אנו מודים חנין B. רייצ'ל, אלחנדרו יאנוס-Chea לקבלת סיוע טכני. אנו מודים אנתוני ט Maurelli, בריאן פ הארלי, אלסיו פאסנו, ברט אי Swierczewski ו בובי Cherayil על זנים השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה K22AI104755 גרנט מחלות זיהומיות (C.S.F.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

1. הכנת נוגדנים
<ol><li>מלחי מרה בינוני: כדי להכין ציר סויה tryptic (TSB) המכיל מלחי מרה 0.4% (משקל/נפח), resuspend 200 מ ג של מלחי מרה ב 50 מ ל TSB בלוק. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. הפוך בינוני טריים מדי שבוע. הערות: מלחי מרה בשימוש שגרתי הוא תערובת 1:1 של cholate נתרן, סודיום deoxycholate מבודד gallbladders ovine ושור. כפי שמתואר בעבר4, הנוכחות של גלוקוז היה צורך מלח מרה-induced ביופילמים. TSB הוסיפה גלוקוז ביחס מרק לוריא-Bertani (LB); לכן, היה מספיק כדי לגרום ביופילמים שיגלה , פתוגנים אחרים המעית מנותח. בהתאם לחיידקים להיות מנותח, ריכוזי גלוקוז שונים או דרישות סוכר שונים יש צורך בהזמנה.</li>
	<li>0.5% w/v קריסטל ויולט במים: להמיס 2.5 גר' קריסטל ויולט במים מזוקקים 500 מ"ל. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>Concanavalin A (ConA) מצומדת כדי fluorescein isothiocyanate (FITC): לשקם את המניה ב- 1 x PBS. לדלל את המניה 10 mg מרוכז עם μL 400 ל- PBS 1 x כדי ריכוז סופי של 25 µg/mL, להגן מפני אור.</li>
	<li>PBS + גלוקוז: להמיס 0.2 גרם גלוקוז ב- PBS 1 x 10 מ"ל (2% w/v גלוקוז הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.</li>
	<li>PBS + מלחי מרה: להמיס 40 מ"ג ב- PBS 1 x 10 מ"ל (0.4% w/v מלחי מרה הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.</li>
	<li>PBS + גלוקוז, מלחי מרה: להמיס מלחי מרה 40 מ"ג ו- 0.2 גר' גלוקוז ב- PBS 1 x 10 מ"ל (מלחי מרה w/v 0.4% ו- 2% w/v גלוקוז הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.</li>
	<li>להכין פלטות אגר ליברות.</li>
	<li>פורמלדהיד/גלוטראלדהיד תיקון: 810 להוסיף µL פורמלדהיד (37% מניות פתרון, הריכוז הסופי של 3%) ו- 125 µL גלוטראלדהיד (25% מניות פתרון, הריכוז הסופי של 0.25%) כדי PBS 1 x 14 מ ל. לערבב היטב ולאחסן ב 4 º C. התיקון צריך להיות קר לשימוש הנכון. התראה: התיקון הוא רעיל ואינו דורש סילוק פסולת מסוכנת.</li>
	<li>פתרון antifade mountant: להשתמש בפתרון antifade mountant המכיל 4, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כתם לעכב photobleaching דוגמאות מיקרוסקופ immunofluorescent בעת fluorescently מכתים את ה-DNA של החיידק.</li>
</ol>2. הכנה של חיידקים
<ol><li>לגדול תרבויות לילה של זנים חיידקי להיבדק ע י מזריקים 3 מ"ל של TSB עם מושבה בודדת, מבודד היטב בשפופרת תרבות סטרילי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-225 rpm עבור לילה דגירה (16-24 שעות). הערה: זנים צריך להיות restreaked מן המקפיא מניות כל 2 כדי 4 שבועות, מתוחזק על צלחות לא ישן יותר משבועיים.</li>
</ol>3. מוצק-שלב הדבקות Assay
הערה: זו assay מכמתת חסיד חיידקים באמצעות שיטת צלחת 96-ובכן. חיידקים גדלים באופן סטטי לוחות שטוחים. הכביסה מתבצע כדי להסיר חיידקים שאינם מחסידי, חיידקים חסיד מוכתמים קריסטל ויולט. הכתם קריסטל ויולט נקשר פפטידוגליקן בתוך הקיר תא החיידק, יכול להיות solubilized באמצעות אתנול. המספר של חיידקים חסיד נקבע בהתבסס על קריסטל ויולט השמירה.
<ol><li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + מלחי מרה (BS).</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
	<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).</li>
	<li>בצלחת 96-ובכן סטרילי, נקי, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג מדיה (TSB ו TSB + BS) להיבדק.</li>
	<li>להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו משלוש בארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.</li>
	<li>תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.</li>
	<li>שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שאמצעי שליטה ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים אם ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.</li>
	<li>הסר את המדיום תרבות באמצעות קו ואקום על ידי הטיית בעדינות את הצלחת ואת לאט כ רפה בעברית המדיום בקצה התחתון של הבאר. יש להקפיד לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חיידקי חסיד ממוקם על משטח הפלסטיק. אם EPS מטריקס הופק במהלך זמן הדגירה, המטריצה ניתן לאבחן כמו התמיסה לבן. נא לא להפריע המטריקס EPS.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעם אחת עם 200 µL PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.</li>
	<li>היפוך את הצלחת לייבש. הקדישו לפחות 20 דקות לייבוש. הערה: מאז biofilm יש לייבשם ביסודיות לפני צביעת, הפרוטוקול ניתן מושהה בשלב זה לכמה שעות או אפילו לילה. זמן ייבוש נוסף לא תשנה את ההליך מכתימים בזמן ייבוש לא שלם ישפיעו על כימות של תוצאות, הפארמצבטית.</li>
	<li>להוסיף 150 µL של 0.5% קריסטל ויולט. כל ניסיוני ושליטה טוב.</li>
	<li>תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לשטוף את בארות פעם אחת עם 400 µL של מים מזוקקים. אמצעי האחסון הוסיף מסייע להסיר את הכתם שיורית קריסטל ויולט צדי הבארות. להסיר בכביסה עם הקו ואקום.</li>
	<li>לשטוף את בארות חמש פעמים עם 200 µL של מים מזוקקים. להסיר בכביסה עם הקו ואקום. הערה: שטיפה חשוב כמת. כאשר הבארות ריק הם ברורים מים מזוקקים אינם מכילים כל כתם שיורי קריסטל ויולט, המשך לשלב הבא.</li>
	<li>היפוך את הצלחת לייבש, מוגן מפני אור. להבטיח ייבוש מוחלט של צלחת כאמור לעיל.</li>
	<li>Destain הבארות עם 200 µL של 95% אתנול. דגירה על הלוחית אהבת בשייקר למשך 30 דקות. כדי למנוע אידוי, במיוחד בטמפרטורות גבוהות יותר, לבצע שלב זה ב 4 º C.</li>
	<li>שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר540. הערה: אורך הגל עבור ספיגת המרבי של קריסטל ויולט נמצא ליד 590 ננומטר. בספרות מדווח על טווח שבין יתר540 - OD5954,13,14,15,16 עבור ספיגת קריסטל ויולט; כך לבחור אורך גל הזמינים בהתבסס על הקורא צלחת.</li>
</ol>4. EPS מטריצת זיהוי
הערה: מבחני חינם אלה לכמת והמחש EPS. בשני, EPS מזוהה באמצעות לקטין לאגד סוכרים. החלבון fluorescently מצומדת מאפשר כימות (שלב 4.1) או הפריט החזותי (שלב 4.2).
<ol><li>גילוי חצי כמותית של EPS<ol>
<li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
		<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (1:50 דילול).</li>
		<li>בצלחת 96-ובכן סטרילי, שחור, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג בינוני להיבדק. להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו הבארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.</li>
		<li>תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.</li>
		<li>להעביר את המדיום תרבות צלחת ברור 96-ובכן עם פיפטה, באופן אידיאלי פיפטה רב-ערוצי. להיות זהירים כדי לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חסיד ו/או EPS הממוקמת על משטח הפלסטיק. להפריש.</li>
		<li>לתקן את הצלחת שחור למשך 15 דקות ב RT באמצעות µL 200/טוב של הפורמלדהיד/גלוטראלדהיד ב- 1 x PBS.</li>
		<li>ואילו האוכלוסייה חסיד מתקן, להעריך את השבר supernatant מהשלב 4.1.6. שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שאמצעי שליטה ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי.<ol>
<li>לחלופין, ניתן לבצע וזמינותו כולו בצלחת התחתונה ברור שחור. בנסיבות אלה, ניתן לרשום את הערכים600 OD, המדיום תרבות יכול להימחק לאחר מכן לפני שתמשיך לשלב 4.1.7. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים במקרה ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הסר את התיקון והיפטרו ב פסולת מסוכנת.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום על ידי הטיית בעדינות את הצלחת לאט כ רפה בעברית לשטוף את קצה התחתון של הבאר.</li>
		<li>להוסיף 150 µL/טוב של 25 µg/mL ConA-FITC ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.</li>
		<li>בעדינות לשטוף פעמיים עם µL 200 ל- PBS.</li>
		<li>להוסיף 150 µL ל- PBS מכל קידוח. להקליט את זריחה-488 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מיקרוסקופיה קונפוקלית ויזואליזציה של ייצור EPS, חישוב עובי biofilm<ol>
<li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
		<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).</li>
		<li>להגדיר את צלחת 24-ובכן סטרילי עם 12 מ מ סטרילי סביב coverslips זכוכית דקה. להוסיף µL 400/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג בינוני להיבדק.</li>
		<li>להוסיף 400 µL של תרבות חוסנו בארות כפילויות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה.</li>
		<li>תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.</li>
		<li>באופן חזותי אשר הצמיחה TSB תנאי, צמיחה, EPS התמיסה (לבן) ב- TSB + מצב BS, אין צמיחה ו/או לבן התמיסה בבארות שליטה סטרילי. להסיר את supernatants.</li>
		<li>לתקן למשך 15 דקות ב RT באמצעות µL 200/טוב של פורמלדהיד/גלוטראלדהיד פתרון ב- 1 x PBS.</li>
		<li>להסיר את התיקון, להיפטר של פסולת מסוכנת.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.</li>
		<li>להוסיף 150 µL/טוב של 25 µg/mL ConA-FITC ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.</li>
		<li>בעדינות לשטוף פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS.</li>
		<li>הר antifade mountant פתרון עם דאפי. הערה: הפתרון הוא פתרון הר מוכנות מראש, המבוססים על גליצרול המכיל דאפי לשמירה על התווית פלורסנט בזמן בו זמנית מכתימה את ה-DNA בתאי חיידקים להמחשת כמו counterstain. בצע את הנחיות והמלצות של ערכת עבור הדגירה פעמים לפני הדמיה דגימות. ניתן לבצע את דאפי מכתים הליך לפני החלת הפתרון antifade mountant שאינו מכיל דאפי.</li>
		<li>להעריך על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. במיקרוסקופ קונפוקלי, הגדר את הלייזר 495 ננומטר/519 nm עירור/פליטה להמחשת FITC. הגדר לייזר השני 360 nm/460 nm עירור/פליטה להמחיש דאפי. אתר את biofilm על-ידי התמקדות בערוץ דאפי. להשתמש בערוצים דאפי והן FITC כדי לקבוע את עובי מלא ולהגדיר העליון והדמיה נמוך גבולות. שיא מלא עובי Z-מחסנית תמונות על-ידי לכידת תמונות כל מיקרומטר 0.25 לאחר הגדרת ההיקפים העליון והתחתון של הערימה-z. לקבלת מידע נוסף אודות מיקרוסקופיה קונפוקלית, נא להפנות פרסומים על-ידי פדוק. et al. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>בנייה מחדש של תמונות תלת-ממד ב- ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) כדי להמחיש את מלא ביופילמים ולחשב את עובי biofilm. העובי הממוצע השיג עבור ס flexneri מלח מרה biofilms המושרה היה מיקרומטר 144.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. פיזור Assay
הערה: ב- assay הזה, פירוק של biofilm באמצעות פיזור חיידקים מזוהה. כאן, biofilms בוגרת נקבעו, לאחר מכן (בדרך כלל ביום למחרת), התקשורת, הוחלפו PBS או שיושלם PBS. הרכיב supernatant מוערך אז כדי quantitate את המספר של חיידקים יש לזהויות biofilm.
<ol><li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
	<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).</li>
	<li>בצלחת 96-ובכן סטרילי, נקי, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג מדיה להיבדק.</li>
	<li>להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו משלוש בארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.</li>
	<li>דגירה באופן סטטי את הצלחת. בשביל 4-24 h ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לפני שתמשיך, לחמם את PBS, PBS + גלוקוז, PBS + מלחי מרה, ואת PBS + מלחי מרה + הגלוקוז ל- 37 מעלות צלזיוס. להכין את אלה ריאגנטים טריים מדי יום.</li>
	<li>שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שהמדיום ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים אם ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.</li>
	<li>הסר את המדיום תרבות באמצעות שורת ואקום. יש להקפיד לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חסיד ממוקם על משטח הפלסטיק.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.</li>
	<li>החלף לשטוף את µL 130/טוב של הבאות לתוך שלוש בארות: PBS, PBS + גלוקוז, PBS + מלחי מרה, ו- PBS + מלחי מרה + גלוקוז. נוגדנים אלה חייב להיות מראש ומחוממת ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר בזהירות את הצלחת מן החממה 37 º C. להעביר את supernatants צלחת 96-ובכן טרי, סטרילי.</li>
	<li>בעזרת בלוק צלחת או דילול 96-ובכן, להכין 10-fold (1:10) דילולים טורי של תגובת שיקוע לתוך PBS סטרילי. הערה: הסדרה דילול צריך לנוע בין מדולל 10-6 בהתאם המתח חיידקי להיבדק. ניתן לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע טווח דילול אופטימלית.</li>
	<li>צלחת 5 µL של כל דילול על גבי אגר LB באמצעות פיפטה רב-ערוצי נקודה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לספור מושבות על היום הבא, חשבון עבור הגורם דילול בקביעת המושבה שחזור ויוצרים יחידות (CFU). כדי לחשב את פיזור אחוז ביחס 1 x שליטה PBS (מוגדר ב- 100%), לחלק את התאוששות CFU כל תנאי הטיפול על ידי השחזור CFU 1 x PBS הבקרה מדגם. הערה: השגרה לוחות מדיה עבור חיידקים מזן עניין יכול גם לשמש. לדוגמה, יכול להיות מצופה שיגלה על צלחות קונגו אדום. ודא הצלחות יבש על טכניקות ספוט-ציפוי המתאים.</li>
</ol>

המחברים יש אין גילויים.

ניתוח של ביופילמים הוא מאתגר בשל אופיו הדינמי של biofilms ולהבדלים בין זנים, חומרים, מעבדות מבחני. . הנה, מספר אסטרטגיות מוצגים כדי לקבוע ביופילמים ב פתוגנים המעית בעקבות חשיפה מלחי מרה עם תובנה ניסיוני הניתנים לקידום הפארמצבטית. ישנם שיקולים נוספים כדי להבטיח הפארמצבטית. בראש ובראשונה, אנו ממ...

ביופילמים היא אסטרטגיית חשוב הישרדות חיידקי הנגרמת במהלך בתנאי סביבה קשים. חשיפה תרכובות אחרים כמו אנטיביוטיקה או שינויים מזין או זמינות חמצן גורם לחוץ בחיידק זה ניתן להקל באמצעות ביופילמים. ממבנה biofilm מאופיין על ידי חיידקי מצורף משטח או חיידקים אחרים, והוא מלווה את הפרשת מטריקס EPS מורכב בעיקר סוכרים1,2,3. ביופילמים הוא תהליך דינמי שבו מפל של אירועים במרקחת היווצרות בוגרת הקהילה חיידקי חסיד1,2,3. החיידקים מייצרים adhesins כדי להקל על קובץ מצורף מוקדם תוך הזזת adhesin ביטוי גנים פרופילים כדי לחזק את הקובץ המצורף במהלך ההבשלה biofilm. במקביל, ייצור EPS מתרחשת את המעיל הקהילה חיידקי במטריצה כדי להגן על התאים מפני הלחץ הראשוני. חיידקים בתוך את biofilm הם לאט גדל; ככזה, יטחנו את רוב אנטיביוטיקה לא יעילה. יתר על כן, הגידול איטי חוסך אנרגיה עד שינוי המצב לטובת התפתחות חיידקים1,2,3. אחרי התנאים הקשים חלפו, חיידקים לפזר את biofilm והמשך חיים פלנקטוניים1,2,3. באופן מסורתי, biofilms הם נצפו על משטחים, מייצגים אתגר קליני מתמשך בשל זיהום המאגרים המצויים על צנתרים ו בדיור התקנים1,2,3.
ביופילמים תוארה לאחרונה מספר גורמים מחוללי המעית; חיידקים להדביק את המעי הדק או הגס4. עבור מינים שיגלה , זיהום מתרחש במעי הגס האנושי לאחר מעבר דרך רוב מערכת העיכול. במהלך המעבר דרך המעי הדק, שיגלה הוא נחשף מרה; חומר משפילים השומנים ניקוי ומופרש אל המעי כדי להקל על עיכול שומנים בזמן בו זמנית להרוג חיידקים רוב5. פתוגנים המעית יכולת ייחודית להתנגד ההשפעות אחרים של מרה6. הניתוח האחרונה שלנו מנוצל vivo-כמו שילובים של גלוקוז ושל מלחי מרה להפגין ביופילמים חזקים ב ס flexneri , כמו גם מינים אחרים של שיגלה, פתוגניים Escherichia coli, ו סלמונלה4. בעבר, סלמונלה enterica serovar Typhi הוצגה כדי ליצור ממבנה biofilm הנוצרות על-ידי המרה עקב קולוניזציה ייחודי של כיס המרה במהלך זיהום כרוני7,8,9, 10. בנוסף, מחקר קודם עם ויבריו11, קמפילובקטר12 הפגינו ביופילמים בתגובה מרה. לכן, הבדיקות מורחב התצפיות היווצרות biofilm מרה-induced פתוגנים אחרים, מסייעות לקיים הפגנה של פתוגן המעית שנשמרת תגובה מרה. בניגוד כרונית biofilms שבו שעתוק גנים חיידקיים מוגבל, הזדקנות ביולוגית התא יכול להתרחש1,2,3, אנו מציעים כי biofilm מרה-induced המעית הוא יותר ארעי בטבע. זה ארעיים, biofilm מידבק ולחתימה על ידי פירוק מהיר (כפי שניתן לראות ב וזמינותו נפיצה), משופרת ביטוי גנים התקפה אלימה נצפתה ב biofilm האוכלוסייה4,6. 
כמו ביופילמים הוא תהליך דינמי הגיוון הרב והשימוש של מלחי מרה כמו גורם ייזום היה רק תיאר לאחרונה גורמים מחוללי המעית ביותר, הכלים ואת טכניקות המשמשות הם יישומים ייחודיים ויצירתיים של שיטות מסורתיות. כך, המובאים כאן הם שלוש אסטרטגיות ללא תשלום כדי לכמת את מספר מאפיינים חשובים של מלח מרה-induced ביופילמים, כולל חיידקי הדבקות, הפקה של המטריקס EPS, פיזור של חיידקים קיימא מ biofilm. טכניקות אלה כבר נעזרו בעיקר למחקר עם שיגלה; לכן, הערכה של פתוגנים המעית אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה. יחד עם זאת, נתונים חיוביים של כל שלושת מבחני תמיכה זיהוי של biofilms ולהקים לשחזור פרוטוקולים עבור מלח מרה-induced ביופילמים.

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bile Salts</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 12mm, round</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flourescent plate reader</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal or Fluorescent Microscope</td><td>Nikon A1 confocal microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Shaking Incubator</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Plate Incubator</td><td>Thermolyne Series 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

ביופילמים הוא תהליך דינמי, multistage, המתרחשת אצל חיידקים תחת תנאי סביבה קשים או בזמנים של מתח. עבור המעית פתוגנים, תגובה משמעותית מתח מושרה במהלך ההעברה במערכת העיכול ועל מרה חשיפה, מרכיב נורמלי של מערכת העיכול האנושית. כדי להתגבר על ההשפעות אחרים של מרה, פתוגנים המעית רבים יוצרים ממבנה biofilm המשוערות להתיר הישרדות כאשר הם מגיעים דרך המעי הדק. כאן אנו מציגים מתודולוגיות להגדרת ביופילמים דרך הדבקות מוצק-שלב מבחני וכן זיהוי מטריצה חוץ-תאית חומר פולימריים (EPS) ופריטים חזותיים. יתר על כן, הערכת פיזור biofilm מוצג כדי לחקות את הניתוח של אירועים מפעילה שחרור של חיידקים במהלך תהליך זיהום. קריסטל ויולט מכתים משמש כדי לזהות חיידקים חסיד assay הדבקות תפוקה גבוהה 96-ובכן צלחת. הערכת ייצור EPS נקבעת על-ידי שני מבחני, כלומר מיקרוסקופ מכתים של מטריקס EPS, ניתוח כמותי למחצה עם לקטין איגוד fluorescently מצומדת רב-סוכר. לבסוף, פיזור biofilm נמדדת דרך המושבה ספירות, ציפוי. נתונים חיוביים של מספר מבחני תמיכה אפיון biofilms and יכול להיות מנוצל כדי לזהות מלח מרה-induced ביופילמים בתוך זני חיידקים אחרים.

איור 1, ביופילמים הנגרמת ברוב של הגידול שנבדקו פתוגנים המעית שישה הבאים בתקשורת המכיל מלחי מרה. עלייה משמעותית בחיידקים חסיד לאחר חשיפה מלחי מרה הוא ציין זנים כמעט כל נבדק. החריג הוא enteroaggregative e. coli (EAEC); עם זאת, שים לב התבוננות Δaaf מוטציה<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

פרוטוקול זה מאפשר לקורא לנתח מלח מרה-induced ביופילמים בתוך פתוגנים המעית באמצעות גישה רב פנים כדי ללכוד באופי הדינמי של biofilms חיידקי על-ידי הערכת הדבקות, היווצרות מטריצה חוץ-תאית חומר הפולימרים, פיזור.

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Views.  Massachusetts General Hospital. פרוטוקול זה מאפשר לקורא לנתח מלח מרה-induced ביופילמים בתוך פתוגנים המעית באמצעות גישה רב פנים כדי ללכוד באופי הדינמי של biofilms חיידקי על-ידי הערכת הדבקות, היווצרות מטריצה חוץ-תאית חומר הפולימרים, פיזור.

Video: Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

פרוטוקולים לניתוח זיהום שיגלה בתאי אפיתל המעי הגס

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

מחבר זרקור: התקדמות בהבנה ובמאבק בדלקות שיגלה

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.

ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

<meta charset="utf8"></head><body>מדידת הנדידה והיווצרות הביופילם של חיידקים שונים

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

מדידת הנדידה והיווצרות הביופילם של חיידקים שונים

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

מתודולוגיות לימוד

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

מדידת הנדידה והיווצרות הביופילם של חיידקים שונים

מדידת הנדידה והיווצרות הביופילם של חיידקים שונים