Ringraziamo Rachael B. Chanin e Alejandro Llanos-Chea per assistenza tecnica. Ringraziamo Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski e Bobby Cherayil per i ceppi utilizzati in questo studio. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Allergy e Grant K22AI104755 di malattie infettive (C.S.F). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

1. preparazione dei reagenti
<ol><li>Sali biliari medio: per preparare il brodo di soia triptico (TSB) contenente sali biliari 0,4% (peso/volume), risospendere 200 mg di sali biliari in 50 mL di TSB in autoclave. Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fare fresco medio settimanale. Note: I sali biliari ordinariamente utilizzati è una miscela di 1:1 di sodio colato e sodio desossicolato isolato dalle cistifellea ovine e bovina. Come dimostrato in precedenza4, la presenza di glucosio è stato richiesta per la formazione di biofilm indotta da sali biliari. TSB ha aggiunto glucosio rispetto al brodo di Luria-Bertani (LB); e quindi, era sufficiente per indurre la formazione di biofilm in Shigella e gli agenti patogeni enterici analizzati. A seconda i batteri per essere analizzati, le concentrazioni differenti di glucosio o zucchero diversi requisiti potrebbero essere necessario.</li>
	<li>0,5 viola di cristallo % p/v in acqua: sciogliere 2,5 g di cristalvioletto in 500 mL di acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm.</li>
	<li>Concanavalina A (ConA) coniugata con isotiocianato di fluorescina (FITC): ricostituire lo stock in PBS 1X. Diluire il brodo 10 mg concentrato con 400 μL di PBS 1X a una concentrazione finale di 25 µ g/mL e proteggerlo dalla luce.</li>
	<li>PBS + glucosio: Sciogliere 0,2 g di glucosio in 10 mL di PBS 1X (finale del glucosio di 2% w/v). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fanno fresco il giorno di utilizzo.</li>
	<li>PBS + sali biliari: Sciogliere 40 mg in 10 mL di PBS 1X (0,4% w/v i sali biliari finali). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fanno fresco il giorno di utilizzo.</li>
	<li>PBS + glucosio e sali biliari: sciogliere sali biliari 40mg e 0,2 g di glucosio in 10 mL di PBS 1X (2% w/v glucosio finale e sali biliari di 0,4% w/v). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fanno fresco il giorno di utilizzo.</li>
	<li>Preparare piatti agar della libbra.</li>
	<li>Correzione di formaldeide/glutaraldeide: 810 aggiungere µ l formaldeide (soluzione di riserva del 37%, 3% concentrazione finale) e 125 glutaraldeide µ l (soluzione di riserva del 25%, 0,25% concentrazione finale) a 14 mL di PBS 1X. Mescolare accuratamente e conservare a 4 ° C. La correzione dovrebbe essere fredda per un uso corretto. Attenzione: La correzione è tossica e richiede lo smaltimento di rifiuti pericolosi.</li>
	<li>Montante Antifade soluzione: utilizzare il montante antifade soluzione contenente 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) macchia per inibizione di photobleaching di campioni immunofluorescente microscopia fluorescente macchiando il DNA dei batteri.</li>
</ol>2. preparazione di batteri
<ol><li>Crescere una notte colture di ceppi batterici per essere testata inoculando 3 mL di TSB con una colonia singola, ben isolata in un tubo di coltura sterile. Incubare a 37 ° C con agitazione a 225 giri/min per incubazione overnight (16-24 h). Nota: Ceppi dovrebbero essere restreaked dalle scorte congelatore ogni 2 a 4 settimane e mantenuto su piastre non più di 2 settimane di vita.</li>
</ol>3. fase solida aderenza Assay
Nota: Questo test quantifica aderenti batteri utilizzando un metodo di piastra a 96 pozzetti. I batteri sono coltivati in modo statico nelle piastre di fondo piatto. Lavaggio viene eseguito per rimuovere i batteri non aderente e batteri aderenti sono macchiati con la viola di cristallo. La macchia viola di cristallo lega peptidoglicano nella parete cellulare batterica e possa essere solubilizzata utilizzando etanolo. Il numero di batteri aderenti è determinato basato sulla conservazione di cristallo viola.
<ol><li>Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + sali biliari (BS).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette.</li>
	<li>Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (presso un 01:50 diluizione).</li>
	<li>In una piastra a 96 pozzetti sterile, chiara, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati, aggiungere 130 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto (TSB e TSB + BS) per essere testato.</li>
	<li>Aggiungere 130 µ l/pozzetto di coltura inoculata in tre pozzi e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate in triplice copia.</li>
	<li>Incubare per 4-24 h a 37 ° C in modo statico.</li>
	<li>Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD600. Impostare i pozzetti di controllo come 'vuoto'. Confermare che il mezzo di controllo è chiaro senza prova di torbidità. Se viene rilevato qualsiasi torbidità, scartare l'esperimento. I valori di600 OD possono essere utilizzati per normalizzare i dati, se ci sono differenze significative nel tasso di crescita tra ceppi batterici.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una linea del vuoto delicatamente inclinando la piastra e aspirando lentamente il mezzo al bordo più basso del pozzo. Essere sicuri di raccogliere tutto il terreno di coltura senza interrompere la popolazione batterica aderente situata sulla superficie di plastica. Se la matrice EPS è stato prodotto durante il periodo di incubazione, la matrice verrà visualizzata come un precipitato bianco. Non disturbare la matrice EPS.</li>
	<li>Lavare delicatamente i pozzetti una volta con 200 µ l di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto.</li>
	<li>Capovolgere la piastra ad asciugare. Consentire un minimo di 20 minuti ad asciugare. Nota: Poiché i biofilm deve essere completamente asciutto prima della colorazione, il protocollo può essere sospesa a questo punto per un paio d'ore o anche durante la notte. Il tempo di asciugatura aggiunto non modificherà la procedura di colorazione mentre essiccazione incompleta influenzerà la quantificazione dei risultati e riproducibilità.</li>
	<li>Aggiungere 150 µ l di cristalvioletto 0,5% per ogni sperimentale e controllo bene.</li>
	<li>Incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Lavare i pozzetti una volta con 400 µ l di acqua distillata. Il volume aggiunto aiuta a rimuovere residui cristalvioletto macchia dai lati dei pozzi. Rimuovere il lavaggio con la linea del vuoto.</li>
	<li>Lavare i pozzetti 5 volte con 200 µ l di acqua distillata. Rimuovere il lavaggio con la linea del vuoto. Nota: Lavaggio accurato è importante per la quantificazione. Quando i pozzetti del bianco sono chiaro dall'acqua distillata e non contengono alcun residuo cristalvioletto macchia, procedere al passaggio successivo.</li>
	<li>Capovolgere la piastra a secco, al riparo dalla luce. Garantire la completa asciugatura della piastra come indicato in precedenza.</li>
	<li>Decolorare i pozzetti con 200 µ l di etanolo al 95%. Incubare la piastra sull'agitatore per 30 min. Per evitare l'evaporazione, specialmente alle più alte temperature, eseguire questo passaggio a 4 ° C.</li>
	<li>Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD540. Nota: La lunghezza d'onda per assorbanza massima della viola di cristallo è vicino a 590 nm. La letteratura segnala una gamma da OD540 - OD5954,13,14,15,16 per assorbanza viola di cristallo; così scegliere una lunghezza d'onda disponibile basata su lettore della piastra.</li>
</ol>4. EPS Matrix Detection
Nota: Questi saggi gratuiti quantificare e visualizzare l'EPS. In entrambi, EPS viene rilevata utilizzando una lectina associare polisaccaridi. La proteina fluorescente coniugati permette di quantificazione (punto 4.1) o visualizzazione (punto 4.2).
<ol><li>Determinazione semi-quantitativa del EPS<ol>
<li>Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + BS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette.</li>
		<li>Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (un 01:50 diluizione).</li>
		<li>In una piastra a 96 pozzetti sterile, nera, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati, aggiungere 130 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto essere testato. Aggiungere 130 µ l/pozzetto di coltura inoculata nei pozzetti e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate in triplice copia.</li>
		<li>Incubare per 4-24 h a 37 ° C in modo statico.</li>
		<li>Trasferire il terreno di coltura per una piastra a 96 pozzetti chiaro con una pipetta, idealmente una pipetta multicanale. Prestare attenzione a raccogliere tutto il terreno di coltura senza interrompere la popolazione aderente e/o l'EPS si trova sulla superficie di plastica. Mettere da parte.</li>
		<li>Fissare la piastra nera per 15 min a RT utilizzando 200 µ l/pozzetto di formaldeide/glutaraldeide in 1X PBS.</li>
		<li>Mentre la popolazione aderente è fissa, valutare il surnatante dal punto 4.1.6. Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD600. Impostare i pozzetti di controllo come 'vuoto'. Confermare che il mezzo di controllo è chiaro senza prova di torbidità. Se viene rilevato qualsiasi torbidità, scartare l'esperimento.<ol>
<li>In alternativa, il dosaggio intero può essere effettuato in un piatto fondo chiaro nero. Ciò premesso, i valori di600 OD possono essere registrati e il terreno di coltura può essere successivamente scartato prima di procedere al passo 4.1.7. I valori di600 OD possono essere utilizzati per normalizzare i dati nel caso non ci sono differenze significative nel tasso di crescita fra ceppi batterici.</li>
		</ol>
</li>
		<li>La correzione di rimuovere e smaltire nei rifiuti pericolosi.</li>
		<li>Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto delicatamente inclinando la piastra e aspirando lentamente il lavaggio al bordo più basso del pozzo.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l/pozzetto di 25 µ g/mL ConA-FITC e incubare per 15 minuti a TA.</li>
		<li>Lavare delicatamente due volte con 200 µ l di PBS.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l di PBS in ciascun pozzetto. Registrare la fluorescenza a 488 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualizzazione di microscopia confocale della produzione di EPS e calcolo dello spessore del biofilm<ol>
<li>Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + BS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette.</li>
		<li>Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (presso un 01:50 diluizione).</li>
		<li>Impostare una piastra a 24 pozzetti sterile con 12 mm sterili round vetrini coprioggetti. Aggiungere 400 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto essere testato.</li>
		<li>Aggiungere 400 µ l della coltura inoculata a pozzetti in duplicato e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate.</li>
		<li>Incubare per 4-24 h a 37 ° C in modo statico.</li>
		<li>Non confermare visivamente crescita nella condizione TSB, crescita ed EPS precipitato (bianco) nel TSB + condizione BS e nessuna crescita e/o precipitato bianco nei pozzetti di controllo sterile. Rimuovere i sovranatante.</li>
		<li>Difficoltà per 15 min a RT utilizzando 200 µ l/pozzetto di soluzione di formaldeide/glutaraldeide in 1X PBS.</li>
		<li>Rimuovere la correzione e lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.</li>
		<li>Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l/pozzetto di 25 µ g/mL ConA-FITC e incubare per 15 minuti a TA.</li>
		<li>Lavare delicatamente due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS.</li>
		<li>Montare con montante antifade soluzione con DAPI. Nota: La soluzione è una soluzione di montaggio Ready-Made, basati su glicerolo contenenti DAPI per preservare l'etichetta fluorescente mentre simultaneamente macchiando il DNA nelle cellule batteriche per la visualizzazione come un colorante di contrasto. Seguire le indicazioni e le raccomandazioni del kit per tempi di incubazione prima campioni di imaging. La procedura di colorazione DAPI può essere eseguita prima di applicare la soluzione antifade mountant non contenente DAPI.</li>
		<li>Valutare mediante microscopia confocale. Su un microscopio confocale, impostare il laser nm/519 eccitazione 495 nm/emissione per visualizzazione FITC. Impostare un secondo laser 360 nm/460 nm eccitazione/emissione di visualizzare DAPI. Individuare il biofilm focalizzando l'attenzione sul canale DAPI. Utilizzare canali DAPI sia FITC per determinare lo spessore completo e impostare superiore e inferiore di imaging confini. Registrare immagini di spessore completo dello stack Z catturando immagini ogni 0,25 µm dopo avere impostato i perimetri di parte superiore e inferiore dello z-stack. Per ulteriori informazioni su microscopia confocal, fare riferimento alle pubblicazioni di Paddock et al. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>Ricostruire le immagini 3D in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) per visualizzare la formazione di biofilm completo e calcolare lo spessore del biofilm. Lo spessore medio ottenuto per S. flexneri sale biliare indotto biofilm era 14 µm4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. la dispersione Assay
Nota: In questa analisi, lo smontaggio del biofilm attraverso dispersione batterica viene rilevato. Qui, i biofilm maturi sono stabiliti e successivamente (solitamente il giorno successivo), i media vengono sostituiti con PBS o completati PBS. Il surnatante componente è poi valutato per quantificare il numero di batteri che hanno dissociato dal biofilm.
<ol><li>Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + BS.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette.</li>
	<li>Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (presso un 01:50 diluizione).</li>
	<li>In una piastra a 96 pozzetti sterile, chiara, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati, aggiungere 130 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto per essere testato.</li>
	<li>Aggiungere 130 µ l/pozzetto di coltura inoculata tre pozzi e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate in triplice copia.</li>
	<li>Incubare la piastra per 4-24 h a 37 ° C in modo statico.</li>
	<li>Prima di continuare, caldo PBS, PBS + glucosio, PBS + sali biliari e PBS + sali biliari + glucosio a 37 ° C. Preparare questi quotidiano fresco di reagenti.</li>
	<li>Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD600. Impostare i pozzetti di controllo come 'vuoto'. Confermare che il mezzo è chiaro senza prova di torbidità. Se viene rilevato qualsiasi torbidità, scartare l'esperimento. I valori di600 OD possono essere utilizzati per normalizzare i dati, se ci sono differenze significative nel tasso di crescita tra ceppi batterici.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una linea del vuoto. Essere sicuri di raccogliere tutto il terreno di coltura senza interrompere la popolazione aderente situata sulla superficie di plastica.</li>
	<li>Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto.</li>
	<li>Sostituire il lavaggio con 130 µ l/pozzetto di in tre pozzi ogni quanto segue: PBS, PBS + glucosio, PBS + sali biliari e PBS + sali biliari + glucosio. Questi reagenti devono essere pre-riscaldati a 37 ° C.</li>
	<li>Incubare la piastra per 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la piastra dall'incubatore 37 ° C. Trasferire i surnatanti di una piastra a 96 pozzetti sterile, fresca.</li>
	<li>Utilizzando un blocco di piastra o diluizione di 96 pozzetti, preparare 10 volte (01:10) diluizioni seriali del surnatante in PBS sterile. Nota: La serie di diluizione dovrebbero variare da non diluito a 10-6 a seconda del ceppo batterico per essere testato. Esperimenti pilota possono essere eseguiti per determinare l'intervallo di diluizione ottimale.</li>
	<li>Posto tavola 5 µ l di ciascuna diluizione su LB agar usando una pipetta multicanale. Incubare a 37 ° C durante la notte. Contare le colonie sul conto per il fattore di diluizione e di giorno successivo quando si determina il recupero unità formanti colonia (UFC). Per calcolare la dispersione percentuale rispetto la 1 x controllo PBS (impostato al 100%), dividere il recupero CFU da ciascuna condizione di trattamento di recupero CFU dal campione di controllo di PBS 1X. Nota: Piastre di media di Routine per il ceppo batterico di interesse possono anche essere utilizzati. Ad esempio, Shigella può essere placcato sulle piastre di colore rosso di Congo. Assicurarsi che le piastre siano asciutte per tecniche appropriate di posto-placcatura.</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Analisi della formazione di biofilm è impegnativo a causa della natura dinamica del biofilm e la variabilità tra i ceppi, materiali, laboratori e le analisi. Qui, diverse strategie sono presentate per determinare la formazione di biofilm in patogeni enterici dopo esposizione di sali biliari con intuizione sperimentale fornito per promuovere la riproducibilità. Ci sono considerazioni aggiuntive per garantire la riproducibilità. Innanzitutto, si consiglia di eseguire almeno tre indipendenti esperimenti ciascuno con tri...

Formazione di biofilm è una strategia di sopravvivenza batterica importante indotta durante condizioni ambientali difficili. L'esposizione ai composti battericide come antibiotici o cambiamenti di sostanza nutriente o disponibilità di ossigeno induce uno stato sollecitato nei batteri che possono essere alleviati attraverso la formazione di biofilm. Un biofilm è caratterizzato da batterica allegato ad una superficie o altri batteri ed è accompagnato dalla secrezione di una matrice EPS composta principalmente da polisaccaridi1,2,3. Formazione di biofilm è un processo dinamico, in cui una cascata di eventi culmina nella formazione di una comunità batterica aderente matura1,2,3. I batteri producono adesine per facilitare il collegamento iniziale mentre spostando adesina profili di espressione genica per rafforzare allegato durante la maturazione del biofilm. Simultaneamente, produzione di EPS avviene a cappotto della comunità batterica in una matrice a proteggere le cellule dal fattore di sforzo iniziale. I batteri contenuti all'interno del biofilm sono a crescita lenta; e come tale, rende la maggior parte degli antibiotici inefficaci. Inoltre, la lenta crescita conserva l'energia fino a quando le condizioni cambiano per favorire la crescita batterica1,2,3. Dopo aver passato le dure condizioni, batteri disperdono il biofilm e riprendere un stile di vita planctonico1,2,3. Tradizionalmente, i biofilm sono osservati sulle superfici e rappresentano una sfida clinica persistente a causa di serbatoi di infezione presente su cateteri e dispositivi di in-abitazione1,2,3.
Formazione di biofilm recentemente è stato descritto per parecchi agenti patogeni enterici; batteri che infettano il piccolo intestino o del colon4. Per specie Shigella , l'infezione si verifica nel colon umano dopo un transito attraverso la maggior parte del tratto gastrointestinale. Durante il passaggio attraverso l'intestino tenue, Shigella è esposto alla bile; un detergente del lipido-degradanti secernuto nell'intestino per facilitare la digestione dei lipidi mentre simultaneamente uccidendo la maggior parte dei batteri5. Patogeni enterici hanno una capacità unica di resistere agli effetti battericidi di bile6. La nostra analisi recenti utilizzati in vivo-come combinazioni di glucosio e sali biliari per dimostrare la formazione di biofilm robusto in S. flexneri , nonché altre specie di Shigella, patogeni di Escherichia colie Salmonella4. In precedenza, serovar di Salmonella enterica Typhi è stato indicato per formano un biofilm indotta da bile a causa di colonizzazione unico della cistifellea durante l'infezione cronica7,8,9, 10. Inoltre, previa ricerca con Vibrio11e Campylobacter12 ha dimostrato la formazione di biofilm in risposta alla bile. Di conseguenza, le analisi estese le osservazioni di formazione di biofilm bile-indotta di altri agenti patogeni e contribuiscono a stabilire la dimostrazione di una risposta di agente patogeno enterico conservata alla bile. A differenza di biofilm cronico in cui trascrizione genica batterica è limitato e senescenza cellulare può verificarsi1,2,3, proponiamo che il biofilm enterico bile-indotta è più di natura transitorio. Questo transitorio, virulento biofilm è caratterizzato da un rapido smontaggio (come visto nell'analisi della dispersione) e ha migliorato l'espressione di gene di virulenza osservato in biofilm popolazione4,6. 
Come formazione di biofilm è un processo dinamico e poliedrico e l'uso dei sali di bile come un fattore d'inizio è stato solo recentemente descritto per patogeni enterici più, gli strumenti e le tecniche utilizzate sono applicazioni uniche e creative dei metodi tradizionali. Così, qui presentati sono gratuite tre strategie per quantificare le diverse caratteristiche importanti della formazione di biofilm indotta da sali biliari, inclusa l'adesione batterica, produzione della matrice EPS e dispersione di batteri vitali dal biofilm. Queste tecniche sono state utilizzate principalmente per la ricerca con Shigella; e pertanto, la valutazione di altri patogeni enterici può richiedere ottimizzazione. Tuttavia, dati positivi da tutti i tre saggi supportano l'identificazione del biofilm e stabilire protocolli riproducibile per la formazione di biofilm indotta da sali biliari.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6158-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin-A FITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7642-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8756-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F1635-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>655076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 12mm, round</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-774-383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescent plate reader</td>
			<td>Biotek Synergy 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon A1 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Shaking Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific Excella E25</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C Plate Incubator</td>
			<td>Thermolyne Series 5000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Formazione di biofilm è un processo dinamico, multistadio che avviene nei batteri in condizioni ambientali difficili o periodi di stress. Per gli agenti patogeni enterici, una risposta di stress significativo è indotta durante il transito gastrointestinale e all'esposizione di bile, un normale componente di digestione umana. Per superare gli effetti battericidi di bile, molti agenti patogeni enterici formano un biofilm supposto per consentire la sopravvivenza durante il transito attraverso l'intestino tenue. Qui presentiamo metodologie per definire la formazione di biofilm tramite analisi di fase solida adesione così come rilevamento di matrice extracellulare sostanza polimerica (EPS) e la visualizzazione. Inoltre, valutazione di dispersione di biofilm è presentato per imitare l'analisi degli eventi provoca il rilascio di batteri durante il processo di infezione. Colorazione viola di cristallo viene utilizzato per rilevare batteri aderenti in un'analisi di aderenza ad alta velocità piastra a 96 pozzetti. Valutazione di produzione di EPS è determinato da due saggi, vale a dire la microscopia macchiatura della EPS matrice e analisi semi-quantitativa con una lectina legante il polisaccaride coniugato fluorescente. Infine, dispersione di biofilm è misurata attraverso Colonia conteggi e placcatura. Dati positivi da saggi multipli supportano la caratterizzazione di biofilm e possono essere utilizzati per identificare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in altri ceppi batterici.

In Figura 1, formazione del biofilm è indotto nella maggior parte della crescita seguente testata sei patogeni enterici in media che contengono i sali biliari. Un aumento significativo nei batteri aderenti dopo esposizione di sali biliari è osservata in quasi tutti i ceppi testati. L'eccezione è ed Escherichia coli (CEEA); si noti, tuttavia, l'osservazione indotta del Δaaf mutante4. I risultati indicano ...

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Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Questo protocollo permette al lettore di analizzare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici usando un approccio sfaccettato per catturare la natura dinamica del biofilm batterici valutando l'aderenza, formazione di matrice extracellulare sostanza polimerica, e dispersione.

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Views.  Massachusetts General Hospital. Questo protocollo permette al lettore di analizzare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici usando un approccio sfaccettato per catturare la natura dinamica del biofilm batterici valutando l'aderenza, formazione di matrice extracellulare sostanza polimerica, e dispersione.

Video: Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

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Immunologia e infezioni

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

Nella formazione di biofilm in vitro in un 8-bene scorrere Camera

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Phage &#39;Bioluminescent&#39; Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monostrati Colonoid umana per studiare le interazioni tra gli agenti patogeni, Commensals ed epitelio intestinale Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...