מחברים מאוד להכיר את העזרה של בוגדן Osadchiy, ייבגני Protasov (אוניברסיטת המדינה של אירקוטסק, רוסיה) בהכנה של פרוטוקול וידאו. מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הרוסי (#15-14-10008) וקרן רוסי למחקר בסיסי (#15-29-01003).

כל ההליכים ניסיוני נערכו בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי על ניסויים בבעלי חיים, אושרו על ידי החיה נושאים מחקר הוועדה של המכון לביולוגיה באוניברסיטת אירקוטסק.
1. ייצור של מהמיקרו קפסולות
הערה: נושא של הפלורסנט מהמיקרו קפסולות מוכנות תוך שימוש אסיפה שכבה אחרי שכבה של הפוך טעונה polyelectrolytes7,8. כל ההליכים בוצעו בטמפרטורת החדר.
<ol><li>לסנתז נקבובי microcores3 של קאקו, תוחמת את הפלורסנט, מערבבים 2 מ"ל של הפתרון SNARF-1-לתוספי (רוב פולימר מכורך הפלורסנט כגון FITC-BSA יכול לשמש)-ריכוז של ~ 2 מ"ג/מ"ל עם 0.6 מ"ל כל אחד הפתרונות 1 מול/ליטר של CaCl2 ו-2CO נה3 תחת ערבוב מהיר. הערה: שימו לב שהיא התכוונה שונים של צבעי פלורסנט כדי photobleaching; אם בדיקה פלורסנט רגישים לאור (כמו SNARF-1), מניפולציה ואת אחסון של microparticles חייב להתבצע עם כמו אור קטן ככל האפשר.</li>
	<li>לאחר 5-10 s של עצבנות, להעביר את המתלים צינורות microcentrifuge 2 מ"ל, צנטריפוגה 15 s ב 10,000-12,000 g כדי הצניפה קאקו3 microcores.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את הליבות עם ~ 2 מ ל מים יונים, resuspend בגדר ע י ניעור.</li>
	<li>חזור על הפעולות צנטריפוגה-כביסה שלוש פעמים בסך הכל. לאחר צנטריפוגה אחרון, להשליך את תגובת שיקוע.</li>
	<li>דגירה של microcores עבור 1 דקות באמבט אולטראסוני כדי להפחית את מצבור שלהם. התראה: אל תשכחו להגן על האוזניים עם אוזניות.</li>
	<li>להפקיד את השכבה הראשונה פולימריים על התבניות, resuspend הליבות ב ~ 2 מ"ל של פתרון 4 מ"ג/מ"ל של poly(allylamine hydrochloride) (הפה) 1 מול/ליטר NaCl.<ol>
<li>שמור microcores את הפתרון עבור ~ 5 דקות עם טלטול מתמיד.</li>
		<li>לאחר 15 s של צנטריפוגה, למחוק את תגובת שיקוע עם הפה לא מאוגד. לשטוף את microcores מכוסה עם מים יונים לפחות 3 פעמים באמצעות צנטריפוגה מרובים ושטיפת צעדים. לאחר צנטריפוגה אחרון, להשליך את תגובת שיקוע.</li>
		<li>דגירה של microcores עבור 1 דקות באמבט אולטראסוני כדי להפחית את מצבור שלהם. הערה: אם יישומי הפלורסנט cationic, להתחיל פוליפוני (נתרן 4-styrenesulfonate) (PSS) 1 מול/ליטר NaCl (ראה שלב 1.7).</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על שלב 1.6 עם ~ 2 מ"ל של פתרון 4 מ"ג/מ"ל של PSS (גם המכיל mol 1/L NaCl) להפקיד את השכבה השנייה פולימריים על התבניות.</li>
	<li>חזור על שלבים 6 פעמים 1.6 ל- 1.7 להפקיד 12 שכבות פולימריים. הערה: לא מומלץ לקחת הפסקה ארוכה (~ 12 שעות או יותר) במסגרת ההליך עד ~ 3-5 שכבות נצברים קאקו microcores3 ללא כיסוי עשוי נוטים recrystallize. שים לב PSS כיסוי גורם צבירה גבוה יותר של microcores, הפסקה ארוכה, מומלץ שרק כאשר הפה או פולי-L-ליזין הושתל עם פוליאתילן גליקול (PLL-g-PEG) היא השכבה החיצוני ביותר.</li>
	<li>דגירה של microcores מקורה ב- 2 מ"ג/מ"ל של PLL-g-יתד (~ 1 מ"ל לכל microtube) כבר לפחות שעתיים.<ol>
<li>לשטוף את microcores עם מים בעזרת צנטריפוגה רציפים והשלבים resuspension. לאחר צנטריפוגה אחרון, להשליך את תגובת שיקוע.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי להשיג מהמיקרו קפסולות חלול, מתמוסס התבניות3 קאקו על-ידי הוספת 2 מ של 0.1 מול/ליטר ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון (מותאם pH 7.1 עם NaOH) microcores מקורה.<ol>
<li>לאחר ~ 5 דקות של דגירה, centrifuge מהמיקרו קפסולות עבור 45 s ו להשליך תגובת שיקוע עם EDTA.</li>
		<li>חזור על שלבים 1.10-1.10.1 פעמיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף מהמיקרו קפסולות עם 0.9% NaCl 3 פעמים באמצעות צנטריפוגה מספר צעדים בתוך 45 s ולאחריה שטיפה צעדים. לאחר השלב האחרון צנטריפוגה, למחוק את תגובת שיקוע. הערה: הפתרון הסופי microcapsule להזרקה חייב להישמר סטרילי (לדוגמה על-ידי הוספת אמפיצילין, 0.1 מ"ג/מ"ל), התקשורת. לא מסתיימים מושא החקירה (מול מדיה עם חומציות ניטראלית).</li>
	<li>מעריכים את ריכוז מהמיקרו קפסולות מוכן ב hemocytometer תחת מיקרוסקופ זריחה. בסדרת תמונות של מהמיקרו קפסולות, למדוד את הקוטר על מאה מהמיקרו קפסולות באמצעות תוכנה9 או שווה ערך ImageJ, ולחקור את התפלגות גודל באמצעות היסטוגרמה.</li>
	<li>חנות שהושג אנקפסולציה בדיקה בחושך. הערה: לאחר מספר כביסות סטרילי 0.9% NaCl, מהמיקרו קפסולות ניתן לאחסן במשך חודשים-4 מעלות צלזיוס. לא מומלץ ייבוש מוחלט של מהמיקרו קפסולות במהלך האחסון.</li>
</ol>2. הכנת ההתקנה אופטי וכיול של SNARF Microencapsulated-1
הערה: מדידות pH קשה עם SNARF microencapsulated-1 יכול להתבצע באמצעות תמונות בשני ערוצים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי7, אך ב פרוטוקול זה מיקרוסקופ פלואורסצנטי ערוץ אחד מחובר ספקטרומטר סיבים היה מוחל.
<ol><li>מקום קבוצת זריחה מסננים כדי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפי מאפייני הפלורסנט להחיל הנדרש והפעל את נורה פלואורסצנטית.<ol>
<li>למשוך את הידית עיניות. התראה: עודף אור יכול להזיק המטריקס ספקטרומטר. לפיכך, ודא כי המנוף הוא במצב "עינית" כאשר ספקטרומטר אינו בשימוש.</li>
		<li>חבר קצה אחד של סיבים אופטיים של ספקטרומטר ואת הקצה השני קולימטור. באמצעות מתאמי, מקם את קולימטור המוקד של הצינור מצלמה או אחרים היציאות הזמינות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
		<li>הפעל את ספקטרומטר. הפעל את תוכנית בקרה ספקטרומטר ולהתכונן ספקטרומטר את המידות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לצורך כיול של אצוות microcapsule, מקום ~ 5 µL של ההשעיה microcapsule (~ 10 000 מהמיקרו קפסולות לכל µL במים יונים) בשקופית מיקרוסקופ, יבש הירידה במקום חשוך (לדוגמה, בתרמוסטט-35 ° C).<ol>
<li>כדי לכייל את מאפייני ספקטרלי של microencapsulated SNARF-1, השתמש סדרה של מאגרי בערכי pH שונים בטווח ~ 6-9. זרוק ~ 10 µL של מאגר על גבי מהמיקרו קפסולות מיובשים עם SNARF-1-לתוספי, לכסות את זה עם coverslip.</li>
		<li>מקם את השקופית זכוכית על הבמה מיקרוסקופ. אתר מהמיקרו קפסולות באמצעות יעד 40 ×.</li>
		<li>לפנות את ידית מיקרוסקופ יציאת המצלמה. הירשם פלורסצנטיות שלהם עם ספקטרומטר. להפוך את הידית בחזרה אל עיניות. הערה: ודא כי האות ספקטרלי הוא הרבה מעבר לרמת הרקע ולהבטיח כי מהמיקרו קפסולות של שדה הראייה אינם בבועה (על-ידי המעבר הגדלה נמוכה במידת הצורך). הימנע תאורה ממושך של אותו מהמיקרו קפסולות. SNARF-1 הוא רגיש photobleaching.</li>
		<li>חזור על צעד 2.2.3 10 - 15 פעמים מהמיקרו קפסולות שונות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחשב את יחס שיא קרינה פלואורסצנטית (לדוגמה, שימוש R או Scilab) עבור כל ספקטרום רשום ולקבוע קו הרגרסיה בין יחס החציוני (עבור כל מאגר) בינוני pH באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg"> הערה: SNARF-1 יש קשת עם שתי הפסגות התואם פליטת לצבוע protonated ו- deprotonated, היחס בין הפסגות מגיבים ה-pH של המדיום. במחקר זה, משמש היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית עבור 605, 660 ננומטר. אורכי גל אלה נבחרו בהתאם לקבוצת מסנן בשימוש. ו- b הם המקדמים שייקבעו ע י רגרסיה ליניארי (לדוגמה, שימוש R). הערכים 0.15 ו- 1.1 הם, בהתאמה, ערכי המינימום והמקסימום של אני605/I660 נצפתה במהלך הכיול.</li>
	<li>לאסוף 10 µL של דם דגים כ 5 חיות למבוגרים. המקום דגים לתוך צלחת פטרי עם µL 1/מ"ל מים השעיה של שמן ציפורן על הרדמה ולחכות עד החיה מסתובב על צידה, מפסיק להגיב קמצוצים הסנפיר (בדרך כלל ~ 2-3 דקות). להעביר את הדג על משטח זכוכית. לנתק את הזנב דגים עם אזמל מנתחים ולאסוף כ 2 µL של דם דגים מן הווריד של הזנב. הערה: כדי למנוע קרישת הדם, לטיפול החתך עם הפרין (5000 U/mL) ולהשתמש נימים זכוכית heparinized וצינורות microcentrifuge כדי לאסוף את הדם.<ol>
<li>לטפטף בערך 10 µL של דם עם פיפטה אל קצה microelectrode ולקבוע את ה-pH באמצעות מד pH.</li>
		<li>זרוק את הדם לשקופית עם מהמיקרו קפסולות מיובשים ולרשום את היחס של עוצמת קרינה פלואורסצנטית כמתואר על המאגרים כיול (שלבים 2.2-2.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>התאם את מקדם ליניארי של עקומת כיול כדי להפוך את עקומת להתאים את המידות בדם דגים (עבור פרטים נוספים ראה Borvinskaya et al. . 20175).</li>
</ol>3. הכנה הזרקה
<ol><li>שחרר את המחט פלדה מהקצה של עט אינסולין (או מזרק) על-ידי הסרת הפלסטיק עם אזמל מנתחים חדה. הערה: כל מחט דקה (Ø0.33 מ מ או פחות) או יכול להיות מוכנים נימי זכוכית (בדרך כלל Ø1 מ"מ) microinjection10,11.</li>
	<li>להכניס את המחט בחצי הדרך microcapillary זכוכית; במהירות ובעדינות הלחמה אותו באמצעות מבער גז.</li>
	<li>לחבר את microcapillary זכוכית microinjector ולא לשטוף את זה עם מים סטריליים שלוש פעמים. ודא כי הנוזל זורם דרך המחט.</li>
	<li>למלא את המערכת עם מים מזוקקים. הערה: ודא כי קיימים אין בועות בתוך המערכת.</li>
</ol>4. הזרקה
<ol><li>Resuspend על השעיית מהמיקרו קפסולות מוכן (סטרילי 0.9% NaCl או לכל מדיה אחרת המשמשים הזריקות, עם ריכוז של 0.5 ל 6 מיליון פרצת לכל microliter) באמצעות האמבט קולי עבור 1 דקות. הערה: מאז מהמיקרו קפסולות נוטים לזרז, במהלך הזריקה הבאה, לנער את המבחנה עם מהמיקרו קפסולות מכנית (באמצעות רוטור) או באופן ידני כל כמה דקות כדי resuspend אותם ולמנוע צבירת שלהם.</li>
	<li>מניחים את הדג לתוך צלחת פטרי עם הרדמה (0.1 מ"ל/ליטר של שמן ציפורן מושעה במים) עבור ~ 2-3 דק. חכה עד הדגים מסתובב על צידה, מפסיק להגיב קמצוץ אור של הסנפיר.</li>
	<li>בעזרת כפית, להעביר את הדג מהאגף ההרדמה ומניחים בעדינות אותו על ספוג לח במצב לרוחב עם הראש לכיוון השמאל (עבור אדם ימני) או לכיוון ימין (לאדם שמאלי).</li>
	<li>לפני הזריקה, למצוץ 1-2 מ מ של אוויר לתוך כוס נימי קשור microinjector. אז, לעזאזל עם µL כ- 2 של מהמיקרו קפסולות התפזרו. הערה: לפני הזריקה, הפתרון microcapsule חייב להיות מותאם לטמפרטורה שבה נשמרים הדג.</li>
	<li>בעדינות לייצב את הגוף של הדג על הספוג ביד האחרת.<ol>
<li>למצוא את קו הצד של הדג. נפשית בחר מקטע המרחיבה operculum לסופו של חלל הבטן. למצוא את האמצע של קטע זה. לשים את המחט 1 מ מ נמוך יותר כיוון הגחון.</li>
		<li>עם תנועה מגרד, להניע בעדינות הדג קשקשים הצידה, וגם לעשות נקב. הכנס את המחט לתוך הגוף בזווית של 45 מעלות על פני השטח בטבלה.</li>
		<li>דחוף את המחט לכיוון עמוד השדרה עד שתוצב בקפידה נגד זה.</li>
		<li>שחרור כ 1 µL של ההשעיה של מהמיקרו קפסולות לתוך הכליה, לאט לאט למשוך את המחט. הערה: כדי למצוא את החדירה נכונה בקלות רבה יותר, שימושי לאימון מציאת עורק הכליה על ידי transilluminating הדגים באמצעות אור למטה, כפי שמוצג 2A ו- 2B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשטוף את הדג מהראש אל הזנב עם זרם מים כדי להסיר כל מהמיקרו קפסולות שנשפך באתר הזרקת.</li>
</ol>5. להדמיה in Vivo
<ol><li>להשתמש את המספריים לנתיחה כדי להסיר את מכסה הזימים ראש דג, מערטל את הזימים של דג. שטוף הזימים עם מים.</li>
	<li>בעזרת כפית, להעביר את הדג על שקופית מיקרוסקופ, ומניחים אותו על השלב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הערה: ודא כי הגג של הדג לא יתייבש במהלך הליכי רצופים. כדי למנוע זאת, מדי פעם להרטיב אותן עם מים באמצעות פיפטה של פסטר (כ כל דקה 1-2).</li>
	<li>להכהות את החדר, באמצעות הגדלה נמוכה (x 10 המטרה) לבדוק הזימים למצוא מהמיקרו קפסולות פלורסנט. הערה: כאשר ההליך משמשת היכרות ראשונית של כמה חלקיקים פלורסנט לתוך מערכת הדם דגים, מומלץ לבחון זימים של כמה אנשים עבור חלקיקים פלורסנט לא צפוי לפני זריקות. זימים של פראי-סוג דג זברה autofluorescence, אך במקרים מסוימים חלקיקים פלורסנט ספורדי (כמו חתיכות אוכל או אנחנו חיים איתם בסמביוזה חד־תאיות) עשוי להיות נוכח על הזימים. אם יש צורך, חלקיקים כאלה ניתן לזהות המבוססת על צורתם ספציפי (לדוגמה, חתיכות אוכל יש צורה לא סדירה, בניגוד מהמיקרו קפסולות כדורית) או ספקטרום קרינה פלואורסצנטית (קרי, צבע).<ol>
<li>לעבור את העדשה גבוה יותר בסולם ריכטר (המטרה × 40), והצב את microcapsule או קבוצת מהמיקרו קפסולות במרכז שדה הראייה.</li>
		<li>לפנות את הידית היציאה עם ספקטרומטר מחוברים. להקליט את האות ספקטרלי.</li>
		<li>להפוך את הידית בחזרה אל העינית.</li>
		<li>חזור על המדידות מספר פעמים מהמיקרו קפסולות שונות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את הדגים באקווריום עם אוורור נאות להתאוששות. הערה: עם אימון מינימלי, זה אפשרי לבצע את ההזרקה ושידור הקלטת בשיעור מקורב של 2-3 דקות לכל דג. ניתן לחזור על המדידה עבור אחד מספר פעמים בודדות עם השימוש במינון נמוך, לא מזיק חוזרות ונשנות של הרדמה או שיטה אחרת של קיבעון. להשגחה לטווח ארוך, להשתמש במערכת עם הרדמה רציפה12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+and+microparticles+of+polymers+and+polysaccharides+to+administer+fish+vaccines.">Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines.</a> Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).</li><li>Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+polyelectrolyte+microcapsules+as+a+contrast+agent+for+photoacoustic+imaging+in+blood.">Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood.</a> J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).</li><li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish.">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).</li><li>Gurkov, A., Shchapova, &. #. 1. 0. 4. 5. ;., Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+in+vivo+stress+assessment+of+aquatic+animals+with+microencapsulated+biomarkers+for+environmental+monitoring.">Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring.</a> Sci. Rep. 6, e36427 (2016).</li><li>Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+in+vivo+monitoring+of+pH+in+gill+capillaries+and+muscles+of+fishes+using+microencapsulated+biomarkers.">Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers.</a> Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).</li><li>Diep, C. Q., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+cells+directly+into+the+kidney+of+adult+zebrafish.">Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).</li><li>Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+microcapsules+as+mobile+local+pH-sensors.">Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors.</a> J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).</li><li>Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+bio-markers+for+assessment+of+stress+conditions+in+aquatic+organisms+in+vivo.">Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo.</a> Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide - Version 1.44. , (2012).</li><li>Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+brain+microinjection+to+study+molecular+substrates+of+motivated+behavior.">Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior.</a> J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).</li><li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+serial+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+mouse.">A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).</li><li>Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+brain+of+intact+adult+zebrafish.">Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).</li><li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney.">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).</li><li>McKee, R. A., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+renal+pathology:+Emerging+models+of+acute+kidney+injury.">Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury.</a> Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).</li><li>Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., M&#246;hwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+hollow+polymer+shells+by+colloid-templated+assembly+of+polyelectrolytes.">Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).</li><li>Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., M&#246;hwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonate+microparticles+for+hollow+polyelectrolyte+capsules+fabrication.">Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication.</a> Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).</li><li>Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+biocompatible+polymer+microcapsules+with+near-infrared+emitting+nanocrystals.">Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals.</a> Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).</li><li>Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+encapsulation+via+porous+CaCO3+microparticles+templating.">Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).</li><li>Tzaneva, V., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Time+differential+staining+technique+coupled+with+full+bilateral+gill+denervation+to+study+ionocytes+in+fish.">A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish.</a> J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כדי להדגים את הזריקה של microparticles לתוך הכליה דג זברה, השתמשנו חדיר למחצה מהמיקרו קפסולות עמוסה של אינדקטור. כך, הפרוטוקול מכיל הוראות להרכבת מהמיקרו קפסולות באמצעות מכלול שכבה אחרי שכבה טעונה הפוך polyelectrolytes7,8,15,16,<sup ...

המינהל של חלקיקים בגודל מיקרו לתוך אורגניזם בעל חיים הינה משימה חשובה בתחומים כמו סמים, חיסון משלוח1, להערכת ויזואליזציה2, תא הטרנסגניים השרשה3וחיישן אופטי זעיר השרשה 4 , 5. עם זאת, הליך ההשתלה microscale חלקיקים לתוך מערכת כלי הדם של חיות מעבדה קטנה קשה, במיוחד עבור אורגניזמים ימיים עדין. עבור דגימות מחקר פופולרי כמו דג זברה, מומלץ כי הליכים אלה מובהר, שימוש בפרוטוקולי הוידאו.
Microinjections intracardiac, נימי דורשים צוות מיומן ומתקני למיקרו ייחודי למסירה של microobjects לדם דג זברה. בעבר, הזרקת ידנית רטרו-מסלולית3 הוצע כמו שיטת קלה ויעילה לניהול התוכן של תאים שלמים. עם זאת, מניסיוננו, בגלל שטח קטן של הרשת נימי העין, זה לוקח הרבה ניסיון כדי להשיג את התוצאה הרצויה של טכניקה זו.
במסמך זה, אנו מתארים שיטה חזקה ויעילה microparticle השרשה לתוך מערכת הדם על ידי זריקה ידנית ישירות לתוך רקמת הכליה של דג זברה בוגרת, אשר הוא עשיר נימים וכלי כליות. טכניקה זו מבוססת על פרוטוקול וידאו עבור השתלת תא לתוך הכליה דג זברה6, אך השלבים המיקרוכירורגית טראומטי ולגזול חוסלו. השיטה המוצעת מאופיין התמותה נמוכה (0-20%) ואת יעילות גבוהה (70-90% הצלחה), וזה קל של מכון התקנים באמצעות ציוד זמין נפוץ.
חלק חשוב של הפרוטוקול המוצע הוא החזיית מושתל microparticles (אם הם נמצאים פלורסנט או ולצבוע אותם) הנימים גיל, מה שמאפשר עבור האימות של איכות הזרקה, הערכה יחסית קשה של מספר חלקיקים מוזרק, זיהוי האות ספקטרלי מדידות פיזיולוגיות ישירות מתוך במחזור הדם. כדוגמה היישומים האפשריים של הטכניקה המתוארת, נדגים את פרוטוקול ויוו מדידות של דג זברה החומציות בדם באמצעות בדיקה פלורסנט microencapsulated, SNARF-1, Borvinskaya שהוצע במקור ב et al. 20175.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-dextran, 70000 MW</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler</td></tr><tr><td>Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>Fluorescent probe</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>Fluorescent probe</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>Cationic polymer</td></tr><tr><td>Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>Anionic polymer</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>To dissolve applied polymers</td></tr><tr><td>Water Purification System</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>To prepare deionized water</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Stegler</td><td></td><td>For CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates formation</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research&amp;nbsp;plus pipette, 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Research&amp;nbsp;plus pipette, 10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips, volume range 200 to 1000 &amp;micro;L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips, volume range 0.1-10&amp;nbsp;&amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>Dosing solutions</td></tr><tr><td>Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed</td><td>BioSan</td><td></td><td>For microcapsule centrifugation-washing procedure</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Microcapsule synthesis and storage</td></tr><tr><td>Shaker Intelli-mixer RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>To reduce microcapsule aggregation</td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td></td><td></td><td>To reduce microcapsule aggregation</td></tr><tr><td>Head phones&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>To protect ears from ultrasound</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>To dissolve the CaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; templates</td></tr><tr><td>Monosodium phosphate</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>Preparation of pH buffers</td></tr><tr><td>Disodium phosphate</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>Preparation of pH buffers</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>To adjust the pH of the EDTA solution and buffers</td></tr><tr><td>Thermostat chamber</td><td></td><td></td><td>To dry microcapsules on glass slide</td></tr><tr><td>Hemocytometer blood cell count chamber</td><td></td><td></td><td>To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>In vivo visualization of microcapsules in fish blood</td></tr><tr><td>Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided)</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>Visualization of microcapsules with fluorescent probes</td></tr><tr><td>Fiber spectrometer QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 &amp;mu;m, 2 m</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>To connect spectrometer with microscope port</td></tr><tr><td>Collimator F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>To connect spectrometer with microscope port</td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Coverslips, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>Calibration of microcapsules under microscope</td></tr><tr><td>Glass microcapillaries Intra MARK, 10 &amp;micro;L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>To collect fish blood</td></tr><tr><td>Clove oil</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>Fish anesthesia</td></tr><tr><td>Lancet No 11</td><td>Apexmed international B.V.</td><td>P00588</td><td>To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector</td></tr><tr><td>Heparin, 5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection</td></tr><tr><td>Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>To determine fish blood pH</td></tr><tr><td>Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>For injection procedure. Any thin needle (&amp;Oslash; 0.33 mm or less) is appropriate</td></tr><tr><td>Glass capillaries, 1 x 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger&amp;auml;te GmbH &amp;amp; Co</td><td>9201075</td><td>For injection procedure</td></tr><tr><td>Gas torch</td><td></td><td></td><td>To solder steel needle to glass capillary</td></tr><tr><td>Microinjector IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>For precise dosing of microcapsules suspension</td></tr><tr><td>Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Plastic spoon</td><td></td><td></td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Damp sponge</td><td></td><td></td><td>For manipulations with fish under anesthesia</td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>To remove the gill cover from the fish head</td></tr><tr><td>Pasteur pipette, 3.5 mL</td><td>BRAND</td><td>Z331767</td><td>To moisten fish gills</td></tr></tbody></table>

simple and effective administration and visualization of microparticles in the circulatory system of small fishes using kidney injection

המינהל מערכתית של חלקיקים בגודל מיקרו לתוך אורגניזם יכול להיות מיושם להערכת ויזואליזציה, סמים, משלוח חיסון, ההשתלה של תאים הטרנסגניים וחיישנים אופטי זעיר. עם זאת, microinjections תוך ורידי לתוך חיות קטנות, אשר משמשים בעיקר במעבדות ביולוגי, וטרינרית, קשה מאוד, דורשת צוות מיומן. במסמך זה, נדגים שיטה חזקה ויעילה המבוא של microparticles לתוך מערכת הדם של דג זברה למבוגרים (רזבורה rerio) על ידי זריקה לתוך הכליה דגים. כדי להמחיש את microparticles הציג ב להערכת, אנו מציעים טכניקה פשוטה הדמיה intravital ב זימים של דג. In vivo ניטור pH הדם דג זברה הושג באמצעות פלורסנט microencapsulated מוזרק בדיקה, SNARF-1, כדי להדגים את אחד היישומים האפשריים של הטכניקה המתוארת. מאמר זה מספק תיאור מפורט העטיפה של pH רגיש צבע ומדגים את עקרונות הזריקה מהירה והדמיה של מהמיקרו קפסולות שהושג ויוו הקלטה של האות פלורסנט. השיטה המוצעת של הזרקת מאופיין על ידי שיעור התמותה נמוכה (0-20%) ואת יעילות גבוהה (70-90% הצלחה), וזה קל של מכון התקנים באמצעות ציוד זמין נפוץ. ניתן לבצע בכל ההליכים המתוארים במינים אחרים של דגים קטנים, כגון דגים ו- medaka.

התוצאות שהושג בא מאחד לשלוש קטגוריות עיקריות של פרוטוקול שהוצגו: היווצרות של פלורסנט microparticles על ידי ומגעים צבע פלורסנט (איור 1), הזרקה כליות של מהמיקרו קפסולות עם עוד יותר את הפריט החזותי גיל נימים (איור 2 ו 3) וההקלטה, בסו?...

Watch this Scientific Journal Video about Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection at JoVE.com

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

מאמר זה מדגים את העקרונות של זריקה מהירה, פולשנית של פלורסנט microparticles את circulatory system של דגים קטנים, הפריט החזותי ויוו של microparticles בדם דגים.

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

simple-effective-administration-visualization-microparticles

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Views.  Institute of Biology at Irkutsk State University. מאמר זה מדגים את העקרונות של זריקה מהירה, פולשנית של פלורסנט microparticles את circulatory system של דגים קטנים, הפריט החזותי ויוו של microparticles בדם דגים.

Video: Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Optimized Intravenous Injection in Adult Zebrafish

Intravenous (IV) injection is widely recognized as the most effective and commonly utilized method for achieving systemic delivery of substances in mammalian research models. However, its application in adult zebrafish for drug delivery, stem cell transplantation, and regenerative and cancer studies has been limited due to the challenges posed by their small body size and intricate blood vessels. To overcome these limitations, alternative injection techniques such as intracardiac and retro-orbital (RO) injection have been explored in the past for stem cell transplantation in adult zebrafish. However, these techniques have their drawbacks, including the need for meticulous injection techniques or increased risk of mortality.
In this study, we have developed a refined and optimized IV injection procedure specifically tailored to adult zebrafish, addressing the challenges associated with their unique anatomy. To demonstrate the effectiveness of this technique, we performed successful IV injections of whole kidney marrow cells from Tg(mpo: EGFP) fish and FITC-dextran dye into adult Casper fish. The subsequent visualization of injected cells and dyes using a fluorescence microscope confirmed their successful delivery and engraftment within the zebrafish. Furthermore, we demonstrated that compared with the intracardiac and RO injections, the IV injection resulted in improved survival rates and engraftment efficiency in treated zebrafish. This approach enables precise delivery and localization of substances and holds great potential for large-scale drug and chemical screening using adult zebrafish. Additionally, the ability to visually track the injected cells and dyes provides invaluable insights into their engraftment, migration, and interactions with host tissues, enabling a more comprehensive evaluation of therapeutic effects and biological processes in zebrafish models.

Here, we present an optimized and effective protocol for the intravenous injection of cells or pharmacological agents into adult zebrafish, resulting in enhanced cell engraftment and increased survival rates of the treated zebrafish.

הזרקה תוך ורידית אופטימלית בדגי זברה בוגרים

Intravenous (IV) injection is widely recognized as the most effective and commonly utilized method for achieving systemic delivery of substances in ...

Cancer Research

Intramyocardial Injection for the Study of Cardiac Lymphatic Function in Zebrafish

Zebrafish have proved to be an important model for studying cardiovascular formation and function during postembryonic development and regeneration. The present protocol describes a method for injecting fluorescent tracers into the zebrafish myocardium to study interstitial fluid and debris uptake into cardiac lymphatic vessels. To do so, microspheres (200 nm diameter) and quantum dots (&#60;10 nm diameter) are introduced into the myocardium of live zebrafish, which can be tracked using ex vivo confocal microscopy. These tracers are then tracked intermittently over several hours to follow clearance from the myocardium into cardiac lymphatic vessels. Quantum dots&#160;are transported through cardiac lymphatic vessels away from the heart, while larger microspheres&#160;remain at the injection site for over three weeks. This method of intramyocardial injection can be extended to other uses, including the injection of encapsulated MS or hydrogels to locally release cells, proteins, or compounds of interest to a targeted region of the heart.

<meta charset="utf8"></head><body>הזרקה ללב לחקר תפקוד הלימפה הלבבי בדג הזברה

The present protocol allows efficient and stable delivery of fluorescent microspheres (MS) and quantum dots (QD) into the myocardium of live fish that can be tracked (traced) over time.

הזרקה ללב לחקר תפקוד הלימפה הלבבי בדג הזברה

Zebrafish have proved to be an important model for studying cardiovascular formation and function during postembryonic development and regeneration. The ...

Developmental Biology

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

Micropuncture של השטח של באומן בעכברים בהנחייתם של מיקרוסקופיית פוטון 2

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

הזרקה תוך ורידית אופטימלית בדגי זברה בוגרים

הזרקה ללב לחקר תפקוד הלימפה הלבבי בדג הזברה

הזרקה ללב לחקר תפקוד הלימפה הלבבי בדג הזברה

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

הערכה של תפקוד כליה דג הזברה באמצעות assay עמילות פלורסנט

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

Micropuncture של השטח של באומן בעכברים בהנחייתם של מיקרוסקופיית פוטון 2