Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Biz Rachael B. Chanin ve Alejandro Llanos-Chea teknik yardım için teşekkür ederim. Biz Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski ve Bobby Cherayil bu çalışmada kullanılan suşları için teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar Grant K22AI104755 (C.S.F.) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

1. hazırlanması reaktifler
<ol><li>Safra tuzları orta: % 0.4 safra tuzları (ağırlık/hacim) içeren tryptic soya suyu (TSB) hazırlamak için safra tuzları 200 mg 50 mL resuspend autoclaved tekerlekli sandalye Basketbolu. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Taze orta haftalık olun. Notlar: Safra tuzları rutin olarak kullanılan sodyum cholate ve sodyum deoxycholate ovine ve sığır gallbladders izole bir 1:1 karışımı var. Daha önce4gösterildiği, glikoz varlığı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu için gerekli idi. Tekerlekli sandalye Basketbolu glikoz göre Luria-Bertani (LB) suyu ekledi; ve bu nedenle, Shigella ve analiz diğer enterik patojenler biyofilm oluşumu ikna etmek yeterliydi. Analiz edilebilir bakteri bağlı olarak, farklı glikoz konsantrasyonu veya farklı şeker gereksinimleri gerekli olabilir.</li>
	<li>%0,5 w/v kristal violet su: 2.5 g kristal violet 500 mL distile suda çözülür. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak.</li>
	<li>Concanavalin A (ConA) Birleşik floresein isothiocyanate (FITC): 1 x PBS stokta Reconstitute. 25 µg/mL nihai bir konsantrasyon PBS'ye 1 x 400 μL ile 10 mg konsantre stok sulandırmak ve ışıktan korumak.</li>
	<li>PBS + glikoz: 10 mL 1 x PBS (%2 w/v glikoz son) 0.2 g glikoz geçiyoruz. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.</li>
	<li>PBS + safra tuzları: 40 mg 10 mL 1 x PBS çözülür (% 0,4 w/v safra tuzları son). Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.</li>
	<li>PBS + glikoz ve safra tuzları: 40 mg safra tuzları ve 10 mL 1 x PBS (% 0,4 w/v safra tuzları ve % 2 w/v glikoz son) 0.2 g glikoz geçiyoruz. Filtre sterilize 0,22 µm filtre kullanarak. Kullanım gününde taze olun.</li>
	<li>LB Ağar kaplamalar hazırlayın.</li>
	<li>Formaldehit/oxazolidin düzeltme: ekleme 810 µL formaldehit (% 37 hisse senedi çözüm, % 3 son konsantrasyonu) ve 125 µL oxazolidin (% 25 hisse senedi çözüm, %0.25 son konsantrasyonu) 14 mL 1 x PBS için. İyice karıştırın ve 4 ° C'de depolayın Belgili tanımlık saptamak için doğru kullanımı soğuk olmalıdır. Dikkat: Belgili tanımlık saptamak zehirli ve tehlikeli atık bertaraf gerektirir.</li>
	<li>Antifade mountant çözüm: 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) leke içeren antifade mountant çözüm photobleaching immünfloresan mikroskobu örneklerinin fluorescently bakteri DNA boyama sırasında inhibe için kullanın.</li>
</ol>2. bakteri hazırlanması
<ol><li>TSB 3 mL steril kültür tüp içinde bir tek, iyi izole koloni ile aşı test edilecek bakteri suşlarının gecelik kültürler büyümek. 37 ° C'de gecede kuluçka (16-24 h) için 225 rpm'de sallayarak ile kuluçkaya. Not: Suşları dondurucu stokları her 2 4 hafta ve üzerinde tutulan plakaları Hayır 2 haftadan fazla restreaked.</li>
</ol>3. katı faz bağlılık tahlil
Not: Bu tahlil yapisan bakteri bir 96-şey plaka yöntemi kullanarak quantifies. Bakteri statik olarak düz dipli levha yetiştirilmektedir. Yapisan bakteri kristal violet ile lekeli ve çamaşır yapışık olmayan bakteriler kaldırmak için gerçekleştirilir. Kristal mor leke peptidoglikan bakteriyel hücre duvarı bağlar ve etanol kullanarak çözündürüldükten. Yapisan bakteri sayısı kristal violet saklama üzerinde bağlı olarak belirlenir.
<ol><li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + safra tuzları (BS) ile.</li>
	<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
	<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
	<li>Bir steril, temiz, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim wells (TSB ve tekerlekli sandalye Basketbolu + BS) test edilecek her ortam türü için ayarlayın.</li>
	<li>130 µL/iyi kültürü aşılamak üç kuyu ekleyin ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar yineleyin.</li>
	<li>4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Denetim orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. OD600 değerleri büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Kültür plaka hafifçe eğerek ve yavaş yavaş kuyu alt kenarına orta aspirating bir vakum hattı kullanan orta kaldırın. Plastik yüzeyde bulunan yapisan bakteriyel nüfus aksatmadan kültür orta toplamak emin olun. EPS matris kuluçka döneminde üretilen, matris beyaz çökelti görüntülenir. EPS matris rahatsız etmeyin.</li>
	<li>Yavaşça wells bir kez 200 µL steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Kuru için plaka tersine çevirin. En az 20 dk kurumaya izin. Not: biyofilm iyice boyama önce kurutulmuş gerekir beri Protokolü birkaç saat için bu adım, duraklatılmış veya bile gece olabilir. Eksik kurutma sonuçları ve tekrarlanabilirlik miktar etkiler iken eklenen kuruma süresi boyama yordamı değiştirmez.</li>
	<li>%150 0.5 kristal violet için her deneysel µL ve denetimi de ekleyin.</li>
	<li>(RT) oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Wells bir kez 400 µL distile su ile yıkayın. Eklenen birim artık kristal mor leke kuyuları taraftan kaldırmak için yardımcı olur. Yıkama vakum hattı ile kaldırın.</li>
	<li>Wells beş kez 200 µL distile su ile yıkayın. Yıkama vakum hattı ile kaldırın. Not: Ayrıntılı çamaşır miktar için önemlidir. Ne zaman boş wells distile su açık ve herhangi bir kalıntı kristal mor leke içermeyen, sonraki adıma geçin.</li>
	<li>Kuru için plaka ışıktan korunan tersine çevirin. Yukarıda da belirtildiği gibi plaka tam kurutma emin olun.</li>
	<li>Wells 200 µL % 95 etanol ile destain. Plaka için 30 dk shaker üzerinde kuluçkaya. Özellikle yüksek sıcaklıkta buharlaşma önlemek için bu adım 4 ° C'de uygulayın</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak, OD540kaydedin. Not: Kristal violet maksimum Absorbans için dalga boyu 590 olduğunu nm. Belgeleri OD540 - kristal violet Absorbans için OD5954,13,14,15,16 Aralık raporları; Böylece bir dalga boyu kullanılabilir plaka okuyucu göre seçin.</li>
</ol>4. EPS matris algılama
Not: Bu ücretsiz deneyleri ölçmek ve aka görselleştirin. İkimiz de EPS polisakkaritler bağlamak için bir lektin kullanılarak algılanır. Fluorescently Birleşik protein miktar (Adım 4.1) ve görsel öğeler (Adım 4.2) sağlar.
<ol><li>EPS yarı kantitatif tespiti<ol>
<li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.</li>
		<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
		<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
		<li>Bir steril, siyah, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyular test edilecek her ortam türü için ayarlayın. 130 µL/iyi kültürü aşılamak için kuyu eklemek ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar tekrarlayın.</li>
		<li>4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.</li>
		<li>Kültür orta açık 96-şey plaka bir pipet, ideal olarak bir çok kanallı pipet ile aktarın. Yapisan nüfus ve/veya plastik yüzeyde bulunan EPS aksatmadan kültür orta toplamak için dikkatli olun. Bir kenara koyun.</li>
		<li>15 dakika siyah plaka RT 200 µL/kuyu formaldehit/oxazolidin 1 x PBS kullanarak düzeltmek.</li>
		<li>Yapisan nüfus tespit ederken, adım 4.1.6 süpernatant kesir değerlendirin. Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Denetim orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın.<ol>
<li>Alternatif olarak, tüm tahlil bir siyah açık alt plaka gerçekleştirilebilir. Bu gibi durumlarda aşırı doz600 değerleri kaydedilebilir ve kültür orta daha sonra 4.1.7 adıma devam etmeden önce iptal edilecek. OD600 değerleri verileri normalleştirmek için kullanılabilir durumda büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar vardır.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Düzeltmeyi kaldırmak ve tehlikeli atık bertaraf.</li>
		<li>Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama hafifçe eğerek plaka ve yavaş yavaş kuyu alt kenarına yıkamada aspirating vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
		<li>150 µL/iyi olarak 25 µg/mL ConA-FITC ekleyin ve 15 dakika RT., kuluçkaya</li>
		<li>Yavaşça iki kez 200 µL PBS ile yıkayın.</li>
		<li>PBS 150 µL her şey için ekleyin. 488, Floresans kaydetmek nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocal mikroskobu görselleştirme EPS üretim ve biyofilm kalınlığı hesaplanması<ol>
<li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.</li>
		<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
		<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
		<li>Steril bir 24-şey plaka ile 12 mm cam coverslips steril ayarlayın. Boş denetimi hizmet için üç kuyu 400 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyular test edilecek her ortam türü için ayarlayın.</li>
		<li>Yinelenen wells aşısını kültürünün 400 µL eklemek ve tüm deneysel koşullar kaplama kadar tekrarlayın.</li>
		<li>4-24 h 37 ° C'de için statik olarak kuluçkaya.</li>
		<li>Görsel olarak TSB koşulu, büyüme ve EPS çökelti (TSB beyaz) + BS koşulu, büyüme ve hiçbir büyüme ve/veya steril kontrol Wells beyaz çökelti onaylayın. Supernatants kaldırın.</li>
		<li>RT 200 µL/iyi formaldehit/oxazolidin çözüm 1 x PBS kullanarak, 15 dk fix.</li>
		<li>Düzeltmeyi kaldırmak ve tehlikeli atık bertaraf.</li>
		<li>Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
		<li>150 µL/iyi olarak 25 µg/mL ConA-FITC ekleyin ve 15 dakika RT., kuluçkaya</li>
		<li>Yavaşça iki kez 200 µL/kuyu ile PBS yıkayın.</li>
		<li>Antifade mountant çözüm DAPI ile bağlayın. Not: Aynı anda bir counterstain olarak görselleştirme için bakteri hücrelerindeki DNA boyama sırasında floresan etiket korumak için DAPI içeren bir hazır, gliserol tabanlı bağlama çözüm çözümdür. Kit'in yönergeleri ve önerileri örnekleri Imaging önce kuluçka süreleri için izleyin. Yordam boyama DAPI DAPI içermiyor antifade mountant çözüm uygulanmadan önce gerçekleştirilir.</li>
		<li>Tarafından confocal mikroskobu değerlendirin. Confocal mikroskobunun lazer 495 nm/519 nm uyarma/emisyon FITC görselleştirme için ayarlayın. İkinci bir lazer 360 nm/460 nm uyarma/DAPI görselleştirmek için emisyon için ayarlayın. Biyofilm DAPI kanal üzerinde odaklanarak bulun. DAPI ve FITC kanalları tam kalınlıkta belirlemek ve üst ayarlamak için kullanın ve alt kenarlıklarını görüntüleme. Tam kalınlıkta Z-yığın görüntüleri tarafından esir alma imge her 0.25 µm z yığının altında ve üst için parametreleri ayarladıktan sonra kaydedin. Confocal mikroskobu hakkında daha fazla bilgi için lütfen yayınlar için Paddock ve ark. tarafından bakın. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>Tam biyofilm oluşumu görselleştirmek ve biyofilm kalınlığı hesaplamak için ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) 3D görüntülerde yeniden. S. flexneri safra-tuz indüklenen biyofilmler için elde edilen ortalama kalınlık 14 µm4oldu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. dağılım tahlil
Not: Bu tahlil biyofilm bakteri dağılımı ile sökme algılanır. Burada, olgun biyofilmler kurulan ve daha sonra (genellikle ertesi gün), medya PBS ile değiştirilir veya PBS desteklenmiştir. Süpernatant bileşeni sonra biyofilm ayrışmış bakteri sayısı quantitate için tabi.
<ol><li>İki 1,5 mL tüp kadar ayarla. Etiket TSB veya TSB + BS.</li>
	<li>TSB veya TSB + BS 1 mL ilgili tüpler için ekleyin.</li>
	<li>Gecede kültür 20 µL tüplerini aşılamak (1:50 seyreltme).</li>
	<li>Bir steril, temiz, düz oturaklı, doku kültürü tedavi 96-şey tabak içinde boş denetimi hizmet için üç kuyular 130 µL/iyi az denetim medya ekleyin. Üç denetim kuyu test edilecek her ortam türü için ayarlayın.</li>
	<li>130 µL/iyi kültürü aşılamak için üç kuyular ekleyin ve tüm deneysel koşullar nüsha kaplama kadar yineleyin.</li>
	<li>4-24 h 37 ° C'de plaka statik olarak kuluçkaya.</li>
	<li>Devam etmeden önce sıcak PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + 37 ° c glikoz Bu reaktifler taze günlük hazırlayın.</li>
	<li>Bir plaka okuyucu kullanarak, OD600kaydedin. Denetim wells 'boş' olarak ayarlama Orta bulanıklık hiçbir kanıt ile açık olduğunu doğrulayın. Herhangi bir bulanıklık algılanırsa, deneme atın. OD600 değerleri büyüme oranı bakteri suşları arasında önemli farklılıklar varsa verileri normalleştirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Kültür bir vakum hattı kullanan orta kaldırın. Plastik yüzeyde bulunan yapisan nüfus aksatmadan kültür orta toplamak emin olun.</li>
	<li>Yavaşça wells iki kez 200 µL/kuyu steril PBS ile yıkayın. PBS yıkama vakum satırını kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Aşağıdaki üç kuyu içine 130 µL/iyi yıkamak yerine: PBS, PBS + glikoz, PBS + safra tuzları ve PBS + safra tuzları + glikoz. Bu reaktifler 37 ° C'ye Önceden ısıtılmış olmalıdır</li>
	<li>37 ° C'de 30 dk plaka kuluçkaya</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde plaka 37 ° C kuluçka çıkarın. Supernatants bir taze, steril 96-şey tabağa aktarın.</li>
	<li>96-iyi blok, levha veya seyreltme kullanarak hazırlamak 10 kat (1:10) steril PBS içine süpernatant, seri dilutions. Not: Seyreltme serisi su katılmamış 10-6 bağlı olarak test edilecek bakteriyel zorlanma alanı. Pilot deneyler en uygun seyreltme aralığı belirlemek için gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Plaka 5 µL üzerine bir çok kanallı pipet kullanarak LB agar her seyreltme, nokta. 37 ° C'de gecede kuluçkaya. Koloniler ertesi gün ve seyreltme faktörü hesaba birimleri (CFU) oluşturan kurtarma koloni belirlerken güvenirim. 1 x PBS denetimi (% 100 ayarlamak) göre yüzde dağılımı hesaplamak için 1 x PBS denetimi örneğini kurtarma CFU tarafından her tedavi durum CFU kurtarma bölün. Not: Rutin medya plakaları bakteriyel zorlanma ilgi için de kullanılabilir. Örneğin, Shigella Kongo kırmızısı Tabaklarda kaplama. Tabakları için uygun yer kaplama teknikleri kuru olduğundan emin olun.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir açıklamalar var.

Biyofilm oluşumu analizini biyofilmler ve suşları, malzemeleri, laboratuar ve deneyleri arasında değişkenlik dinamik doğası nedeniyle zordur. Burada, çeşitli stratejiler enterik patojenler safra tuzları pozlama deneysel fikir tekrarlanabilirlik tanıtmak için sağlanan takip biyofilm oluşumu belirlemek için sunulmuştur. Tekrarlanabilirlik emin olmak için ek konuları vardır. Her şeyden önce en az üç bağımsız gerçekleştirme her gözlem ve istatistiksel önemi nedeniyle oluşabilir değişim onayl...

Biyofilm oluşumu sırasında sert çevre koşullarına bağlı bir önemli bakteriyel hayatta kalma stratejisidir. Bakteri yok edici bileşikler maruz gibi antibiyotikler veya besin değişimler ya da oksijen durumu biyofilm oluşumu ile hafifletti bakteri stresli bir durumda neden olmaktadır. Bir biyofilm bakteri eki bir yüzey veya diğer bakteri ile karakterizedir ve öncelikle polisakkaritler1,2,3oluşan bir EPS matris salgı tarafından eşlik eder. Biyofilm oluşumu olayları bir çağlayan bir olgun yapisan bakteriyel topluluk1,2,3oluşumunda culminates dinamik bir süreçtir. Bakteri adhesin gen ifade profilleri eki biyofilm olgunlaşma sırasında güçlendirmek için değişen süre erken ek kolaylaştırmak için adhesins üretir. Aynı anda, EPS üretim kat ilk tetikleyici hücreleri korumak için bir matris bakteriyel toplumda için oluşur. Biyofilm içinde bulunan bakteriler yavaş büyüyen vardır; ve bu nedenle, en antibiyotikler etkisiz vermektedir. Ayrıca, yavaş büyüme Bakteriyel büyüme1,2,3iyilik için koşullar değiştirene kadar enerji tasarruf sağlar. Sert koşulları geçtikten sonra bakteri biyofilm dağıtmak ve planktonik yaşam tarzı1,2,3devam edin. Geleneksel olarak, biyofilmler yüzeylerinde gözlenen ve kalıcı bir klinik meydan okuma nedeniyle enfeksiyon rezervuarlar Kateterler ve konut cihazlar1,2,3mevcut temsil eder.
Biyofilm oluşumu son zamanlarda birkaç enterik patojenler için tanımlanmıştır; ince bağırsak veya iki nokta üst üste4bulaştırmak bakteri. Shigella türleri, enfeksiyonu gastrointestinal sistem çoğunluğu üzerinden transit sonra insan kolonda oluşur. İnce bağırsak yoluyla geçiş sırasında Shigella safra için maruz kalmaktadır; aynı anda birçok bakteri5öldürme süre lipidler hazım kolaylaştırmak için bağırsak içine salgılanan lipid aşağılayıcı deterjan. Enterik patojenler safra6bakteri yok edici etkileri karşı koymak için eşsiz bir yeteneği var. Bizim son analiz vivo içindekullanılan-hangi tarihlerde glikoz ve S. flexneri sağlam biyofilm oluşumu göstermek için safra tuzları birleşimleri yanı sıra diğer türler, Shigella, patojenik Escherichia colive Salmonella4. Daha önce Salmonella enterica serovar Typhi safra kaynaklı bir biyofilm safra kesesi benzersiz kolonizasyon kronik enfeksiyon7,8,9, sırasında nedeniyle oluşturmak için gösterildi 10. Ayrıca, Vibrio11ve Campylobacter12 ile önceki araştırma biyofilm oluşumu yanıt safra olarak gösterdi. Bu nedenle, analizler safra kaynaklı biyofilm oluşumu gözlemler diğer patojenler için genişletilmiş ve safra korunmuş enterik patojen yanıt bir gösteri kurmak için yardım. Bakteriyel gen transkripsiyonu sınırlıdır ve hücre yaşlanma1,2,3oluşabilir kronik biyofilmler enterik safra kaynaklı biyofilm doğada daha geçici öneriyorum. Bu geçici öldürücü biyofilm tarafından hızlı sökme (dağılım assay olarak görüldüğü gibi) hallmarked ve biyofilm nüfus4,6' gözlenen virülans gen ekspresyonu gelişmiş. 
Başlatan bir faktör sadece son zamanlarda en enterik patojenler açıklandığı olduğu gibi çok yönlü, dinamik bir süreç ve safra tuzları kullanımı biyofilm oluşumu olduğu gibi araçları ve teknikleri kullanılan eşsiz ve yaratıcı uygulamalar geleneksel yöntemler vardır. Böylece, burada sunulan üç ücretsiz stratejileri safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu, bakteriyel bağlılık, EPS matris üretimini ve canlı bakteri dağılımı biyofilm üzerinden de dahil olmak üzere birçok önemli özelliklerini ölçmek için vardır. Bu teknikler öncelikle Shigellaile araştırma için kullanılmıştır; ve bu nedenle, en iyi duruma getirme diğer enterik patojenler değerlendirilmesi gerekebilir. Yine de, tüm üç deneyleri olumlu veri tanımlaması biyofilmler destek ve safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu için tekrarlanabilir iletişim kuralları kurmak.

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bile Salts</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 12mm, round</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flourescent plate reader</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal or Fluorescent Microscope</td><td>Nikon A1 confocal microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Shaking Incubator</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Plate Incubator</td><td>Thermolyne Series 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Biyofilm oluşumu bakteri sert çevre koşulları veya stresli zamanlarda altında oluşan dinamik, çok aşamalı bir süreçtir. Enterik patojenler için önemli stres tepkisi gastrointestinal transit sırasında ve safra maruz, insan sindirim normal bir bileşeni üzerine indüklenen. Safra bakteri yok edici etkilerini aşmak için birçok enterik patojenler ince bağırsak transit zaman hayatta kalma izni olan bir biyofilm oluştururlar. Burada metodolojileri biyofilm oluşumu katı fazlı bağlılık deneyleri gibi hücre dışı polimer madde (EPS) matris algılama ve görselleştirme ile tanımlamak için mevcut. Ayrıca, biyofilm dağılım değerlendirme serbest bırakmak-in bakteri enfeksiyonu işlemi sırasında tetikleme olayları analiz taklit etmek için sunulmaktadır. Kristal violet boyama bir yüksek-den geçerek 96-şey plaka bağlılık tahlil yapisan bakteri tespit etmek için kullanılır. EPS üretim değerlendirme iki deneyleri tarafından belirlenir Yani mikroskobu EPS matris ve yarı kantitatif analiz fluorescently Birleşik polisakkarit bağlayıcı lektin ile boyama. Son olarak, biyofilm dağılım koloni sayıları ve kaplama ile ölçülür. Birden çok testleri pozitif verilerden biyofilmler karakterizasyonu destek ve diğer bakteri suşları safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu tanımlamak için kullanılabilir.

Şekil 1' de, altı enterik patojenler sınanan aşağıdaki büyüme medyada safra tuzları içeren çoğunda biyofilm oluşumu indüklenen. Safra tuzları pozlama neredeyse tüm suşların görülmektedir sonra yapisan bakteri önemli bir artış test. İstisnadır enteroaggregative E. coli (olursa); ancak, Δaaf mutant4indüklenen gözlenmesi unutmayın. Ek bağlılık mekanizmaları olursa safra tuzları...

Watch this Scientific Journal Video about Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification at JoVE.com

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Bu iletişim kuralı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu enterik patojenler bağlılık, hücre dışı polimer madde matris oluşumu değerlendirmek tarafından bakteriyel biyofilmler dinamik doğası yakalamak için çok yönlü bir yaklaşım kullanarak analiz okuyucu sağlar, ve dağılım.

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital. Bu iletişim kuralı safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu enterik patojenler bağlılık, hücre dışı polimer madde matris oluşumu değerlendirmek tarafından bakteriyel biyofilmler dinamik doğası yakalamak için çok yönlü bir yaklaşım kullanarak analiz okuyucu sağlar, ve dağılım.

Video: Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Kolon Epitel Hücrelerinde Shigella Enfeksiyonunu Analiz Etmek için Protokoller

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

Yazar Spotlight: Shigella Enfeksiyonlarını Anlama ve Mücadeledeki Gelişmeler

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Biyoloji

Acinetobacter Biyofilm Oluşumunun Değerlendirilmesi ve Biyofilmlerin Karakterizasyonu

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

Yazar Spotlight: Acinetobacter Biyofilm Miktarının Belirlenmesi, Değerlendirilmesi ve Görselleştirilmesi için Kapsamlı Bir Protokol 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Enterik patojenler safra tuzu kaynaklı biyofilm oluşumu: kimlik ve miktar teknikleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis Biyofilmler

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Araştırma yöntemleri

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

Acinetobacter Biyofilmleri için Miktar Tayini, Canlılık Değerlendirmesi ve Görselleştirme Stratejileri