Name: methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

מחקר זה מומן חלקים על ידי NIH מענקים HL66299 TS, RB ו SL, HL60024 ל TS, HL136869 ל MF.

כל ההליכים בבעלי חיים נבחנו, אושרה על ידי גופים מוסדיים ועדת אכפת לי חיה של אוניברסיטת דרום אלבמה, בוצעו בהתאם לתקנות הפדרלי, המדינה, והמקומיים כל. תרבויות העיקרי של עכברוש microvascular אנדותל תאי הריאות (PMVECs) התקבלו מהמתקן תא תרבות הליבה במרכז אוניברסיטת דרום אלבמה עבור ריאות ביולוגיה. תאים הוכנו באמצעות הליכים שתואר לעיל16.
1. דור של Supernatants ציטוטוקסיות
הערה: כאן, אנו משתמשים שני זנים שונים של aeruginosa פ: PA103, הכולל מערכת הפרשת השלישי סוג שלם מסוגל להעביר את exoenzymes ExoU, ExoT לתאי המטרה במהלך זיהום, ∆PcrV, אשר חסרה סוג מערכת הפרשת השלישי היא לא מסוגל העברת exoenzymes לתאי המטרה בעקבות חיסון.
<ol><li>פסים חיידקים על פלטות אגר ווגל-בונר (VB)17 ולגדול בן לילה ב 37 º C.<ol>
<li>כדי להכין צלחות, להפוך את הפתרון מניות הבא (פוגל-בונר מלחי; מניות x 10): למדוד דור 2 MgSO4, 20 גרם חומצה ציטרית (חומצה חינם), 100 גרם K2PO4ו2פו ' NaH 35 g '4. להוסיף ddH2O 1 ליטר, תא לחץ למשך 15 דקות עם פליטה איטי.</li>
		<li>הניחו 7.5 גר' אגר 450 מ ל ddH2O ואת אוטוקלב כמפורט לעיל.</li>
		<li>בעקבות autoclaving, מקום שני פתרונות לתוך אמבט מים 50 ° C להתקרר.</li>
		<li>להוסיף 50 מ של x VB 10 מניות תמיסת מלח אגר.</li>
		<li>הוספת carbenicillin µg 400/mL (עבור הזנים של aeruginosa פ בשימוש) ומערבבים היטב על ידי מתערבל את הבקבוקון.</li>
		<li>מקום 5 מ"ל של הפתרון אגר VB לתוך מנות בודדות תרבות סטרילי, לאפשר את אגר לחזק ולאחר מכן לאחסן ב 4 ° C עד היום של זריעת חיידקים.</li>
		<li>ביום של זריעת חיידקים, לחמם צלחת 37 מעלות, ואז לרוץ בעירום חיידקים על צלחת באמצעות לולאה סטרילי. המקום הצלחת ב חממה 37 ° C בלילה</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאמת PMVEC טוהר על ידי צביעת חיובית עם פלורסנט Griffonia simplicifolia לקטין, צביעת שלילי עם פלורסנט סליל pomatia לקטין (סמן תאי אנדותל עורקי). התאים aliquot, ההקפאה של חנקן נוזלי.</li>
	<li>לניסויים, לשמור על תאים בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% סרום שור עוברית, לגדל תאים חממה 37 ° C המכילה 5% CO2. להשתמש תאים פסוקים 5-15.<ol>
<li>בדור של supernatants ציטוטוקסיות, לוחית רישוי 2 x 106 תאים בודדים 150 ס"מ מנות ולגדול 3-4 ימים עד למפגש מושגת. השתמש שתי צלחות לכל ניסוי (ראו להלן).</li>
		<li>לניתוח של supernatants ציטוטוקסיות, צלחת צלחת עונה 1 פרק 105 תאים לתוך בארות בודדים של 6-באר ולגדול במשך ארבעה ימים עד למפגש מושגת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לייצר תגובת שיקוע, לשטוף את אחת המנות שני 150 ס"מ של PMVECs מ שלב 1.3.1 בתמיסת באגירה פוספט, trypsinize, ואז לספור את התאים (אנחנו להשתמש מונה הניתן תא אוטומטית, בצע את הפרוטוקול של היצרן; ראה טבלה של חומרים). לשטוף את הצלחת אחרים של PMVECs מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק), ואז להדביק עם גם מזן aeruginosa פ -ריבוי של זיהום (MOI) של 20:1. זו מושגת כדלקמן:<ol>
<li>עבור aeruginosa פ, כמנת540 0.25 = 2 x 108 CFUs/mL. כדי להכין את הדילול, להוסיף 1 מ"ל HBSS cuvette חד פעמיות 1 מ"ל. לגרד מספיק חיידקים ממני הצלחת זה הוכן בשלב 1.1 עד OD540 של 0.25 מושגת כאשר נמדד באמצעות ספקטרופוטומטרים. השלב הבא יספק חישוב של כמה יהיה צורך חיידקים.</li>
		<li>אחרי מספר PMVECs בצלחת תרבות (שלב 1.4 לעיל), לקבוע את המספר המתאים של חיידקים כדי להוסיף למנה השנייה, אי-trypsinized תרבות המכיל את PMVECs. לדוגמה, אם נקבע כי המנה התרבות של PMVECs מכיל 1.3 x 107 תאים, אז היכונו 1.3 x 107 תאים x 20 חיידקים/תא x 1 mL/2 x 108 CFUs = 1.3 mL חיידקים.</li>
		<li>לדלל mL 1.3 של חיידקים לתוך HBSS נפח סופי של 20 מ ל, כך השטח כולו של מנה 150 ס"מ יכול להתכסות בנוזלים, ולאחר מכן להוסיף את החיידקים מדולל לצלחת של PMVECs.</li>
		<li>דגירה PMVECs מחוסן עם החיידק ב 37 ° C בחממה2 CO 5% עבור 4-5 שעות, עד פערים ניתן לראות מתבצעת טפט התא כאשר הצלחת נצפית ברמה המיקרוסקופית (ראה איור 1 עבור רמה נאותה של היווצרות פער).</li>
		<li>לאסוף את תגובת שיקוע ולאחר מכן צנטריפוגה 10 דקות ב g x 2,000 ומפרידה שולחן כדי להסיר את הלכלוך הסלולר. הערה: כל צנטריפוגה מלמעלה בטבלה מסוגל g מספיק ביצירת לכפות הצניפה unlysed תאים, תא גדול שברי יכול לשמש בשלב זה.</li>
		<li>שופכים את תגובת שיקוע לתוך מזרק בעל מסנן 0.2 µm מחוברת לקצה, ואז לעבור את תגובת שיקוע דרך המסנן כדי להסיר חיידקים.</li>
		<li>השתמש של aliquot של תגובת שיקוע סטרילי כדי לבדוק את cytotoxicity (ראה 2.1) ומקפיאים את שאר תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ניתוח של Supernatants ציטוטוקסיות
<ol><li>Cytotoxicity Assay<ol>
<li>לגדול PMVECs במנות 6-ובכן עד למפגש. שטיפת בארות פעם עם HBSS, לאחר מכן להוסיף 1.5 מ של תגובת שיקוע מחוטא-מסנן (שנאסף או תאים PA103 - או ∆PcrV-מחוסן) וולס בודדים. להוסיף HBSS סטרילי טוב אחרת כפקד שלילי.</li>
		<li>למקם את הצלחת לתוך החממה2 CO עבור h 21-24, ולאחר מכן לצפות עבור תא הרג/cytotoxicity (ראה שלב הבא). להשתמש supernatants כי התערוכה cytotoxicity לניסויים נוספים, ולמחוק את אלה שאינם מציגים תא ההרג.</li>
		<li>כימות של הרג תא<ol>
<li>מדד לקטאט דהידרוגנאז (LDH) שחרור תאים מתים באמצעות ערכות Assay LDH זמינים מסחרית של היצרן המליץ הליכים.</li>
			<li>לחלופין, לכמת הרג תא ברמה המיקרוסקופית באמצעות תוכנת ImageJ. בשביל זה, להקליט תמונות מיקרוסקופיות ותחומי המנה תרבות המכיל תאים שלמים, ואז לכמת אזורי חסר תאים (מעיד על מוות של תאים ב- טפט) באמצעות מאקרו ImageJ (המכון הלאומי לבריאות) (ראה הקבצים המשלימים קידוד מותאם אישית ). אם רצונך בכך, לבצע את השלבים מאקרו באופן ידני כפי שמוצג להלן:<ol>
<li>קלט תמונות (בפורמט RGB או Tiff) לתוך המאקרו ולהתאים בניגוד ל- 15% רווי פיקסלים. לשכפל תמונות חדות מנוכים ולבצע את הפקודה "לחסר רקע" כדי לקבל תמונה בחדות גבוהה של שטח התא והן את הפער בתוך שדה הראייה.</li>
				<li>להחסיר את התמונה הזו התמונה המקורית ולשלב את התמונה המתקבלת עם התמונה המקורית באמצעות המחשבון תמונת הפונקציה "AND". להמיר את התמונה הנובעת שחור (רווחים) ומסכת לבן (תאים) עם הפונקציה הסף (מינימום 0, מקסימום 5), השתמש בפונקציה "בינארי לשחוק את" כדי להסיר רעש מתוך התמונה.</li>
				<li>למדוד את היחס בין שחור לבן פיקסלים בתוך התמונה תוצאות המדידה "אזור השבר". מגרש ולבטא את אזורי החלקי עבור כל נקודת זמן הטיפול אחוזים של אזור מרווח מקסימלי.</li>
				<li>אמצעים לחשב ולהשוות באמצעות חד-כיווני אנובה עם מבחן לאחר הוק של Tukey, עם ערכי p פחות מ- 0.05 נחשב משמעותי.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>השתמש immunoblot ניתוח להקים הנוכחות של עמילואיד, טאו oligomeric Aβ התרבות supernatants. לבצע ניתוח immunoblot באמצעות הליכים סטנדרטיים10,11,12, מלבד ריכוז supernatants התרבות 10-fold לפחות לפני אלקטרופורזה.<ol>
<li>להתרכז תגובת שיקוע, מקום 1-2 מ של תגובת שיקוע לתוך יחידה מסנן צנטריפוגה ממברנה אשר יש ניתוק של משקל מולקולרי של 10 kDa. אז, במקום יחידת מסנן לתוך צנטריפוגה מלמעלה בטבלה צנטריפוגה-2,000 x g עד מידת הריכוז הנדרש מושגת (בד כ 45-60 דקות).</li>
			<li>לקבוע את כמות חלבון מרוכז supernatant11 , לטעון כמויות שוות של מדגמים לתוך בארות בודדים של הג'ל.</li>
			<li>לבדוק תרביות, להעביר את החלבונים ניטרוצלולוזה ולאחר מכן בדיקה שהכלים עם נוגדן נגד עמילואיד A11, נוגדן אנטי oligomeric טאו T22 או נוגדן anti-Aβ MOAB2 ואחריו נוגדנים משניים המתאים. לפתח את שהכלים באמצעות הליכים chemiluminescence רגיל.</li>
		</ol>
</li>
		<li>כדי לבצע thioflavin T Assay, השתמש thioflavin T קרינה פלואורסצנטית (ThT) לכמת amyloids ב supernatants. עבור מדידות אלה, השתמש supernatants עיקור-מסנן.<ol>
<li>להכין פתרון מניות (50 x) של thioflavin T על ידי השעיית 8 מ ג thioflavin T (ThT) לתוך 10 מ ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS). לאחר ערבוב, לסנן את הפתרון דרך מסנן מיקרומטר 0.22 להסיר חלקיקים.</li>
			<li>למדידות, להוסיף µL 20 מניות ThT 1 מ"ל של PBS ב cuvette ספקטרופוטומטרים 1 מ"ל. למקם את הדגימה מדוללת spectrofluorimeter.</li>
			<li>למדוד פליטת קרינה פלואורסצנטית בסיסית באמצעות עירור nm 425 וסריקה של פליטת קרינה פלואורסצנטית מ 450-575 nm במרווחים של 2 ננומטר.</li>
			<li>בצע סריקה זמן לשגות באמצעות עירור nm 425 ונרכשה 482 פליטה ננומטר, עם נתונים כל 0.2 s 60 s.</li>
			<li>ה-20 הראשונית s של הסריקה זמן לשגות מודד קרינה פלואורסצנטית ב cuvette ריק. בגיל 20 s, להשהות את הסריקה ולהוסיף 10 µL של תגובת שיקוע עיקור מסנן cuvette. לערבב את cuvette על ידי היפוך ולאחר מכן מקם חזרה spectrofluorimeter.</li>
			<li>לחדש את הסריקה מבוססי-זמן, רכישת ה-40 הסופי s של נתונים.</li>
			<li>עם סיום הסריקה זמן לשגות, בצע סריקה ספקטרום פליטה פלורסצנטיות הסופי באמצעות הגדרות זהות, כמפורט 2.1.5.3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pneumonia+really+the+old+man's+friend?+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia.">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li><li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia.">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li><li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+respiratory+tract+infections+and+risk+of+first-time+acute+myocardial+infarction.">Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction.</a> Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).</li><li>Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-term+survival+after+hospitalization+with+community-acquired+pneumonia.">Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia.</a> Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).</li><li>Yende, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+markers+at+hospital+discharge+predict+subsequent+mortality+after+pneumonia+and+sepsis.">Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis.</a> Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).</li><li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+hospitalization+for+pneumonia+and+subsequent+risk+of+cardiovascular+disease.">Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease.</a> J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).</li><li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exoenzyme+S+regulon+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).</li><li>Engel, J., Balachandran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pseudomonas+aeruginosa+type+III+effectors+in+disease.">Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).</li><li>Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells.">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343 (2013).</li><li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy.">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible,+cytotoxic+prion+amyloids.">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li><li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury.">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions.">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li><li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie:+Uncertainties,+biology,+and+molecular+approaches.">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li><li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li></ol>

לא לדווח.

. הנה, שיטות פשוטות במבחנה מתוארים אשר מאפשרים הפגנה של הדור של amyloids ציטוטוקסיות במהלך זיהום עם דלקת ריאות גורמת האורגניזם. שיטות אלה כוללים תא תרבות cytotoxicity assay, immunoblotting, כימות של תא להרוג באמצעות שיטת מיקרוסקופיים הרומן, ThT מחייב. ניתוחים של הסוכנים ציטוטוקסיות הוכיחו כי הם עמילואיד ב?...

חולים ששרדו דלקת ריאות. רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר החולים פריקה1,2,3,4,5,6. ברוב המקרים, מוות מתרחשת על ידי סוג של כשל איברים סוף כולל כליות, ריאות, לב, או אירועים הכבד, כמו גם קו5,6. הסיבה שיעור התמותה גבוה באוכלוסיית חולים זו מעולם לא נקבעה.
דלקת ריאות מסווג כ להיות גם הקהילה רכשה או רכשה החולים (nosocomial), סוכנים שיכולים לגרום לדלקת ריאות כוללים חיידקים, וירוסים, פטריות וכימיקלים. אחד הגורמים העיקריים של דלקת ריאות nosocomial הוא החיידק Pseudomonas aeruginosa. Aeruginosa פ הוא אורגניזם גראם שליליים המשתמשת מערכת הפרשת סוג III להעברת מולקולות אפקטור שונים, הנקרא exoenzymes, ישירות אל הציטופלסמה של היעד תאים7,8. במהלך זיהום של תאי אנדותל הריאות, exoenzymes המטרה חלבונים תאיים שונים, לרבות צורת אנדותל הקשורים microtubule חלבון טאו9,10,11,12 , המוביל אל המכשול אנדותל התמוטטות וכתוצאה מכך בצקת ריאות חמורה, ירד תפקוד ריאתי ומוות, לעיתים קרובות,.
כאמור, חולים ששרדו ריאות הראשונית רוממתם שיעורי התמותה ב-12 החודשים הראשונים לאחר הפרשות חולים. מנגנון פוטנציאליים על ההסבר לתופעה זו הוא כי סוג כלשהו של רעל מאריכים נוצר במהלך זיהום ראשוני שמוביל לתוצאות המסכן. שתי תצפיות תומכים האפשרות הזו. ראשית, בתרבית ריאתי אנדותל תאים שטופלו בתחילה aeruginosa פ להיכשל להתרבות במשך שבוע לאחר החיידקים מומתים על ידי אנטיביוטיקה13. שנית, מאריכים prions וסוכנים עם מאפיינים פריון הוכחו מחלות האדם ושל בעלי החיים השונים, בעיקר מחלות הקשורות למערכת העצבים ה-14,15.
שיטות לבחינת פוטנציאל הייצור של סוכנים ציטוטוקסיות חיים ארוכים במהלך זיהום ריאתי לא תוארו. כאן סדרה של מבחני פשוטה במבחנה מתוארים שניתן להשתמש בו עבור חוקרים cytotoxin ייצור ופעילות בעקבות זיהום באמצעות סוכן גורם משותף דלקת ריאות, aeruginosa פ. מבחני אלה צריך להיות להתאמה בקלות לחקור אינדוקציה cytotoxin אפשרי בעקבות זיהום באמצעות חומרים אחרים הגורמים לדלקת ריאות, supernatants שנוצרו גם צריך להיות שימושי עבור חוקרים תופעות של cytotoxins כולה איברים או בעלי חיים. בסופו של דבר, מבחני המפורטות כאן ככל הנראה תהיה יכולת הסתגלות כדי לבדוק נוזלים ביולוגיים בעלי חיים ועל האדם לייצור cytotoxins במהלך דלקת ריאות.

<table><tbody><tr><td>Rabbit anti beta amyloid</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 amyloid oligomer antibody</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 anti-tau oligomer antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.22 micron syringe filters</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat antirabbit IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>Strains PA103 and &amp;Delta;PcrV</td><td></td><td></td><td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td></tr><tr><td>FITC Griffonia lectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia lectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0.22 micron nitrocellulose</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Type 2 collagenase</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Disodium salt</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium phosphate heptahydrate</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

חולים ששרדו דלקת ריאות רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר השחרור החולים. זה היה שיערו כי דלקת של רקמת הריאה במהלך דלקת ריאות תוצאות בייצור של cytotoxins חיים ארוכים זה יכול להוביל לכשל איברים סיום עוקבות. פיתחנו במבחנה מבחני כדי לבדוק את ההשערה כי cytotoxins מיוצרים במהלך זיהום ריאתי. תאי אנדותל הריאות עכברוש מבודד, החיידק Pseudomonas aeruginosa משמשים מודל מערכות, והפגינו הייצור של cytoxins בעקבות זיהום של תאי אנדותל על ידי החיידקים היא באמצעות תרבית תאים ואחריו כימות ישירה באמצעות מבחני לקטט דהידרוגנאז שיטה מיקרוסקופיים ניצול טכנולוגיית ImageJ. מהות עמילואיד cytotoxins האלה הודגם על ידי מבחני הכריכה T thioflavin על ידי immunoblotting ו- immunodepletion באמצעות נוגדן נגד עמילואיד A11. ניתוחים נוספים באמצעות immunoblotting הפגינו טאו oligomeric ו- Aβ המיוצר ושוחרר על ידי תאי אנדותל בעקבות זיהום aeruginosa פ. שיטות אלה צריך להיות בקלות להתאמה ניתוחים של דגימות קליניות אנושי.

Assay פשוטה במבחנה פותחה כדי assay לנוכחות של cytotoxins ב supernatants של תאים נגועים החיידק aeruginosa פ. בעיקרון, האמצעי התרבות תאים נגועים נאסף 4 שעות לאחר תוספת חיידקים, החיידקים יוסרו על ידי מסנן עיקור של התרבות supernatant, ואז תגובת שיקוע סטרילי מתווסף אוכלוסיה חדשה של תאים. התאים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa at JoVE.com

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

5.5K Views.  University of South Alabama. שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.

Video: Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

הכנה<em&gt; In vivo</em&gt; השתמש של Probe פעילות מבוססת עבור<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine חומצה Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Biochemistry

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

תרבות של וריאציה של המושבה הקטנה של הפסאודומונס וככמת של האלגיאט

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes susceptibility to bacterial infections in the respiratory system. However, the effects of cigarette smoking on bacterial infections in human lung epithelial cells have yet to be thoroughly studied. Described here is a detailed protocol for the preparation of cigarette smoking extracts (CSE), treatment of human lung epithelial cells with CSE, and bacterial infection and infection determination. CSE was prepared with a conventional method. Lung epithelial cells were treated with 4% CSE for 3 h. CSE-treated cells were, then, infected with Pseudomonas at a multiplicity of infection (MOI) of 10. Bacterial loads of the cells were determined by three different methods. The results showed that CSE increased Pseudomonas load in lung epithelial cells. This protocol, therefore, provides a simple and reproducible approach to study the effect of cigarette smoke on bacterial infections in lung epithelial cells.

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Described here is a protocol to study how cigarette smoke extract affects bacterial colonization in lung epithelial cells.

מחקר השפעות של עשן סיגריות על זיהום פסאודומונס בתאי אפיתל ריאות

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

בדיקות יעילות אנטיביוטית במודל אקס ויוו של פסאודומונס aeruginosa ו Staphylococcus aureus Biofilms בריאה סיסטיק פיברוזיס

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in bacterial infections and constitutes a hallmark of potential threat. Therefore, examining the adherence of bacteria to host cells can be used as a component of bacterial threat assessment. A standard method for enumerating bacterial adherence to host cells is to co-incubate bacteria with host cells, harvest the adherent bacteria, plate the harvested cells on solid media, and then count the resultant colony forming units (CFU). Alternatively, bacterial adherence to host cells can be evaluated using immunofluorescence microscopy-based approaches. However, conventional strategies for implementing these approaches are time-consuming and inefficient. Here, a recently developed automated fluorescence microscopy-based imaging method is described. When combined with high-throughput image processing and statistical analysis, the method enables rapid quantification of bacteria that adhere to host cells. Two bacterial species, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Listeria monocytogenes and corresponding negative controls, were tested to demonstrate the protocol. The results show that this approach rapidly and accurately enumerates adherent bacteria and significantly reduces experimental workloads and timelines.

Detection of host-bacterial pathogen interactions based on phenotypic adherence using high-throughput fluorescence labeling imaging along with automated statistical analysis methods enables rapid evaluation of potential bacterial interactions with host cells.

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...