Name: bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification
Uploaded: 2018-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
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Ringraziamo Rachael B. Chanin e Alejandro Llanos-Chea per assistenza tecnica. Ringraziamo Anthony T. Maurelli, Bryan P. Hurley, Alessio Fasano, Brett E. Swierczewski e Bobby Cherayil per i ceppi utilizzati in questo studio. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Allergy e Grant K22AI104755 di malattie infettive (C.S.F). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

1. preparazione dei reagenti
<ol><li>Sali biliari medio: per preparare il brodo di soia triptico (TSB) contenente sali biliari 0,4% (peso/volume), risospendere 200 mg di sali biliari in 50 mL di TSB in autoclave. Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fare fresco medio settimanale. Note: I sali biliari ordinariamente utilizzati è una miscela di 1:1 di sodio colato e sodio desossicolato isolato dalle cistifellea ovine e bovina. Come dimostrato in precedenza4, la presenza di glucosio è stato richiesta per la formazione di biofilm indotta da sali biliari. TSB ha aggiunto glucosio rispetto al brodo di Luria-Bertani (LB); e quindi, era sufficiente per indurre la formazione di biofilm in Shigella e gli agenti patogeni enterici analizzati. A seconda i batteri per essere analizzati, le concentrazioni differenti di glucosio o zucchero diversi requisiti potrebbero essere necessario.</li>
	<li>0,5 viola di cristallo % p/v in acqua: sciogliere 2,5 g di cristalvioletto in 500 mL di acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm.</li>
	<li>Concanavalina A (ConA) coniugata con isotiocianato di fluorescina (FITC): ricostituire lo stock in PBS 1X. Diluire il brodo 10 mg concentrato con 400 μL di PBS 1X a una concentrazione finale di 25 µ g/mL e proteggerlo dalla luce.</li>
	<li>PBS + glucosio: Sciogliere 0,2 g di glucosio in 10 mL di PBS 1X (finale del glucosio di 2% w/v). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fanno fresco il giorno di utilizzo.</li>
	<li>PBS + sali biliari: Sciogliere 40 mg in 10 mL di PBS 1X (0,4% w/v i sali biliari finali). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fanno fresco il giorno di utilizzo.</li>
	<li>PBS + glucosio e sali biliari: sciogliere sali biliari 40mg e 0,2 g di glucosio in 10 mL di PBS 1X (2% w/v glucosio finale e sali biliari di 0,4% w/v). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,22 µm. Fanno fresco il giorno di utilizzo.</li>
	<li>Preparare piatti agar della libbra.</li>
	<li>Correzione di formaldeide/glutaraldeide: 810 aggiungere µ l formaldeide (soluzione di riserva del 37%, 3% concentrazione finale) e 125 glutaraldeide µ l (soluzione di riserva del 25%, 0,25% concentrazione finale) a 14 mL di PBS 1X. Mescolare accuratamente e conservare a 4 ° C. La correzione dovrebbe essere fredda per un uso corretto. Attenzione: La correzione è tossica e richiede lo smaltimento di rifiuti pericolosi.</li>
	<li>Montante Antifade soluzione: utilizzare il montante antifade soluzione contenente 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) macchia per inibizione di photobleaching di campioni immunofluorescente microscopia fluorescente macchiando il DNA dei batteri.</li>
</ol>2. preparazione di batteri
<ol><li>Crescere una notte colture di ceppi batterici per essere testata inoculando 3 mL di TSB con una colonia singola, ben isolata in un tubo di coltura sterile. Incubare a 37 ° C con agitazione a 225 giri/min per incubazione overnight (16-24 h). Nota: Ceppi dovrebbero essere restreaked dalle scorte congelatore ogni 2 a 4 settimane e mantenuto su piastre non più di 2 settimane di vita.</li>
</ol>3. fase solida aderenza Assay
Nota: Questo test quantifica aderenti batteri utilizzando un metodo di piastra a 96 pozzetti. I batteri sono coltivati in modo statico nelle piastre di fondo piatto. Lavaggio viene eseguito per rimuovere i batteri non aderente e batteri aderenti sono macchiati con la viola di cristallo. La macchia viola di cristallo lega peptidoglicano nella parete cellulare batterica e possa essere solubilizzata utilizzando etanolo. Il numero di batteri aderenti è determinato basato sulla conservazione di cristallo viola.
<ol><li>Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + sali biliari (BS).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette.</li>
	<li>Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (presso un 01:50 diluizione).</li>
	<li>In una piastra a 96 pozzetti sterile, chiara, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati, aggiungere 130 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto (TSB e TSB + BS) per essere testato.</li>
	<li>Aggiungere 130 µ l/pozzetto di coltura inoculata in tre pozzi e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate in triplice copia.</li>
	<li>Incubare per 4-24 h a 37 ° C in modo statico.</li>
	<li>Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD600. Impostare i pozzetti di controllo come 'vuoto'. Confermare che il mezzo di controllo è chiaro senza prova di torbidità. Se viene rilevato qualsiasi torbidità, scartare l'esperimento. I valori di600 OD possono essere utilizzati per normalizzare i dati, se ci sono differenze significative nel tasso di crescita tra ceppi batterici.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una linea del vuoto delicatamente inclinando la piastra e aspirando lentamente il mezzo al bordo più basso del pozzo. Essere sicuri di raccogliere tutto il terreno di coltura senza interrompere la popolazione batterica aderente situata sulla superficie di plastica. Se la matrice EPS è stato prodotto durante il periodo di incubazione, la matrice verrà visualizzata come un precipitato bianco. Non disturbare la matrice EPS.</li>
	<li>Lavare delicatamente i pozzetti una volta con 200 µ l di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto.</li>
	<li>Capovolgere la piastra ad asciugare. Consentire un minimo di 20 minuti ad asciugare. Nota: Poiché i biofilm deve essere completamente asciutto prima della colorazione, il protocollo può essere sospesa a questo punto per un paio d'ore o anche durante la notte. Il tempo di asciugatura aggiunto non modificherà la procedura di colorazione mentre essiccazione incompleta influenzerà la quantificazione dei risultati e riproducibilità.</li>
	<li>Aggiungere 150 µ l di cristalvioletto 0,5% per ogni sperimentale e controllo bene.</li>
	<li>Incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Lavare i pozzetti una volta con 400 µ l di acqua distillata. Il volume aggiunto aiuta a rimuovere residui cristalvioletto macchia dai lati dei pozzi. Rimuovere il lavaggio con la linea del vuoto.</li>
	<li>Lavare i pozzetti 5 volte con 200 µ l di acqua distillata. Rimuovere il lavaggio con la linea del vuoto. Nota: Lavaggio accurato è importante per la quantificazione. Quando i pozzetti del bianco sono chiaro dall'acqua distillata e non contengono alcun residuo cristalvioletto macchia, procedere al passaggio successivo.</li>
	<li>Capovolgere la piastra a secco, al riparo dalla luce. Garantire la completa asciugatura della piastra come indicato in precedenza.</li>
	<li>Decolorare i pozzetti con 200 µ l di etanolo al 95%. Incubare la piastra sull'agitatore per 30 min. Per evitare l'evaporazione, specialmente alle più alte temperature, eseguire questo passaggio a 4 ° C.</li>
	<li>Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD540. Nota: La lunghezza d'onda per assorbanza massima della viola di cristallo è vicino a 590 nm. La letteratura segnala una gamma da OD540 - OD5954,13,14,15,16 per assorbanza viola di cristallo; così scegliere una lunghezza d'onda disponibile basata su lettore della piastra.</li>
</ol>4. EPS Matrix Detection
Nota: Questi saggi gratuiti quantificare e visualizzare l'EPS. In entrambi, EPS viene rilevata utilizzando una lectina associare polisaccaridi. La proteina fluorescente coniugati permette di quantificazione (punto 4.1) o visualizzazione (punto 4.2).
<ol><li>Determinazione semi-quantitativa del EPS<ol>
<li>Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + BS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette.</li>
		<li>Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (un 01:50 diluizione).</li>
		<li>In una piastra a 96 pozzetti sterile, nera, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati, aggiungere 130 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto essere testato. Aggiungere 130 µ l/pozzetto di coltura inoculata nei pozzetti e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate in triplice copia.</li>
		<li>Incubare per 4-24 h a 37 ° C in modo statico.</li>
		<li>Trasferire il terreno di coltura per una piastra a 96 pozzetti chiaro con una pipetta, idealmente una pipetta multicanale. Prestare attenzione a raccogliere tutto il terreno di coltura senza interrompere la popolazione aderente e/o l'EPS si trova sulla superficie di plastica. Mettere da parte.</li>
		<li>Fissare la piastra nera per 15 min a RT utilizzando 200 µ l/pozzetto di formaldeide/glutaraldeide in 1X PBS.</li>
		<li>Mentre la popolazione aderente è fissa, valutare il surnatante dal punto 4.1.6. Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD600. Impostare i pozzetti di controllo come 'vuoto'. Confermare che il mezzo di controllo è chiaro senza prova di torbidità. Se viene rilevato qualsiasi torbidità, scartare l'esperimento.<ol>
<li>In alternativa, il dosaggio intero può essere effettuato in un piatto fondo chiaro nero. Ciò premesso, i valori di600 OD possono essere registrati e il terreno di coltura può essere successivamente scartato prima di procedere al passo 4.1.7. I valori di600 OD possono essere utilizzati per normalizzare i dati nel caso non ci sono differenze significative nel tasso di crescita fra ceppi batterici.</li>
		</ol>
</li>
		<li>La correzione di rimuovere e smaltire nei rifiuti pericolosi.</li>
		<li>Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto delicatamente inclinando la piastra e aspirando lentamente il lavaggio al bordo più basso del pozzo.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l/pozzetto di 25 µ g/mL ConA-FITC e incubare per 15 minuti a TA.</li>
		<li>Lavare delicatamente due volte con 200 µ l di PBS.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l di PBS in ciascun pozzetto. Registrare la fluorescenza a 488 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualizzazione di microscopia confocale della produzione di EPS e calcolo dello spessore del biofilm<ol>
<li>Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + BS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette.</li>
		<li>Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (presso un 01:50 diluizione).</li>
		<li>Impostare una piastra a 24 pozzetti sterile con 12 mm sterili round vetrini coprioggetti. Aggiungere 400 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto essere testato.</li>
		<li>Aggiungere 400 µ l della coltura inoculata a pozzetti in duplicato e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate.</li>
		<li>Incubare per 4-24 h a 37 ° C in modo statico.</li>
		<li>Non confermare visivamente crescita nella condizione TSB, crescita ed EPS precipitato (bianco) nel TSB + condizione BS e nessuna crescita e/o precipitato bianco nei pozzetti di controllo sterile. Rimuovere i sovranatante.</li>
		<li>Difficoltà per 15 min a RT utilizzando 200 µ l/pozzetto di soluzione di formaldeide/glutaraldeide in 1X PBS.</li>
		<li>Rimuovere la correzione e lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.</li>
		<li>Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto.</li>
		<li>Aggiungere 150 µ l/pozzetto di 25 µ g/mL ConA-FITC e incubare per 15 minuti a TA.</li>
		<li>Lavare delicatamente due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS.</li>
		<li>Montare con montante antifade soluzione con DAPI. Nota: La soluzione è una soluzione di montaggio Ready-Made, basati su glicerolo contenenti DAPI per preservare l'etichetta fluorescente mentre simultaneamente macchiando il DNA nelle cellule batteriche per la visualizzazione come un colorante di contrasto. Seguire le indicazioni e le raccomandazioni del kit per tempi di incubazione prima campioni di imaging. La procedura di colorazione DAPI può essere eseguita prima di applicare la soluzione antifade mountant non contenente DAPI.</li>
		<li>Valutare mediante microscopia confocale. Su un microscopio confocale, impostare il laser nm/519 eccitazione 495 nm/emissione per visualizzazione FITC. Impostare un secondo laser 360 nm/460 nm eccitazione/emissione di visualizzare DAPI. Individuare il biofilm focalizzando l'attenzione sul canale DAPI. Utilizzare canali DAPI sia FITC per determinare lo spessore completo e impostare superiore e inferiore di imaging confini. Registrare immagini di spessore completo dello stack Z catturando immagini ogni 0,25 µm dopo avere impostato i perimetri di parte superiore e inferiore dello z-stack. Per ulteriori informazioni su microscopia confocal, fare riferimento alle pubblicazioni di Paddock et al. 17 , 18 , 19 , 20
</li>
		<li>Ricostruire le immagini 3D in ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) per visualizzare la formazione di biofilm completo e calcolare lo spessore del biofilm. Lo spessore medio ottenuto per S. flexneri sale biliare indotto biofilm era 14 µm4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. la dispersione Assay
Nota: In questa analisi, lo smontaggio del biofilm attraverso dispersione batterica viene rilevato. Qui, i biofilm maturi sono stabiliti e successivamente (solitamente il giorno successivo), i media vengono sostituiti con PBS o completati PBS. Il surnatante componente è poi valutato per quantificare il numero di batteri che hanno dissociato dal biofilm.
<ol><li>Impostare due provette da 1,5 mL. Etichetta con TSB o TSB + BS.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di TSB o TSB + BS nelle rispettive provette.</li>
	<li>Inoculare i tubi con 20 µ l della coltura durante la notte (presso un 01:50 diluizione).</li>
	<li>In una piastra a 96 pozzetti sterile, chiara, fondo piatto, coltura del tessuto-trattati, aggiungere 130 µ l/pozzetto di mezzi di controllo non inoculato a tre pozzetti da utilizzare come il controllo in bianco. Impostare tre pozzetti di controllo per ogni tipo di supporto per essere testato.</li>
	<li>Aggiungere 130 µ l/pozzetto di coltura inoculata tre pozzi e ripetere fino a quando tutte le condizioni sperimentali sono placcate in triplice copia.</li>
	<li>Incubare la piastra per 4-24 h a 37 ° C in modo statico.</li>
	<li>Prima di continuare, caldo PBS, PBS + glucosio, PBS + sali biliari e PBS + sali biliari + glucosio a 37 ° C. Preparare questi quotidiano fresco di reagenti.</li>
	<li>Utilizzando un lettore di piastra, registrare il OD600. Impostare i pozzetti di controllo come 'vuoto'. Confermare che il mezzo è chiaro senza prova di torbidità. Se viene rilevato qualsiasi torbidità, scartare l'esperimento. I valori di600 OD possono essere utilizzati per normalizzare i dati, se ci sono differenze significative nel tasso di crescita tra ceppi batterici.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura utilizzando una linea del vuoto. Essere sicuri di raccogliere tutto il terreno di coltura senza interrompere la popolazione aderente situata sulla superficie di plastica.</li>
	<li>Lavare delicatamente i pozzetti due volte con 200 µ l/pozzetto di PBS sterile. Rimuovere il lavaggio con PBS utilizzando la linea del vuoto.</li>
	<li>Sostituire il lavaggio con 130 µ l/pozzetto di in tre pozzi ogni quanto segue: PBS, PBS + glucosio, PBS + sali biliari e PBS + sali biliari + glucosio. Questi reagenti devono essere pre-riscaldati a 37 ° C.</li>
	<li>Incubare la piastra per 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la piastra dall'incubatore 37 ° C. Trasferire i surnatanti di una piastra a 96 pozzetti sterile, fresca.</li>
	<li>Utilizzando un blocco di piastra o diluizione di 96 pozzetti, preparare 10 volte (01:10) diluizioni seriali del surnatante in PBS sterile. Nota: La serie di diluizione dovrebbero variare da non diluito a 10-6 a seconda del ceppo batterico per essere testato. Esperimenti pilota possono essere eseguiti per determinare l'intervallo di diluizione ottimale.</li>
	<li>Posto tavola 5 µ l di ciascuna diluizione su LB agar usando una pipetta multicanale. Incubare a 37 ° C durante la notte. Contare le colonie sul conto per il fattore di diluizione e di giorno successivo quando si determina il recupero unità formanti colonia (UFC). Per calcolare la dispersione percentuale rispetto la 1 x controllo PBS (impostato al 100%), dividere il recupero CFU da ciascuna condizione di trattamento di recupero CFU dal campione di controllo di PBS 1X. Nota: Piastre di media di Routine per il ceppo batterico di interesse possono anche essere utilizzati. Ad esempio, Shigella può essere placcato sulle piastre di colore rosso di Congo. Assicurarsi che le piastre siano asciutte per tecniche appropriate di posto-placcatura.</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Analisi della formazione di biofilm è impegnativo a causa della natura dinamica del biofilm e la variabilità tra i ceppi, materiali, laboratori e le analisi. Qui, diverse strategie sono presentate per determinare la formazione di biofilm in patogeni enterici dopo esposizione di sali biliari con intuizione sperimentale fornito per promuovere la riproducibilità. Ci sono considerazioni aggiuntive per garantire la riproducibilità. Innanzitutto, si consiglia di eseguire almeno tre indipendenti esperimenti ciascuno con tri...

Formazione di biofilm è una strategia di sopravvivenza batterica importante indotta durante condizioni ambientali difficili. L'esposizione ai composti battericide come antibiotici o cambiamenti di sostanza nutriente o disponibilità di ossigeno induce uno stato sollecitato nei batteri che possono essere alleviati attraverso la formazione di biofilm. Un biofilm è caratterizzato da batterica allegato ad una superficie o altri batteri ed è accompagnato dalla secrezione di una matrice EPS composta principalmente da polisaccaridi1,2,3. Formazione di biofilm è un processo dinamico, in cui una cascata di eventi culmina nella formazione di una comunità batterica aderente matura1,2,3. I batteri producono adesine per facilitare il collegamento iniziale mentre spostando adesina profili di espressione genica per rafforzare allegato durante la maturazione del biofilm. Simultaneamente, produzione di EPS avviene a cappotto della comunità batterica in una matrice a proteggere le cellule dal fattore di sforzo iniziale. I batteri contenuti all'interno del biofilm sono a crescita lenta; e come tale, rende la maggior parte degli antibiotici inefficaci. Inoltre, la lenta crescita conserva l'energia fino a quando le condizioni cambiano per favorire la crescita batterica1,2,3. Dopo aver passato le dure condizioni, batteri disperdono il biofilm e riprendere un stile di vita planctonico1,2,3. Tradizionalmente, i biofilm sono osservati sulle superfici e rappresentano una sfida clinica persistente a causa di serbatoi di infezione presente su cateteri e dispositivi di in-abitazione1,2,3.
Formazione di biofilm recentemente è stato descritto per parecchi agenti patogeni enterici; batteri che infettano il piccolo intestino o del colon4. Per specie Shigella , l'infezione si verifica nel colon umano dopo un transito attraverso la maggior parte del tratto gastrointestinale. Durante il passaggio attraverso l'intestino tenue, Shigella è esposto alla bile; un detergente del lipido-degradanti secernuto nell'intestino per facilitare la digestione dei lipidi mentre simultaneamente uccidendo la maggior parte dei batteri5. Patogeni enterici hanno una capacità unica di resistere agli effetti battericidi di bile6. La nostra analisi recenti utilizzati in vivo-come combinazioni di glucosio e sali biliari per dimostrare la formazione di biofilm robusto in S. flexneri , nonché altre specie di Shigella, patogeni di Escherichia colie Salmonella4. In precedenza, serovar di Salmonella enterica Typhi è stato indicato per formano un biofilm indotta da bile a causa di colonizzazione unico della cistifellea durante l'infezione cronica7,8,9, 10. Inoltre, previa ricerca con Vibrio11e Campylobacter12 ha dimostrato la formazione di biofilm in risposta alla bile. Di conseguenza, le analisi estese le osservazioni di formazione di biofilm bile-indotta di altri agenti patogeni e contribuiscono a stabilire la dimostrazione di una risposta di agente patogeno enterico conservata alla bile. A differenza di biofilm cronico in cui trascrizione genica batterica è limitato e senescenza cellulare può verificarsi1,2,3, proponiamo che il biofilm enterico bile-indotta è più di natura transitorio. Questo transitorio, virulento biofilm è caratterizzato da un rapido smontaggio (come visto nell'analisi della dispersione) e ha migliorato l'espressione di gene di virulenza osservato in biofilm popolazione4,6. 
Come formazione di biofilm è un processo dinamico e poliedrico e l'uso dei sali di bile come un fattore d'inizio è stato solo recentemente descritto per patogeni enterici più, gli strumenti e le tecniche utilizzate sono applicazioni uniche e creative dei metodi tradizionali. Così, qui presentati sono gratuite tre strategie per quantificare le diverse caratteristiche importanti della formazione di biofilm indotta da sali biliari, inclusa l'adesione batterica, produzione della matrice EPS e dispersione di batteri vitali dal biofilm. Queste tecniche sono state utilizzate principalmente per la ricerca con Shigella; e pertanto, la valutazione di altri patogeni enterici può richiedere ottimizzazione. Tuttavia, dati positivi da tutti i tre saggi supportano l'identificazione del biofilm e stabilire protocolli riproducibile per la formazione di biofilm indotta da sali biliari.

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma</td><td>C6158-50</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin-A FITC</td><td>Sigma</td><td>C7642-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Bile Salts</td><td>Sigma</td><td>B8756-100G</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma</td><td>L7533-1KG</td><td></td></tr><tr><td>14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard-set antifade with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92696</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 96-well plates (black)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>Flat-bottomed 24-well plates (clear)</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips 12mm, round</td><td>Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Spectramax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flourescent plate reader</td><td>Biotek Synergy 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal or Fluorescent Microscope</td><td>Nikon A1 confocal microscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Shaking Incubator</td><td>New Brunswick Scientific Excella E25</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C Plate Incubator</td><td>Thermolyne Series 5000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens: techniques for identification and quantification

Formazione di biofilm è un processo dinamico, multistadio che avviene nei batteri in condizioni ambientali difficili o periodi di stress. Per gli agenti patogeni enterici, una risposta di stress significativo è indotta durante il transito gastrointestinale e all'esposizione di bile, un normale componente di digestione umana. Per superare gli effetti battericidi di bile, molti agenti patogeni enterici formano un biofilm supposto per consentire la sopravvivenza durante il transito attraverso l'intestino tenue. Qui presentiamo metodologie per definire la formazione di biofilm tramite analisi di fase solida adesione così come rilevamento di matrice extracellulare sostanza polimerica (EPS) e la visualizzazione. Inoltre, valutazione di dispersione di biofilm è presentato per imitare l'analisi degli eventi provoca il rilascio di batteri durante il processo di infezione. Colorazione viola di cristallo viene utilizzato per rilevare batteri aderenti in un'analisi di aderenza ad alta velocità piastra a 96 pozzetti. Valutazione di produzione di EPS è determinato da due saggi, vale a dire la microscopia macchiatura della EPS matrice e analisi semi-quantitativa con una lectina legante il polisaccaride coniugato fluorescente. Infine, dispersione di biofilm è misurata attraverso Colonia conteggi e placcatura. Dati positivi da saggi multipli supportano la caratterizzazione di biofilm e possono essere utilizzati per identificare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in altri ceppi batterici.

In Figura 1, formazione del biofilm è indotto nella maggior parte della crescita seguente testata sei patogeni enterici in media che contengono i sali biliari. Un aumento significativo nei batteri aderenti dopo esposizione di sali biliari è osservata in quasi tutti i ceppi testati. L'eccezione è ed Escherichia coli (CEEA); si noti, tuttavia, l'osservazione indotta del Δaaf mutante4. I risultati indicano ...

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Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Questo protocollo permette al lettore di analizzare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici usando un approccio sfaccettato per catturare la natura dinamica del biofilm batterici valutando l'aderenza, formazione di matrice extracellulare sostanza polimerica, e dispersione.

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

bile-salt-induced-biofilm-formation-enteric-pathogens-techniques-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Views.  Massachusetts General Hospital. Questo protocollo permette al lettore di analizzare la formazione di biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici usando un approccio sfaccettato per catturare la natura dinamica del biofilm batterici valutando l'aderenza, formazione di matrice extracellulare sostanza polimerica, e dispersione.

Video: Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and composition 1, 2. In general, biofilms develop from initial microbial attachment on a surface followed by formation of cell clusters (or microcolonies) and further development and stabilization of the microcolonies, which occur in a complex extracellular matrix. The majority of biofilm matrices harbor exopolysaccharides (EPS), and dental biofilms are no exception; especially those associated with caries disease, which are mostly mediated by mutans streptococci 3. The EPS are synthesized by microorganisms (S. mutans, a key contributor) by means of extracellular enzymes, such as glucosyltransferases using sucrose primarily as substrate 3.
Studies of biofilms formed on tooth surfaces are particularly challenging owing to their constant exposure to environmental challenges associated with complex diet-host-microbial interactions occurring in the oral cavity. Better understanding of the dynamic changes of the structural organization and composition of the matrix, physiology and transcriptome/proteome profile of biofilm-cells in response to these complex interactions would further advance the current knowledge of how oral biofilms modulate pathogenicity. Therefore, we have developed an analytical tool-box to facilitate biofilm analysis at structural, biochemical and molecular levels by combining commonly available and novel techniques with custom-made software for data analysis. Standard analytical (colorimetric assays, RT-qPCR and microarrays) and novel fluorescence techniques (for simultaneous labeling of bacteria and EPS) were integrated with specific software for data analysis to address the complex nature of oral biofilm research.
The tool-box is comprised of 4 distinct but interconnected steps (Figure 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, and 4) Data Analysis. We used our in vitro biofilm model and specific experimental conditions to demonstrate the usefulness and flexibility of the tool-box. The biofilm model is simple, reproducible and multiple replicates of a single experiment can be done simultaneously 4, 5. Moreover, it allows temporal evaluation, inclusion of various microbial species 5 and assessment of the effects of distinct experimental conditions (e.g. treatments 6; comparison of knockout mutants vs. parental strain 5; carbohydrates availability 7). Here, we describe two specific components of the tool-box, including (i) new software for microarray data mining/organization (MDV) and fluorescence imaging analysis (DUOSTAT), and (ii) in situ EPS-labeling. We also provide an experimental case showing how the tool-box can assist with biofilms analysis, data organization, integration and interpretation.

Biofilms formed on tooth surfaces are highly complex and exposed to constant innate and exogenous environmental challenges, which modulate their architecture, physiology and transcriptome. We developed a toolbox to examine the composition, structural organization and gene expression of oral biofilms, which can be adapted to other areas of biofilm research.

Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

Biofilms are highly dynamic, organized and structured communities of microbial cells enmeshed in an extracellular matrix of variable density and ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Protocolli per l'analisi dell'infezione da Shigella nelle cellule epiteliali del colon

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, and is a leading cause of diarrheal deaths worldwide. Infection induces watery or bloody diarrhea as a result of the pathogen transiting the gastrointestinal tract and infecting the epithelial cells lining the colon. With staggering increases in antibiotic resistance and the current lack of approved vaccines, standardized research protocols are critical to studying this formidable pathogen. Here, methodologies are presented to examine the molecular pathogenesis of Shigella using in vitro analyses of bacterial adherence, invasion, and intracellular replication in colonic epithelial cells. Prior to infection analyses, the virulence phenotype of Shigella colonies was verified by the uptake of the Congo red dye on agar plates. Supplemented laboratory media can also be considered during bacterial culturing to mimic in vivo conditions. Bacterial cells are then used in a standardized protocol to infect colonic epithelial cells in tissue culture plates at an established multiplicity of infection with adaptations to analyze each stage of infection. For adherence assays, Shigella cells are incubated with reduced media levels to promote bacterial contact with epithelial cells. For both invasion and intracellular replication assays, gentamicin is applied for various time intervals to eliminate extracellular bacteria and enable assessment of invasion and/or the quantification of intracellular replication rates. All infection protocols enumerate adherent, invaded, and/or intracellular bacteria by serially diluting infected epithelial cell lysates and plating bacterial colony forming units relative to infecting titers on Congo red agar plates. Together, these protocols enable independent characterization and comparisons for each stage of Shigella infection of epithelial cells to study this pathogen successfully.

Autore in primo piano: Progressi nella comprensione e nella lotta contro le infezioni da Shigella

The present protocol describes infection assays to interrogate Shigella adherence, invasion, and intracellular replication using in vitro epithelial cell lines.

Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Biologia

Valutazione della formazione di biofilm da Acinetobacter e caratterizzazione dei biofilm

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

Autore in primo piano: un protocollo completo per la quantificazione, la valutazione e la visualizzazione del biofilm di Acinetobacter 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Strategie di quantificazione, valutazione della vitalità e visualizzazione per biofilm di Acinetobacter

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Quantificazione concomitante di cellulare e extracellulare componenti del biofilm

Metodologie per lo studio

Un nuovo metodo per l'analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella

Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella

Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

Strategie di quantificazione, valutazione della vitalità e visualizzazione per biofilm di Acinetobacter