אנו מודים חנין B. רייצ'ל, אלחנדרו יאנוס-Chea לקבלת סיוע טכני. אנו מודים אנתוני ט Maurelli, בריאן פ הארלי, אלסיו פאסנו, ברט אי Swierczewski ו בובי Cherayil על זנים השתמשו במחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה K22AI104755 גרנט מחלות זיהומיות (C.S.F.). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

1. הכנת נוגדנים
<ol><li>מלחי מרה בינוני: כדי להכין ציר סויה tryptic (TSB) המכיל מלחי מרה 0.4% (משקל/נפח), resuspend 200 מ ג של מלחי מרה ב 50 מ ל TSB בלוק. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. הפוך בינוני טריים מדי שבוע. הערות: מלחי מרה בשימוש שגרתי הוא תערובת 1:1 של cholate נתרן, סודיום deoxycholate מבודד gallbladders ovine ושור. כפי שמתואר בעבר4, הנוכחות של גלוקוז היה צורך מלח מרה-induced ביופילמים. TSB הוסיפה גלוקוז ביחס מרק לוריא-Bertani (LB); לכן, היה מספיק כדי לגרום ביופילמים שיגלה , פתוגנים אחרים המעית מנותח. בהתאם לחיידקים להיות מנותח, ריכוזי גלוקוז שונים או דרישות סוכר שונים יש צורך בהזמנה.</li>
	<li>0.5% w/v קריסטל ויולט במים: להמיס 2.5 גר' קריסטל ויולט במים מזוקקים 500 מ"ל. מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>Concanavalin A (ConA) מצומדת כדי fluorescein isothiocyanate (FITC): לשקם את המניה ב- 1 x PBS. לדלל את המניה 10 mg מרוכז עם μL 400 ל- PBS 1 x כדי ריכוז סופי של 25 µg/mL, להגן מפני אור.</li>
	<li>PBS + גלוקוז: להמיס 0.2 גרם גלוקוז ב- PBS 1 x 10 מ"ל (2% w/v גלוקוז הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.</li>
	<li>PBS + מלחי מרה: להמיס 40 מ"ג ב- PBS 1 x 10 מ"ל (0.4% w/v מלחי מרה הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.</li>
	<li>PBS + גלוקוז, מלחי מרה: להמיס מלחי מרה 40 מ"ג ו- 0.2 גר' גלוקוז ב- PBS 1 x 10 מ"ל (מלחי מרה w/v 0.4% ו- 2% w/v גלוקוז הסופי). מסנן לחטא באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. להפוך טרי ביום של שימוש.</li>
	<li>להכין פלטות אגר ליברות.</li>
	<li>פורמלדהיד/גלוטראלדהיד תיקון: 810 להוסיף µL פורמלדהיד (37% מניות פתרון, הריכוז הסופי של 3%) ו- 125 µL גלוטראלדהיד (25% מניות פתרון, הריכוז הסופי של 0.25%) כדי PBS 1 x 14 מ ל. לערבב היטב ולאחסן ב 4 º C. התיקון צריך להיות קר לשימוש הנכון. התראה: התיקון הוא רעיל ואינו דורש סילוק פסולת מסוכנת.</li>
	<li>פתרון antifade mountant: להשתמש בפתרון antifade mountant המכיל 4, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כתם לעכב photobleaching דוגמאות מיקרוסקופ immunofluorescent בעת fluorescently מכתים את ה-DNA של החיידק.</li>
</ol>2. הכנה של חיידקים
<ol><li>לגדול תרבויות לילה של זנים חיידקי להיבדק ע י מזריקים 3 מ"ל של TSB עם מושבה בודדת, מבודד היטב בשפופרת תרבות סטרילי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-225 rpm עבור לילה דגירה (16-24 שעות). הערה: זנים צריך להיות restreaked מן המקפיא מניות כל 2 כדי 4 שבועות, מתוחזק על צלחות לא ישן יותר משבועיים.</li>
</ol>3. מוצק-שלב הדבקות Assay
הערה: זו assay מכמתת חסיד חיידקים באמצעות שיטת צלחת 96-ובכן. חיידקים גדלים באופן סטטי לוחות שטוחים. הכביסה מתבצע כדי להסיר חיידקים שאינם מחסידי, חיידקים חסיד מוכתמים קריסטל ויולט. הכתם קריסטל ויולט נקשר פפטידוגליקן בתוך הקיר תא החיידק, יכול להיות solubilized באמצעות אתנול. המספר של חיידקים חסיד נקבע בהתבסס על קריסטל ויולט השמירה.
<ol><li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + מלחי מרה (BS).</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
	<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).</li>
	<li>בצלחת 96-ובכן סטרילי, נקי, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג מדיה (TSB ו TSB + BS) להיבדק.</li>
	<li>להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו משלוש בארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.</li>
	<li>תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.</li>
	<li>שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שאמצעי שליטה ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים אם ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.</li>
	<li>הסר את המדיום תרבות באמצעות קו ואקום על ידי הטיית בעדינות את הצלחת ואת לאט כ רפה בעברית המדיום בקצה התחתון של הבאר. יש להקפיד לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חיידקי חסיד ממוקם על משטח הפלסטיק. אם EPS מטריקס הופק במהלך זמן הדגירה, המטריצה ניתן לאבחן כמו התמיסה לבן. נא לא להפריע המטריקס EPS.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעם אחת עם 200 µL PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.</li>
	<li>היפוך את הצלחת לייבש. הקדישו לפחות 20 דקות לייבוש. הערה: מאז biofilm יש לייבשם ביסודיות לפני צביעת, הפרוטוקול ניתן מושהה בשלב זה לכמה שעות או אפילו לילה. זמן ייבוש נוסף לא תשנה את ההליך מכתימים בזמן ייבוש לא שלם ישפיעו על כימות של תוצאות, הפארמצבטית.</li>
	<li>להוסיף 150 µL של 0.5% קריסטל ויולט. כל ניסיוני ושליטה טוב.</li>
	<li>תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לשטוף את בארות פעם אחת עם 400 µL של מים מזוקקים. אמצעי האחסון הוסיף מסייע להסיר את הכתם שיורית קריסטל ויולט צדי הבארות. להסיר בכביסה עם הקו ואקום.</li>
	<li>לשטוף את בארות חמש פעמים עם 200 µL של מים מזוקקים. להסיר בכביסה עם הקו ואקום. הערה: שטיפה חשוב כמת. כאשר הבארות ריק הם ברורים מים מזוקקים אינם מכילים כל כתם שיורי קריסטל ויולט, המשך לשלב הבא.</li>
	<li>היפוך את הצלחת לייבש, מוגן מפני אור. להבטיח ייבוש מוחלט של צלחת כאמור לעיל.</li>
	<li>Destain הבארות עם 200 µL של 95% אתנול. דגירה על הלוחית אהבת בשייקר למשך 30 דקות. כדי למנוע אידוי, במיוחד בטמפרטורות גבוהות יותר, לבצע שלב זה ב 4 º C.</li>
	<li>שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר540. הערה: אורך הגל עבור ספיגת המרבי של קריסטל ויולט נמצא ליד 590 ננומטר. בספרות מדווח על טווח שבין יתר540 - OD5954,13,14,15,16 עבור ספיגת קריסטל ויולט; כך לבחור אורך גל הזמינים בהתבסס על הקורא צלחת.</li>
</ol>4. EPS מטריצת זיהוי
הערה: מבחני חינם אלה לכמת והמחש EPS. בשני, EPS מזוהה באמצעות לקטין לאגד סוכרים. החלבון fluorescently מצומדת מאפשר כימות (שלב 4.1) או הפריט החזותי (שלב 4.2).
<ol><li>גילוי חצי כמותית של EPS<ol>
<li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
		<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (1:50 דילול).</li>
		<li>בצלחת 96-ובכן סטרילי, שחור, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג בינוני להיבדק. להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו הבארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.</li>
		<li>תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.</li>
		<li>להעביר את המדיום תרבות צלחת ברור 96-ובכן עם פיפטה, באופן אידיאלי פיפטה רב-ערוצי. להיות זהירים כדי לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חסיד ו/או EPS הממוקמת על משטח הפלסטיק. להפריש.</li>
		<li>לתקן את הצלחת שחור למשך 15 דקות ב RT באמצעות µL 200/טוב של הפורמלדהיד/גלוטראלדהיד ב- 1 x PBS.</li>
		<li>ואילו האוכלוסייה חסיד מתקן, להעריך את השבר supernatant מהשלב 4.1.6. שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שאמצעי שליטה ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי.<ol>
<li>לחלופין, ניתן לבצע וזמינותו כולו בצלחת התחתונה ברור שחור. בנסיבות אלה, ניתן לרשום את הערכים600 OD, המדיום תרבות יכול להימחק לאחר מכן לפני שתמשיך לשלב 4.1.7. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים במקרה ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הסר את התיקון והיפטרו ב פסולת מסוכנת.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום על ידי הטיית בעדינות את הצלחת לאט כ רפה בעברית לשטוף את קצה התחתון של הבאר.</li>
		<li>להוסיף 150 µL/טוב של 25 µg/mL ConA-FITC ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.</li>
		<li>בעדינות לשטוף פעמיים עם µL 200 ל- PBS.</li>
		<li>להוסיף 150 µL ל- PBS מכל קידוח. להקליט את זריחה-488 ננומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מיקרוסקופיה קונפוקלית ויזואליזציה של ייצור EPS, חישוב עובי biofilm<ol>
<li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
		<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).</li>
		<li>להגדיר את צלחת 24-ובכן סטרילי עם 12 מ מ סטרילי סביב coverslips זכוכית דקה. להוסיף µL 400/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג בינוני להיבדק.</li>
		<li>להוסיף 400 µL של תרבות חוסנו בארות כפילויות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה.</li>
		<li>תקופת דגירה של 4-24 h ב 37 ° C באופן סטטי.</li>
		<li>באופן חזותי אשר הצמיחה TSB תנאי, צמיחה, EPS התמיסה (לבן) ב- TSB + מצב BS, אין צמיחה ו/או לבן התמיסה בבארות שליטה סטרילי. להסיר את supernatants.</li>
		<li>לתקן למשך 15 דקות ב RT באמצעות µL 200/טוב של פורמלדהיד/גלוטראלדהיד פתרון ב- 1 x PBS.</li>
		<li>להסיר את התיקון, להיפטר של פסולת מסוכנת.</li>
		<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.</li>
		<li>להוסיף 150 µL/טוב של 25 µg/mL ConA-FITC ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.</li>
		<li>בעדינות לשטוף פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS.</li>
		<li>הר antifade mountant פתרון עם דאפי. הערה: הפתרון הוא פתרון הר מוכנות מראש, המבוססים על גליצרול המכיל דאפי לשמירה על התווית פלורסנט בזמן בו זמנית מכתימה את ה-DNA בתאי חיידקים להמחשת כמו counterstain. בצע את הנחיות והמלצות של ערכת עבור הדגירה פעמים לפני הדמיה דגימות. ניתן לבצע את דאפי מכתים הליך לפני החלת הפתרון antifade mountant שאינו מכיל דאפי.</li>
		<li>להעריך על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. במיקרוסקופ קונפוקלי, הגדר את הלייזר 495 ננומטר/519 nm עירור/פליטה להמחשת FITC. הגדר לייזר השני 360 nm/460 nm עירור/פליטה להמחיש דאפי. אתר את biofilm על-ידי התמקדות בערוץ דאפי. להשתמש בערוצים דאפי והן FITC כדי לקבוע את עובי מלא ולהגדיר העליון והדמיה נמוך גבולות. שיא מלא עובי Z-מחסנית תמונות על-ידי לכידת תמונות כל מיקרומטר 0.25 לאחר הגדרת ההיקפים העליון והתחתון של הערימה-z. לקבלת מידע נוסף אודות מיקרוסקופיה קונפוקלית, נא להפנות פרסומים על-ידי פדוק. et al. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>בנייה מחדש של תמונות תלת-ממד ב- ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) כדי להמחיש את מלא ביופילמים ולחשב את עובי biofilm. העובי הממוצע השיג עבור ס flexneri מלח מרה biofilms המושרה היה מיקרומטר 144.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. פיזור Assay
הערה: ב- assay הזה, פירוק של biofilm באמצעות פיזור חיידקים מזוהה. כאן, biofilms בוגרת נקבעו, לאחר מכן (בדרך כלל ביום למחרת), התקשורת, הוחלפו PBS או שיושלם PBS. הרכיב supernatant מוערך אז כדי quantitate את המספר של חיידקים יש לזהויות biofilm.
<ol><li>להגדיר את שני צינורות 1.5 mL. תווית עם TSB או TSB + BS.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של TSB או TSB + BS הצינורות המתאימים.</li>
	<li>לחסן צינורות עם 20 µL של תרבות לילה (ב- 1:50 דילול).</li>
	<li>בצלחת 96-ובכן סטרילי, נקי, שהונעו, שטופלו תרביות רקמה, להוסיף µL 130/טוב של uninoculated בקרת מדיה משלוש בארות כדי לשמש הפקד ריק. בצע כיוונון משלוש בארות פקד עבור כל סוג מדיה להיבדק.</li>
	<li>להוסיף µL 130/טוב של תרבות חוסנו משלוש בארות, וחזור עד כל התנאים ניסיוני הן מצופה דולר.</li>
	<li>דגירה באופן סטטי את הצלחת. בשביל 4-24 h ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לפני שתמשיך, לחמם את PBS, PBS + גלוקוז, PBS + מלחי מרה, ואת PBS + מלחי מרה + הגלוקוז ל- 37 מעלות צלזיוס. להכין את אלה ריאגנטים טריים מדי יום.</li>
	<li>שימוש בקורא צלחת, להקליט את יתר600. הגדר הבארות שליטה כמו 'blank'. לאשר שהמדיום ברור ללא עדות של עכירות. אם כל עכירות מזוהה, למחוק את הניסוי. הערכים600 OD יכול לשמש כדי לנרמל את הנתונים אם ישנם הבדלים משמעותיים בשיעור צמיחה בין זני חיידקים.</li>
	<li>הסר את המדיום תרבות באמצעות שורת ואקום. יש להקפיד לאסוף את כל המדיום תרבות מבלי לשבש את פעולת האוכלוסייה חסיד ממוקם על משטח הפלסטיק.</li>
	<li>יש לשטוף בעדינות הבארות פעמיים עם 200 µL טוב ל- PBS סטרילי. להסיר בכביסה PBS באמצעות קו ואקום.</li>
	<li>החלף לשטוף את µL 130/טוב של הבאות לתוך שלוש בארות: PBS, PBS + גלוקוז, PBS + מלחי מרה, ו- PBS + מלחי מרה + גלוקוז. נוגדנים אלה חייב להיות מראש ומחוממת ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר בזהירות את הצלחת מן החממה 37 º C. להעביר את supernatants צלחת 96-ובכן טרי, סטרילי.</li>
	<li>בעזרת בלוק צלחת או דילול 96-ובכן, להכין 10-fold (1:10) דילולים טורי של תגובת שיקוע לתוך PBS סטרילי. הערה: הסדרה דילול צריך לנוע בין מדולל 10-6 בהתאם המתח חיידקי להיבדק. ניתן לבצע ניסויים פיילוט כדי לקבוע טווח דילול אופטימלית.</li>
	<li>צלחת 5 µL של כל דילול על גבי אגר LB באמצעות פיפטה רב-ערוצי נקודה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לספור מושבות על היום הבא, חשבון עבור הגורם דילול בקביעת המושבה שחזור ויוצרים יחידות (CFU). כדי לחשב את פיזור אחוז ביחס 1 x שליטה PBS (מוגדר ב- 100%), לחלק את התאוששות CFU כל תנאי הטיפול על ידי השחזור CFU 1 x PBS הבקרה מדגם. הערה: השגרה לוחות מדיה עבור חיידקים מזן עניין יכול גם לשמש. לדוגמה, יכול להיות מצופה שיגלה על צלחות קונגו אדום. ודא הצלחות יבש על טכניקות ספוט-ציפוי המתאים.</li>
</ol>

המחברים יש אין גילויים.

ניתוח של ביופילמים הוא מאתגר בשל אופיו הדינמי של biofilms ולהבדלים בין זנים, חומרים, מעבדות מבחני. . הנה, מספר אסטרטגיות מוצגים כדי לקבוע ביופילמים ב פתוגנים המעית בעקבות חשיפה מלחי מרה עם תובנה ניסיוני הניתנים לקידום הפארמצבטית. ישנם שיקולים נוספים כדי להבטיח הפארמצבטית. בראש ובראשונה, אנו ממ...

ביופילמים היא אסטרטגיית חשוב הישרדות חיידקי הנגרמת במהלך בתנאי סביבה קשים. חשיפה תרכובות אחרים כמו אנטיביוטיקה או שינויים מזין או זמינות חמצן גורם לחוץ בחיידק זה ניתן להקל באמצעות ביופילמים. ממבנה biofilm מאופיין על ידי חיידקי מצורף משטח או חיידקים אחרים, והוא מלווה את הפרשת מטריקס EPS מורכב בעיקר סוכרים1,2,3. ביופילמים הוא תהליך דינמי שבו מפל של אירועים במרקחת היווצרות בוגרת הקהילה חיידקי חסיד1,2,3. החיידקים מייצרים adhesins כדי להקל על קובץ מצורף מוקדם תוך הזזת adhesin ביטוי גנים פרופילים כדי לחזק את הקובץ המצורף במהלך ההבשלה biofilm. במקביל, ייצור EPS מתרחשת את המעיל הקהילה חיידקי במטריצה כדי להגן על התאים מפני הלחץ הראשוני. חיידקים בתוך את biofilm הם לאט גדל; ככזה, יטחנו את רוב אנטיביוטיקה לא יעילה. יתר על כן, הגידול איטי חוסך אנרגיה עד שינוי המצב לטובת התפתחות חיידקים1,2,3. אחרי התנאים הקשים חלפו, חיידקים לפזר את biofilm והמשך חיים פלנקטוניים1,2,3. באופן מסורתי, biofilms הם נצפו על משטחים, מייצגים אתגר קליני מתמשך בשל זיהום המאגרים המצויים על צנתרים ו בדיור התקנים1,2,3.
ביופילמים תוארה לאחרונה מספר גורמים מחוללי המעית; חיידקים להדביק את המעי הדק או הגס4. עבור מינים שיגלה , זיהום מתרחש במעי הגס האנושי לאחר מעבר דרך רוב מערכת העיכול. במהלך המעבר דרך המעי הדק, שיגלה הוא נחשף מרה; חומר משפילים השומנים ניקוי ומופרש אל המעי כדי להקל על עיכול שומנים בזמן בו זמנית להרוג חיידקים רוב5. פתוגנים המעית יכולת ייחודית להתנגד ההשפעות אחרים של מרה6. הניתוח האחרונה שלנו מנוצל vivo-כמו שילובים של גלוקוז ושל מלחי מרה להפגין ביופילמים חזקים ב ס flexneri , כמו גם מינים אחרים של שיגלה, פתוגניים Escherichia coli, ו סלמונלה4. בעבר, סלמונלה enterica serovar Typhi הוצגה כדי ליצור ממבנה biofilm הנוצרות על-ידי המרה עקב קולוניזציה ייחודי של כיס המרה במהלך זיהום כרוני7,8,9, 10. בנוסף, מחקר קודם עם ויבריו11, קמפילובקטר12 הפגינו ביופילמים בתגובה מרה. לכן, הבדיקות מורחב התצפיות היווצרות biofilm מרה-induced פתוגנים אחרים, מסייעות לקיים הפגנה של פתוגן המעית שנשמרת תגובה מרה. בניגוד כרונית biofilms שבו שעתוק גנים חיידקיים מוגבל, הזדקנות ביולוגית התא יכול להתרחש1,2,3, אנו מציעים כי biofilm מרה-induced המעית הוא יותר ארעי בטבע. זה ארעיים, biofilm מידבק ולחתימה על ידי פירוק מהיר (כפי שניתן לראות ב וזמינותו נפיצה), משופרת ביטוי גנים התקפה אלימה נצפתה ב biofilm האוכלוסייה4,6. 
כמו ביופילמים הוא תהליך דינמי הגיוון הרב והשימוש של מלחי מרה כמו גורם ייזום היה רק תיאר לאחרונה גורמים מחוללי המעית ביותר, הכלים ואת טכניקות המשמשות הם יישומים ייחודיים ויצירתיים של שיטות מסורתיות. כך, המובאים כאן הם שלוש אסטרטגיות ללא תשלום כדי לכמת את מספר מאפיינים חשובים של מלח מרה-induced ביופילמים, כולל חיידקי הדבקות, הפקה של המטריקס EPS, פיזור של חיידקים קיימא מ biofilm. טכניקות אלה כבר נעזרו בעיקר למחקר עם שיגלה; לכן, הערכה של פתוגנים המעית אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה. יחד עם זאת, נתונים חיוביים של כל שלושת מבחני תמיכה זיהוי של biofilms ולהקים לשחזור פרוטוקולים עבור מלח מרה-induced ביופילמים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6158-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7642-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8756-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F1635-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 12mm, round</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-774-383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon A1 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific Excella E25</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Plate Incubator</td>
			<td>Thermolyne Series 5000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

ביופילמים הוא תהליך דינמי, multistage, המתרחשת אצל חיידקים תחת תנאי סביבה קשים או בזמנים של מתח. עבור המעית פתוגנים, תגובה משמעותית מתח מושרה במהלך ההעברה במערכת העיכול ועל מרה חשיפה, מרכיב נורמלי של מערכת העיכול האנושית. כדי להתגבר על ההשפעות אחרים של מרה, פתוגנים המעית רבים יוצרים ממבנה biofilm המשוערות להתיר הישרדות כאשר הם מגיעים דרך המעי הדק. כאן אנו מציגים מתודולוגיות להגדרת ביופילמים דרך הדבקות מוצק-שלב מבחני וכן זיהוי מטריצה חוץ-תאית חומר פולימריים (EPS) ופריטים חזותיים. יתר על כן, הערכת פיזור biofilm מוצג כדי לחקות את הניתוח של אירועים מפעילה שחרור של חיידקים במהלך תהליך זיהום. קריסטל ויולט מכתים משמש כדי לזהות חיידקים חסיד assay הדבקות תפוקה גבוהה 96-ובכן צלחת. הערכת ייצור EPS נקבעת על-ידי שני מבחני, כלומר מיקרוסקופ מכתים של מטריקס EPS, ניתוח כמותי למחצה עם לקטין איגוד fluorescently מצומדת רב-סוכר. לבסוף, פיזור biofilm נמדדת דרך המושבה ספירות, ציפוי. נתונים חיוביים של מספר מבחני תמיכה אפיון biofilms and יכול להיות מנוצל כדי לזהות מלח מרה-induced ביופילמים בתוך זני חיידקים אחרים.

איור 1, ביופילמים הנגרמת ברוב של הגידול שנבדקו פתוגנים המעית שישה הבאים בתקשורת המכיל מלחי מרה. עלייה משמעותית בחיידקים חסיד לאחר חשיפה מלחי מרה הוא ציין זנים כמעט כל נבדק. החריג הוא enteroaggregative e. coli (EAEC); עם זאת, שים לב התבוננות Δaaf מוטציה<sup class=...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

פרוטוקול זה מאפשר לקורא לנתח מלח מרה-induced ביופילמים בתוך פתוגנים המעית באמצעות גישה רב פנים כדי ללכוד באופי הדינמי של biofilms חיידקי על-ידי הערכת הדבקות, היווצרות מטריצה חוץ-תאית חומר הפולימרים, פיזור.

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Views.  Massachusetts General Hospital. פרוטוקול זה מאפשר לקורא לנתח מלח מרה-induced ביופילמים בתוך פתוגנים המעית באמצעות גישה רב פנים כדי ללכוד באופי הדינמי של biofilms חיידקי על-ידי הערכת הדבקות, היווצרות מטריצה חוץ-תאית חומר הפולימרים, פיזור.

Video: Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

הדמיה בזמן אמת, כימות של פיתוח Biofilm פטרייתי באמצעות מערכת זרימת Recirculating דו-שלבית

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

מלח מרה-induced ביופילמים בתוך המעית פתוגנים: טכניקות וכימות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video