação sob um fluxo de nitrogênio gasoso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mergulhe as lamínulas limpas e secas em 10% (v/v), 10 mL da solução de 3-amino-propil-triethoxysilane (APTES) em etanol por 1h introduzir grupos aminoácidos na superfície de vidro, à temperatura ambiente.<ol>
<li>Lave as lamínulas com água desionizada.</li>
		<li>Seque as lamínulas com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mergulhe as lamínulas APTES-modificado em 5% (v/v), 10 mL da solução de glutaraldeído em 10 mM de tampão fosfato (pH 7,4) por 2 h a fim de ativar os grupos aminoácidos na superfície, a temperatura ambiente6,15.<ol>
<li>Lave as lamínulas com 10 mM de tampão fosfato (pH 7,4) a fim de remover o excesso glutaraldeído da superfície.</li>
		<li>Seque as lamínulas com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 1,0 mL de solução de modelo (proteína/bacteriófago) em 10 mM de tampão fosfato (pH 7,4) na concentração de 0,1 mg/mL. Nota: Dissolva 0,1 mg de proteína em 1,0 mL de tampão fosfato (10 mM, pH 7,4). Se necessário, um espectrofotômetro (280 nm) pode ser usado para determinar a concentração de proteína.<ol>
<li>Largue a 200 µ l desta solução de modelo para as lamínulas modificadas e incubar a 4 ° C durante a noite. Nota: A solução do modelo em excesso pode ser usada para preparar 1-2 mais selos do modelo a ser usado nos estudos de caracterização.</li>
		<li>Lave as lamínulas com 10 mM de tampão fosfato (pH 7,4) a fim de remover o modelo desvinculado da superfície. Nota: Para enxaguar os eléctrodos, lave-os com tampão fosfato (10 mM, pH 7,4) por 30 s.</li>
		<li>Seque as lamínulas com gás nitrogênio. Nota: As lamínulas devem ser armazenadas a 4 ° C até que eles são usados na etapa de polimerização.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. modificação de eletrodos de ouro capacitivos
<ol><li>Para limpar os eletrodos, mergulhar os eléctrodos num copo pequeno, sequencialmente, contendo 5 mL de etanol (70%), água deionizada água, acetona, água desionizada, solução ácida piranha (3:1, H2SO4: H2O2, v/v) e deionizada água, respectivamente, para 10 min em cada etapa, em um líquido de limpeza ultra-sônico à temperatura ambiente.<ol>
<li>Seque os eléctrodos com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para executar o electropolymerization de tiramina, prepare-se 8 mL de solução de tiramina de 10 mM em 10 mM fosfato tampão (pH 7,4) contendo etanol (2 mL)15. Nota: O volume total da solução de tiramina deve ser 8 mL no total incluindo 2 mL de etanol.<ol>
<li>Executar varreduras voltamétricos cíclicas (15 ciclos) nesta solução usando um potentiostat cobrindo um potencial intervalo de 0 - 1.5 V (Ag/AgCl) e uma taxa de varredura de 50 mV/s30.</li>
		<li>Lave os eletrodos com água desionizada.</li>
		<li>Seque os eléctrodos com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mergulhar os eléctrodos em uma solução contendo cloreto de acryloyl de 30 mM e 30 mM trimetilamina em tolueno (Vtotal = 5 mL) à temperatura ambiente durante a noite,6,15,30.<ol>
<li>Lave os eletrodos com água desionizada. Nota: Para garantir uma melhor remoção de acryloyl não tenha reagido resíduos cloreto e trimetilamina, também é possível lavar a superfície com NaOH após água desionizada.</li>
		<li>Seque os eléctrodos com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação do modelo de impresso capacitivos eletrodos de ouro
<ol><li>
Preparação do bacteriófago impresso capacitivos eletrodos de ouro
	<ol>
<li>Antes da polimerização, prepare uma solução de monómero que contém monômero (N-hidroximetil acrilamida) e cross-linker (polietileno glicol-400-Dimetacrilato) na proporção de 1:5 em 1 mL de 10 mM de tampão fosfato (pH 7,4) (mol/mol). Nota: A solução de monómero que contém monômero e cross-linker pode ser usada em diferentes proporções, ou os tipos do monômero e cross-linker podem ser alterados de acordo com o modelo para otimização da interação específica.</li>
		<li>Adicione 1 mg de foto-iniciador para esta solução. Nota: Se a polimerização é realizada sob a luz UV, então o foto-iniciador deve ser usado para iniciar a polimerização. Se a polimerização é realizada pela polimerização do radical livre, o tipo de iniciador deve ser alterado.</li>
		<li>Pipete 1,5 µ l desta solução para a superfície de ouro do eletrodo ouro modificado. Nota: A superfície de ouro do eléctrodo é mostrada esquematicamente na Figura 1.</li>
		<li>Trazer o carimbo modelo em contacto com a solução de monômero na parte superior da superfície do eletrodo de ouro.</li>
		<li>Iniciar a polimerização UV (365 nm, 400 W) e continue por 15 min31. Nota: A polimerização UV é executada dentro de um armário de refrigeração, que é definido para-25 ° C antes de iniciar a polimerização. Então, a sistema de cura a luz UV é ativada e a polimerização é continuada por 15 min antes de desligar a sistema de fotopolimerização de luz UV.</li>
		<li>Remova o selo de modelo da superfície com o uso de fórceps. Nota: Ao remover o selo de modelo da superfície, a película polimérica na superfície pode ser danificada. Portanto, o carimbo deve ser removido da superfície com muito cuidado e lentamente sem usar força.</li>
		<li>Enxaguar a superfície do eletrodo com água deionizada e seque-o com gás nitrogênio.</li>
		<li>Mergulhe os eléctrodos em 1 mL de 10 mM 1-dodecanethiol preparado em etanol por 20 min para cobrir furos na superfície do eletrodo.</li>
		<li>Lave os eletrodos com água desionizada e seque os eléctrodos com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de proteína impresso capacitivos eletrodos de ouro
	<ol>
<li>Antes da polimerização, preparar uma solução de monômero contendo monômeros (acrilamida: 54 mg; N-hydroxymethylacrylamide: 140 µ l; N-isopropylacrylamide: mg 85,6) e cross-linker (methylenebisacrylamide: 9,5 mg) em 820 µ l de água ultra pura30,32.</li>
		<li>Prepare-se 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) em água ultra pura.</li>
		<li>Adicionar 20 µ l da solução TEMED para a solução de monômero e purga com gás de nitrogênio por 5 min.</li>
		<li>Prepare-se 10% (p/v) persulfato de amónio (APS) em água ultra pura.</li>
		<li>Adicione 20 µ l da solução de APS para a solução de monômero.</li>
		<li>Pipete 1,5 µ l da solução de monômero para a superfície do eletrodo de ouro modificada.</li>
		<li>Trazer o carimbo modelo em contacto com a superfície tratada com monômero.</li>
		<li>Iniciar a polimerização à temperatura ambiente e continue por 5 h. Nota: Para a preparação de proteína-impresso eletrodos de ouro, em vez de UV-polimerização, radicais livres polimerização à temperatura ambiente (25 ° C) é executada usando APS-TEMED como iniciador-catalisador.</li>
		<li>Remova o selo de modelo da superfície cuidadosamente usando fórceps.</li>
		<li>Lave o eletrodo com água deionizada e seque com gás nitrogênio.</li>
		<li>Mergulhe os eléctrodos em 1 mL de 10 mM 1-dodecanethiol preparado em etanol por 20 min para cobrir furos na superfície do eletrodo.</li>
		<li>Lave os eletrodos com água desionizada e seque os eléctrodos com gás nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Caracterização da superfície do eletrodo com microscopia eletrônica (SEM)
<ol><li>Monte os espécimes nos suportes de alumínio com fita adesiva de carbono.</li>
	<li>Revesti os eléctrodos com 10 nm de paládio/ouro.</li>
	<li>Examinar os eléctrodos com SEM.</li>
</ol>5. medições capacitivas em tempo real com modelo impresso capacitivos eletrodos de ouro
<ol><li>Inserir os eletrodos de ouro capacitivos imprimidos a célula eletroquímica fluxo integrada para um biossensor capacitivo.</li>
	<li>Preparar 100 mL de buffers de regeneração (25mm glicina-HCl, pH 2.5, incluindo 50mm Tween-20) e execução 1 L (para bacteriófago impresso sistema: fosfato 10 mM, pH 7,4; para o sistema de proteína-impresso: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4).</li>
	<li>Inicie a análise com a injeção de buffer de regeneração para regenerar o sistema e execução buffer para re-equilibrar o sistema por 25 min.</li>
	<li>Prepare soluções de modelo padrão na faixa de concentração desejada em reserva de marcha. Nota: Primeiro prepare um estoque da solução modelo dissolvendo 0,1 mg de proteína, ou aproximadamente 108 pfu bacteriófagos, em 1,0 mL de tampão de fosfato (fosfato 10 mM, pH 7,4). Então, prepare-se das soluções-padrão para a curva de calibração, fazendo dez diluições de 10 vezes sequenciais de solução-mãe. Essas soluções serão analisadas com o biosensor capacitivo na etapa 5.5. Concentração de proteína pode ser medida usando um espectrofotômetro (280 nm). Para medir a concentração do bacteriófago, pode ser usado um método de ágar de dupla camada, que é descrito em detalhes anteriormente19.</li>
	<li>Injectar 250 µ l destas soluções padrão sequencialmente para o sistema em ótimas condições (taxa de fluxo: 100 µ l/min, temperatura: 25 ° C). Nota: Nesta aplicação, as soluções de proteína padrão foram preparadas na faixa de concentração de 1,0 x 10-4 - 1,0 x 10-14, enquanto as concentrações de bacteriófago estavam no intervalo de 1.0 x 101 - 1,0 x 105 pfu/mL. As soluções foram colocadas na válvula de injeção e sequencialmente injetadas no sistema, injetando as amostras em triplica através da bomba de seringa única e a válvula multiporta. A diminuição da capacidade após injetar as soluções padrão decorrentes da vinculação do modelo das cavidades impressa é monitorada automaticamente pelo software do instrumento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+albumin+concentration+by+MIP-QCM+sensor.">Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor.</a> Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+Biosensors.">Capacitive Biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+small+quantities+of+specific+bacteria+using+phage-based+wireless+biosensors.">Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors.</a> 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).</li><li>Park, M. -. K., Chin, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approach+of+a+Phage-Based+Magnetoelastic+Biosensor+for+the+Detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+in+Soil.">Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).</li><li>Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -. K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-Based+Biosensor+and+Optimization+of+Surface+Blocking+Agents+to+Detect+Salmonella+typhimurium+on+Romaine+Lettuce.">Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce.</a> Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).</li><li>Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+the+bacteriophage+DNA+fraction+of+environmental+samples.">Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples.</a> Plos One. 6 (3), 17549 (2011).</li><li>Lood, R., Ert&#252;rk, G., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+antibiotic+resistance+spreading+in+wastewater+treatment+plants+-+bacteriophages+as+a+much+neglected+potential+transmission+vehicle.">Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle.</a> Frontiers in microbiology. 8, (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Quando este método é realizado, existem algumas etapas essenciais que devem ser consideradas ao seguir o protocolo. Um passo crítico é a etapa de limpeza com solução ácida de piranha. Passo 2.1 não deve ser mais de 10 min. A solução de modelo para a etapa 1.4 não deve exceder 0,1 mg/mL, desde que estes valores foram previamente otimizados. Exames titulimétricos cíclica não devem exceder 15 ciclos a fim de obter a espessura ideal. Para etapa 3.1.3, 1,5 µ l é um valor otimizado. Este valor não deve ser mais elevado para este tipo específico de eletrodo. Se o sistema de cura UV tem uma potência de 400 W, a polimerização deve ser executada por um período máximo de 10-15 min. Tão logo o APS (iniciador) é adicionado à solução após TEMED, a etapa subsequente deve ser executada muito rapidamente para evitar a polimerização imediata (passo 3.2.5).
Um dos passos mais importantes é a remoção do carimbo modelo da superfície após a polimerização UV. Se esta etapa não é realizada corretamente, há um risco de que o filme polimérico na superfície do eléctrodo pode ser removido com o carimbo. Portanto, é recomendável para mergulhar o eléctrodo e o carimbo de proteína no topo de uma solução de água após a polimerização e, em seguida, retire o selo muito lentamente e com cuidado a superfície (etapa 3.1.6).
Baseado no modelo utilizado, modificações no tipo e proporção de monômeros usados (monómero funcional e cross-linker) poderão ser avaliadas em termos de geração de maior sensibilidade. Isso deve ser determinado empiricamente. Além disso, a ligação de afinidade da molécula modelo geralmente envolve várias interações diferentes simultaneamente. Portanto, isso pode levar a problemas durante as etapas de regeneração. Se o modelo vinculado não é liberado da superfície corretamente, isso pode influenciar a capacidade de reutilização do eletrodo para posterior análise. Essas afinidades multipontos também podem resultar de ligação através de interações fracas. Em tais sistemas, inespecificas podem ter lugar, que pode influenciar negativamente o a seletividade do sistema16. Estas são comuns e gerais, limitações do método.
Além dessas limitações específicas, existem muitas vantagens significativas do método discutido sobre os métodos existentes. Enquanto RIAs, Elisa e medições fluorométrica são muito sensíveis, eles exigem o uso de material rotulado (modelo ou detector), enquanto o biosensor é completamente rótulo livre. Esses métodos também são mais caros e demorados. Uma abordagem de biosensor permite a síntese rápida, paralelo de MIPs em composições diferentes, o mesmo tempo16. Uma vez que apenas alguns microlitros de solução de monômero é necessária para a preparação, o método é conveniente quando usando caros ou não limitado de monômeros. Além disso, o único eletrodos MIP podem ser usados para aproximadamente 80 análises sem uma diminuição significativa no desempenho, que é significativamente maior do que outros de métodos existentes30. Os métodos existentes também sofrem, em graus variáveis, de baixa sensibilidade e seletividade, enquanto o método descrito permite para detecção e quantificação de moléculas na faixa de pM com alta seletividade.
Devido a relação custo-eficácia, a facilidade de operação do instrumento e a detecção sensível em tempo real em um curto período de tempo em comparação com os métodos existentes, os biosensores são muito promissor ponto-de sistemas de deteção de cuidados sob condições de campo; por exemplo, para monitoramento ambiental e para aplicações em países em desenvolvimento. Em muitas aplicações no diagnóstico da doença, detecção em tempo real, sensível, seletiva e rápida de um biomarcador em uma mistura complexa como o soro é necessário15,25. Aqui, biosensores são superiores aos métodos existentes, em particular, devido à sua sensibilidade e robustez. Especificamente para a detecção de agentes infecciosos, bacteriófagos são recentemente considerados como elemento de biorecognition alternativos para biossensores devido à sua especificidade anfitrião de bactérias33,34,35. Substituição de anticorpos com bacteriófagos é muito promissor, a fim de reduzir o custo e aumentar a estabilidade ainda mais36. Esse sistema também permitirá a detecção e quantificação do fago específico no ambiente e de amostras clínicas. Devido a prevalência de bacteriófagos e sua capacidade de transduce bactérias com genes de resistência aos antibióticos37,38, tal método pode ser valioso para estudar a propagação de bactérias resistentes.

A quantificação das biomoléculas é usada em muitos campos diferentes de pesquisa dentro da ciência, empregando métodos como o radioimunoensaio (RIA) ou ELISA1. Alguns desses métodos requerem um rotulado reagente como um radioisótopo ou uma enzima chamada anticorpo/antigénio, o que os torna trabalhosa e demorada com procedimentos complexos2. Além disso, a robustez, seletividade e sensibilidade desses métodos não são suficientes para todas as análises; em particular não são suficientes quando quantidades attogram precisam ser analisado, ao invés de pictograma quantidades3. Para este efeito, biosensores ganharam considerável interesse4,5, em especial em combinação com impressão molecular para uma maior robustez.
Impressão molecular baseia-se na criação de cavidades, polimerização de monômeros funcionais em torno do modelo6, criação de sites de reconhecimento artificial que lembram perfeitamente o modelo7. Esta técnica tem sido usada para diversas aplicações, incluindo sistemas de entrega de droga e separação analítica, mas também como elementos biorecognition em biosensores8,9,10. No entanto, existem ainda algumas dificuldades na concepção de polímeros molecularmente impressos (MIPs) para modelos macromoleculares como proteínas e células de11,12. Devido a isto, muitos pesquisadores concentraram-se na impressão a proteína modelo diretamente sobre um substrato, criando assim uma superfície que será reconhecida pela proteína alvo12. Esta técnica de revestimento de superfície usada para empregar cavidades de reconhecimento por grandes moléculas e montagens, incluindo proteínas é chamada microcontact impressão13,14. O procedimento geral do método depende da polimerização entre duas superfícies - um selo de modelo e um suporte de polímero - sobre a qual o modelo é adsorvido em uma superfície de15,16e trouxe em contato com o superfície tratada com monômero. Por esta maneira, uma película fina de polímero é formada com o apoio através de UV-polimerização. Finalmente, o modelo é removido, deixando para trás a cavidades específicas do modelo na superfície do eletrodo impresso. Este método tem algumas vantagens, incluindo uma perda reduzida atividade da molécula imprimida, quantidades muito pequenas, bem como exigindo de moléculas modelo para a impressão processam16,17. Assim, estas superfícies cost-effective, estáveis, sensíveis e seletivas podem ser criados nas superfícies de sensor, visando a qualquer modelo de escolha do usuário.
O biosensor pode ser usado para a detecção de proteínas simples e macromoléculas muito maiores, incluindo vírus. Um grupo específico de vírus ganhando interesse recente é o bacteriófago, que é um vírus que infecta bactérias. Detecção rápida e sensível de bacteriófagos é importante durante biotecnológicas e biofarmacêutica processos a fim de determinar as infecções de culturas bacterianas com bacteriófagos18. O ensaio biológico mais comumente usado para a deteção do bacteriófago é a dupla camada agar método19, que é trabalhoso e demorado. Várias tentativas foram feitas para desenvolver novas ferramentas de diagnóstico para vírus (incluindo bacteriófagos) como força atômica (AFM) a microscopia20, interferometria21, eletroquímica22e sensor sistema23, 24. um monte de trabalho tem sido focado em biosensores devido a suas vantagens como sendo capaz de medição em tempo real,15,25, altamente sensível e fácil de operar. Um tipo específico de biosensor baseia-se em mudanças na capacitância. Estes biosensores capacitivos são os sensores eletroquímicos que medem mudanças nas propriedades dielétricas quando um analito interage com um elemento de biorecognition na superfície do sensor, causando uma diminuição da capacitância2,4 . Biosensores capacitivos têm sido utilizados para a detecção de vários analitos como antígenos, anticorpos, proteínas e heavy metal íons6,26,,27,28. Estes tipos de biosensores têm muitas vantagens como inerente rapidez, alta sensibilidade, simplicidade, baixo custo, fácil manipulação e medição em tempo real sem rotulagem29.
O método descrito neste documento destina-se a permitir a detecção e quantificação de baixo-abundantes biomoléculas em amostras altamente complexas, sem a necessidade de usar qualquer rotulagem. Em particular, a técnica é mais útil na faixa de atto-picograma de biomoléculas, onde outros instrumentos comercialmente existentes não conseguem dosar com precisão seu alvo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:753px;" width="754">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Cover slips</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:224px;">102222</td>
			<td style="width:167px;">protein stamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-500ML</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:147px;">Branson Ultrasonic</td>
			<td>BRANSONIC M1800- E</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648-100ML</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EtOH</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>1009836010</td>
			<td>rinsing/cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glutaraldehyde</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-100ML</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acetone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850-1L-M</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2SO4</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741-100ML</td>
			<td>piranha solution</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2O2</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-500ML</td>
			<td>piranha solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tyramine</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T90344-5G</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CompactStat</td>
			<td style="width:147px;">Ivium Technologies</td>
			<td>CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Platinum Counter Electrode Kit</td>
			<td style="width:147px;">Equilabrium</td>
			<td>AFCTR5</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference Electrode</td>
			<td style="width:147px;">Equilabrium</td>
			<td>RREF0021</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acryloyl chloride</td>
			<td style="width:147px;">EMD Millipore</td>
			<td>8.00826.0100</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">triethylamine</td>
			<td style="width:147px;">EMD Millipore</td>
			<td>8.08352.0100</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">toluene</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-100ML</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-hydroxymethyl acrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>245801-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">poly ethylene glycol-400-dimethacrylate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>409510-250ML</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896-50G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV polymerizator</td>
			<td style="width:147px;">Dymax</td>
			<td style="width:224px;">Dymax 5000ECE</td>
			<td>UV-polymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168777-1EA</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1-dodecanethiol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>471364-100ML</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-hydroxymethylacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>245801-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-isopropylacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>415324-50G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-500G</td>
			<td>cross-linking monomer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetrametyhlethyldiamine (TEMED)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td>catalyst</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ammonium persulphate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Capacitive biosensor</td>
			<td style="width:147px;">CapSenze</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:147px;">Merck</td>
			<td>1042011000</td>
			<td>regeneration buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>regeneration buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;&#8226; 2H2O</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>567547-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4&#160;&#8226; 2H2O</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>567549-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DELPHI correlative light and electron microscope</td>
			<td style="width:147px;">Phenom-World</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capacitive gold electrodes</td>
			<td>CapSenze Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#39;-azobis(2-methypropionitrile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441090-25G</td>
			<td>photo-initiator</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">CapSenze Smart Software</td>
			<td style="width:147px;">CapSenze Biosystems</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td style="width:167px;">software program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasensitive detection of biomarkers by using a molecular imprinting based capacitive biosensor

A capacidade de detectar e quantificar biomoléculas em soluções complexas sempre foi muito procurada dentro da ciência natural; sendo usado para a detecção de biomarcadores, contaminantes e outras moléculas de interesse. Uma técnica comumente utilizada para este fim é a enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA), onde muitas vezes um anticorpo é direcionado a uma molécula-alvo específico, e um segundo anticorpo marcado é utilizado para a detecção do anticorpo primário, permitindo a quantificação absoluta da biomolécula sob estudo. No entanto, o uso de anticorpos como elementos de reconhecimento limita a robustez do método; como faz a necessidade do uso de moléculas rotuladas. Para superar essas limitações, impressão molecular foi implementado, criação de sites de reconhecimento artificial complementar à molécula de modelo e obsoleting a necessidade do uso de anticorpos para ligação inicial. Além disso, para maior sensibilidade, o anticorpo secundário marcado pode ser substituído por biosensores depender a capacitância para a quantificação da molécula alvo. Neste protocolo, descrevemos um método para rapidamente e sem rótulo detectar e dosar baixo-abundantes biomoléculas (proteínas e vírus) em amostras complexas, com uma sensibilidade que é significativamente melhor do que os sistemas de deteção comumente usados, tais como o ELISA. Isto é tudo mediado por impressão molecular em combinação com um biossensor de capacitância.

Seguindo o protocolo, de acordo com o esquema na Figura 1, um eletrodo de ouro nua será gravado com um modelo, que representa a estrutura de um biomacromolecule. Este eletrodo pode ser aplicado em um biossensor capacitivo (Figura 2), permitindo que o aplicativo estável de um modelo para o eletrodo e a medição de mudanças na capacitância mediante vinculação do modelo.
Uma representação esquemática do biosensor capacitivo é mostrada na Figura 2. A bomba de centris, que é responsável pela injeção contínua de buffer de execução (fosfato 10 mM, pH 7,4) e o buffer de regeneração (25mm glicina-HCl, pH 2.5) durante a regeneração dentro da célula de fluxo, pode ser vista claramente na figura. A célula de fluxo consiste em trabalhar, referência e eletrodos de contador. A válvula de injeção é composta de soluções padrão de proteína/bacteriófago, que estão de passagem o desgaseificador primeiro e então injetado sequencialmente no sistema. Tão logo as soluções atingem o eletrodo de trabalho inserido na célula de fluxo, o resultado é monitorado em tempo real. Os valores de capacitância podem ser registrados, seguindo o sensorgrams na tela do computador.
Figura 3 e Figura 4 mostram as diferenças entre a superfície dos eléctrodos de ouro desencapados e imprimidas. Esta etapa de caracterização é importante para garantir que existem cavidades poliméricas, vistas como rugosidade na superfície do eléctrodo após a programação. Além de SEM, existem também outros métodos de caracterização incluindo AFM, medições de ângulo de contato, etc., que podem ser usados para caracterizar a superfície após a programação de elipsometria. Desta forma, pode ser assegurado que o processo de impressão é bem sucedido e que as cavidades modelo são formadas na superfície. Dentro dessas cavidades, o modelo pode vincular com afinidade e alta especificidade.
Depois de injectar das soluções-padrão do sistema capacitivo, uma média das cinco últimas leituras foi calculada automaticamente pelo software, e os gráficos de calibração foram obtidos plotando a mudança na capacitância vs. a concentração do analito. A diminuição da capacidade registrada surgiu a ligação do modelo. As mais moléculas que se ligam ao eléctrodo de ouro de superfície, maior a redução da capacidade total, de acordo com o princípio geral de medição capacitiva. Figura 5 e Figura 6 mostram que com o aumento da concentração do analito, a ΔC aumenta conforme o esperado. A gama dinâmica (entre os quais é o intervalo de concentração onde o sistema é útil para a detecção de um alvo específico) e o limite de detecção (LOD) podem ser avaliadas através da análise desses gráficos. De acordo com a Figura 6, o biosensor capacitivo do bacteriófago imprimido pode detectar bacteriófagos na faixa de concentração de 101 - 105 pfu/mL, com um valor LOD de pfu/mL 10 neste estudo. Tanto a Figura 5 e Figura 6 também destacar a necessidade de medir a curva de calibração no mesmo intervalo necessário para a concentração de modelo deve, desde que a linearidade da regressão pode variar mais as concentrações ( Figura 5), ou ter inclinações diferentes (Figura 6). Também note que devido as baixas concentrações utilizadas, o sistema é bastante sensível às flutuações (turbidez da amostra, projecto de ar, etc.), e portanto, é recomendável executar pelo menos triplica para reduzir o potencial de outliers, incluindo . Pela mesma razão, o desvio-padrão pode ser bastante significativo para amostras altamente diluídas, como visto na Figura 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig1.jpg"> Figura 1 . Representação esquemática do método de impressão microcontact. (A) preparação de lamínulas de vidro (selos de modelo), (B) preparação dos eléctrodos de ouro capacitivos, (C) microcontact impressão do modelo para a superfície do eletrodo de ouro através de UV-polimerização e (D) remoção do modelo da superfície do eletrodo (reproduzido do Ertürk et al, biotecnologia relatórios 2014 (3): 65-72, com permissão). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig2.jpg"> Figura 2. Representação esquemática do biosensor capacitiva. O layout geral do biosensor capacitivo utilizado neste estudo (reproduzido do Ertürk et al, biotecnologia relatórios 2014 (3): 65-72, com permissão). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig3.jpg"> Figura 3. Microscopia eletrônica de varredura de proteína impresso eletrodos. Imagens SEM do (A), um eletrodo de ouro desencapado (barra de escala = 20 µm), e (B), uma proteína impresso eletrodo capacitivo de ouro (barra de escala = 10 µm). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig4.jpg"> Figura 4. Microscopia eletrônica de varredura do bacteriófago impresso eletrodos. Imagens SEM de um eletrodo de ouro desencapado (barra de escala = 20 µm) (A), e um bacteriófago impresso capacitivo eletrodo de ouro em diferentes ampliações (6600 x, barra de escala = 10 µm) (B) e 11, 500 X, escala bar = 5 µm) (C); as setas denotam aderidos bacteriófagos). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig5.jpg"> Figura 5. Efeito de composição do tampão para gráficos de calibração. Gráfico de calibração mostrando a mudança na capacitância vs uma concentração de proteína em óptimas condições (executando Buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; Buffer de regeneração: 25mm glicina-HCl, pH 2.5 incluindo 50mm Tween-20; Taxa de fluxo: 100 µ l/min, volume de amostra: 250 µ l; T: 25 ° C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig6.jpg"> Figura 6. Curva de calibração representante para grandes macromoléculas. Gráfico de calibração que mostra a mudança na capacitância vs concentração do bacteriófago em óptimas condições (executando Buffer: fosfato 10 mM, pH 7,4; Buffer de regeneração: 25mm glicina-HCl, pH 2.5 incluindo 50mm Tween-20; Taxa de fluxo: 100 µ l/min, volume de amostra: 250 µ l; T: 25 ° C) <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig6large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de baixas moléculas abundantes em soluções complexas usando molecular imprinting em combinação com um biossensor de capacitância.

Detecção ultra-sensível de biomarcadores usando um Imprinting Molecular baseado Biosensor capacitivo

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

ultrasensitive-detection-biomarkers-using-molecular-imprinting-based

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K visualizações.  Lund University. Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de baixas moléculas abundantes em soluções complexas usando molecular imprinting em combinação com um biossensor de capacitância.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinação de adesivos de fita baseada em amostragem e de fluorescência In situ Hibridação para detecção rápida de Salmonella On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Imunologia e Infecção

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent &#39;Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

Detecção de translocação Toxina no Citosol host por ressonância plasmon de superfície

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

Detecção de Leucócitos Humanos Antigen Biomarkers no cancro da mama Utilizando tecnologia de biossensores livre-Label

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

Deteção de cópia baixa número de DNA Viral integrado formado por In Vitro infecção de hepatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous aspiration of cells and/or microorganisms from palpable masses, organs or effusions (fluid accumulation in a body cavity) using a thin needle similar to the regular needle used for the venous puncture. The material collected by FNA is in general highly cellular, and the retrieved aspirate is then smeared, air dried, wet-fixed, stained and observed under a microscope. In the clinical context, FNA is an important diagnostic tool that serves as a guide to the appropriate therapeutic management. Because it is simple, fast, minimally invasive and requires limited investment in the laboratory and human resources, it is extensively used by veterinary practitioners, mostly in domestic, but also in farm animals. In studies using animal models, FNA has the advantage that it can be performed repeatedly in the same animal, enabling longitudinal studies through the collection of cells from tumors and organs/tissues over the course of the disease. In addition to routine microscopy, retrieved material can also be used for immunocytochemistry, electron microscopy, biochemical analysis, flow cytometry, molecular biology or in vitro assays. FNA has been used to identify the protozoan parasite Trypanosoma brucei in the gonads of infected mice, opening the possibility for a future diagnosis in cattle.

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration is a technique, whereby cells are obtained from a lesion or organ using a thin needle. Aspirated material is smeared, stained and examined under a microscope for diagnosis or used for molecular biology, cytometry or in vitro analysis. It is cheap, simple, quick and causes minimal trauma.