תרבות של וריאציה של המושבה הקטנה של הפסאודומונס וככמת של האלגיאט

גרסה מושבה קטנה או טכניקת SCV מאפשר בחירה וצמיחה של גרסאות מושבה קטנות של פסאודומונס aeruginosa. השיטה היא מאוד סופית ומאפשרת בחירה קלה יותר מאשר שיטות רגילות. פרוטוקול זה מפרט גם שיטת ELISA בטוחה ורגישה יותר לכימות אלגינט בהשוואה לשיטה הסטנדרטית של חומצה אונית קרבזול, המאפשרת כימות אלגינט ישיר בדגימות ללא צרוב או מניפולציה לדוגמה.

הדגימו את ההליך יהיו ברנדון קירבי, טכנאי מעבדה, ורוי אל אחמר, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לזהות את גרסה המושבה הקטנה או SCV, הראשון פס זן P.aeruginosa PAO1 דלתא PYRD על לוחות PIA מחומם מראש. לגדל את הזנים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.

על לוחית הגדילה, זהה מבודד מושבה אחת שיש לו פנוטיפ SCV המאופיין בגודל מושבה של 1 עד 3 מילימטרים לעומת גודל המושבה הרגיל של שלושה עד חמישה מילימטרים. רצף מחדש של המושבות שנבחרו כדי להשיג בידוד טהור של ה- SCV. כדי לבצע הפעלה פיזיולוגית של מסלול ההצלה, השתמש בלולאת חיסון סטרילית כדי לבחור את מושבת SCV מצלחת ה- PIA.

פס המושבה שנבחרה על צלחת PIA מחוממת מראש בתוספת 0.1 מילימולרס uracil. לגדל את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 עד 48 שעות. כדי להתחיל את מבחן החומצה האורית קרבזולה, לזהות מושבה אחת מתרבות טהורה של הזן הרצוי להיבדק ולבחור את המושבה באמצעות קיסם סטרילי.

מניחים את הקיסם במבחנה תרבותית המכילה חמישה מיליליטר של PIB. לגדול באינקובטור שייקר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר הדגירה, הוסיפו אליקוט של מרק PIB מתורבת על צלחת PIA מחוממת מראש.

באמצעות מפזר תאים סטרילי, להפיץ את המרק על הצלחת לגדול ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. באמצעות בקר פיפטה ופיפט סטרילי 50 מיליליטר, להוסיף 0.85% נתרן כלורי למדשאת המבוגרים ולאסוף את המדגם על ידי גירוד הצלחת באמצעות מפזר תאים. שאף את הדגימה באמצעות פיפטה טרייה של 50 מיליליטר והעבר לצינור איסוף של 50 מיליליטר.

Vortex המדגם על גבוה לערבב ול למקם את הדגימות על קרח. כדי למדוד את OD600 של הדגימות, תחילה ריק ספקטרופוטומטר באמצעות מיליליטר אחד של 0.85% נתרן כלורי. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של המדגם כדי cuvette חד פעמי חדש ולקרוא את OD. חזור על שלב זה פעמיים כדי לקבל שלם של קריאות עבור כל מדגם.

עכשיו להוסיף שלושה מיליליטר של חומצה גופרתית borate פתרון לתוך צינורות תרבות ולתת לשבת על קרח. מוסיפים 350 מיקרוליטרים של הדגימה שנאספה לאט לתערובת החומצה במבחנות. לאחר מערבולת קצרה על נמוך, להוסיף 100 microliters של 0.1% carbazole ותסכול אתנול לתערובת דגימת חומצה.

מכסים את הצינור והמערבולת על ההגדרה הבינונית למשך חמש שניות. לאחר מכן מניחים באמבטיה יבשה ב 55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, מערבולת הצינורות לזמן קצר על גבוה ולאפשר להתקרר במשך חמש דקות.

השתמש בצינור עם 0.85% נתרן כלורי כריק לספקטרופוטומטר. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של התערובת כדי cuvette נקי ולקרוא את OD של הדגימות ב 530 ננומטר על ספקטרופוטומטר. הכן עקומה סטנדרטית על ידי מדידת OD530 של דילול סדרתי של ריכוזים ידועים של חומצה d-mannuronic.

חזור פעמיים וחלץ משוואה ליניארית מקריאות אלה. לחשב את הריכוז של alginate בכל מדגם באמצעות העקומה הסטנדרטית ולחלק את ריכוז alginate משוואה ליניארית על ידי OD600 כדי לקבל את הכמות הכוללת של alginate לכל OD600. בעזרת מיקרופיגט, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של הדגימה שנאספה לצלחת לא מטופלת של 96 בארות.

לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מאגר ציפוי ELISA ל בארות. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. באמצעות בקבוק להשפריץ, לשטוף את בארות הצלחת פעמיים עם PBS-T על ידי מילוי בארות ולאחר מכן לנקז אותם על ידי היפוך הצלחת מעל.

מוסיפים 200 מיקרוליטרים של חיץ חסימה ל בארות עם מיקרופיפט ודגירה בארבע מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, לשטוף את הצלחת פעמיים עם PBS-T כמו קודם. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני מדולל ל הבארות ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים.

לאחר הדגירה, לשטוף את בארות הצלחת שלוש פעמים עם PBS-T כמו קודם. לאחר מכן, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של נוגדן משני מדולל ל הבארות ומדגרים ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. לאחר שטיפת הצלחת שוב שלוש פעמים, השתמש micropipette להוסיף 100 microliters של פתרון TMB ELISA.

הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך על ידי הנחת הצלחת לתוך מגירה או לעטוף בנייר כסף. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון עצירה. השתמש בקורא לוחות כדי למדוד את ה- OD ב- 450 ננומטר.

לייצר עקומה סטנדרטית על ידי מדידת OD450 של דילול סדרתי של ריכוזים ידועים של חומצה d-mannuronic. חזור על המידות פעמיים וחלץ משוואה ליניארית. לחשב את הריכוז של alginate בכל מדגם באמצעות העקומה הסטנדרטית ולחלק את ריכוז alginate מהמשוואה ליניארית על ידי OD600 כדי לקבל את הכמות הכוללת של אלגינט לכל OD600.

מוצגות כאן דגימות של PAO581 ו PAO581 עם מוטציות בגנים המסדירים פירמידין דה נובו biosynthesis גדל על PIA ו PIA בתוספת 0.1 מילימולר של uracil. הנתונים מראים כי נוכחות של uracil בתקשורת תוצאות ההמרה של זן המוטנטים בחזרה רירי כפי שניתן לראות על ידי ייצור אלגינט משוחזר. כאן, התוצאות מוצגות עבור ELISA נוגדן חד שבטי אנטי אלגינט מבוסס.

מושבות גדלות על לוחות PIA עם arabinose עבור אינדוקציה של מקדם PBAD ואת פלסמיד pHERD-20T. מוצגים PAO1, PAO1 נושאת את הביטוי פלסמיד pHERD-20T עם alginate הראשי ספציפי גורם סיגמא algU, ו PAO1 עם מחיקה בתוך מסגרת של הגן algD בקידוד האנזים הביוסינתטי אלגינט מפתח GDP-mannose דהידרוגנאז. נתונים אלה משווים את רמות האלגינט הלא-ררית הנמדדות עבור PAO1 ו- PAO1 delta algD לעומת רמות הררית של אלגינט הנמדדות עבור PAO1 עם pHERD-20T algU.

ELISA אנטי אלגינט נבדק גם על דגימות כיחום החולה ללא צמיחה מוקדמת על צלחות. שלוש דגימות כיח CF כי היה צמיחה של P.aeruginosa ריר הראה אלגינט לזיהוי לעומת שתי דגימות כיח החולה שהכילו גם P.aeruginosa שאינו ררית או לא צמיחה P.aeruginosa. הכנת העקומות הסטנדרטיות לכמיית האלגינט היא קריטית מאוד גם ותאפשר מדידה מדויקת ומדויקת של אלגינט בתוך המדגם.

פתרון החומצה המשמש בשיטת קרבזולה מסוכן מאוד ולכן יש להשתמש בציוד מגן אישי ואמצעי זהירות נאותים כדי להבטיח בטיחות. לאחר בידוד SCVs, פרופיל גנטי נוסף יכול להיעשות כדי להבין טוב יותר מוטציות המתרחשות ואת הפתוגניות הקשורים מוטציות כאלה. ניתן להתאים את שיטת ELISA לניטור זיהום ריאות כרוני בחולים עם סיסטיק פיברוזיס.

יתר על כן, שיטת הצמיחה שלנו יכולה לעזור לאבחן זיהומים הנגרמים על ידי SCVs ספציפיים.