Name: rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing at JoVE.com

אנו מודים משתתפי המחקר האונקולוגי קבוצה AAML1531 של הילדים, האחיות של בריאות עיון על תרומתם בצורה של דגימות החולה. עבודה זו מומן על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (UM1 CA186107, RO1 CA49449, RO1 CA149445), גילוי מכון וושינגטון אוניברסיטת של הילדים ו סנט לואיס לילדים חולים (MC-II-2015-461), וקרן אלי סת מתיוס לוקמיה.

<ol>
	<li>Hoang, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+quantification+of+rare+somatic+mutations+in+normal+tissues+using+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations.">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li><li>Young, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+ultra-rare+pre-leukemic+clones+via+targeted+error-corrected+sequencing.">Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing.</a> Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).</li><li>Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+hematopoiesis+harbouring+AML-associated+mutations+is+ubiquitous+in+healthy+adults.">Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults.</a> NatureCommunications. 7, 12484 (2016).</li><li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia.">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).</li><li>Kohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+residual+disease+by+next-generation+deep-sequencing+of+RUNX1+mutations+can+identify+acute+myeloid+leukemia+patients+with+resistant+disease.">Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease.</a> Leukemia. 28, 129-137 (2014).</li><li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq:+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring.">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li><li>Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+rare+mutations+with+massively+parallel+sequencing.">Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).</li><li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing.">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li><li>Vander Heiden, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pRESTO:+a+toolkit+for+processing+high-throughput+sequencing+raw+reads+of+lymphocyte+receptor+repertoires.">pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires.</a> Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA.">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).</li><li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAGERI:+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing.">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480 (2017).</li><li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia.">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li><li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues.">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li><li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA.">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415 (2017).</li><li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers.">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

. הנה, נדגים מחבילת פרוטוקולים של רצף שגיאות ניתן ליישם בקלות ללמוד מוטציות עם VAFs נמוך במחלות שונות. הגורם החשוב ביותר הוא שילוב של UMIs עם כל מולקולה לפני רצף הם מאפשרות תיקון השגיאות הקריאות raw. השיטות המתוארות כאן מאפשרים לשלב UMIs מותאם אישית לוחות הגן זמינים מסחרית והן בעיצוב עצמי oligos גנים ספציפיים.
תקן הגדרות פרוטוקול מונע זיהוי מוטציות עם VAF מתחת 2% שיעור שגיאה רצף, זה מגביל את היישום של המיתרים במחקרים בו הגילוי של גרסאות נדיר הוא קריטי. על ידי עקיפת התעריף הסטנדרטי של שגיאה המיתרים, ECS מאפשר זיהוי רגיש גרסאות אלה raw. למשל, זיהוי של מוטציות פתוגניים כאשר מוטציות אלה נובעים קודם (ולכן יש VAF נמוך) הכרחי ליידע את התערבות מוקדמת של מחלת ה-14,15. במחקר לוקמיה, הגילוי של ממסר מינימלי (תאים לוקמיה שיורית שלאחר הטיפול) מודיע ריבוד סיכון ומחלות יכול לשמש כדי ליידע את אפשרויות הטיפול בצורה בינארית זרימת cytometric הערכות לא יכולה. בנוסף, ה-ECS ישימה לזהות חומצת גרעין הגידול במחזור, כדי להעריך את פוטנציאל גרורתי בחולים גידולים מוצקים על-ידי הערכת העדר/הנוכחות, כמו גם את הנטל וריאנט של מוטציות מסוימות הם מאפייני העיקרית הגידול16.
כפי שמתואר בטבלה1, הכוח של באמצעות מודל המבוסס על התפלגות בינומית שגיאה ספציפית עמדה להתקשר גרסאות תלויה במידה רבה מספר ספריות ברצף, כמו גם את העומק של רצף ששימשו לבניית המודל שגיאה. החוסן של המודל שגיאה עולה עם מספר גבוה יותר של דוגמאות ועומק רצף נוסף. מומלץ להשתמש לפחות 10 דגימות ברצף עם ממוצע של שגיאות קריאה סיקור x 3000 לדגימה לבנות פרופיל של שגיאה עבור כל דגימה. הגישה מיקום ספציפי היא דומה MAGERI, אך במקום להשתמש שיעור שגיאה צבירה עבור כל סוגי שונים החלפת 6 (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, אנחנו מודל כל החלפת באופן עצמאי בבית בכל תנוחה. למשל, שיעור שגיאה של C > T במיקום גנומית נתון שונה ממיקום אחר. הגישה שלנו גם לוקח בחשבון את אפקט רצפי אצווה, כמו קצב החלפת בסיס שנצפתה ריצה רצף אחת עשויים להיות שונים מאלה עוד ריצה. לכן חשוב ליצור מודל לכל תפקיד לכל סוגי החלפת במיוחד כאשר דגימות שונות רצף הרצפים הם איחדו לבנות את המודל.
שיקול חשוב בעת תכנון ניסוי ECS הוא הסף זיהוי הרצוי. היופי של מחקרים המיתרים היא כי הם ניתן בקלות לשנות מבחינת גנים/מטרות של הריבית, זיהוי סף (שמכתיבה עומק של רצף) ומספר של יחידים שאילתה. לדוגמה, אם החוקרים מעוניינים למצוא מוטציות נדירות amplicons שני עם סף גילוי של 0.0001, הם יכול בריכה מקסימאלית 75 דוגמאות רצף יחיד להפעיל אותו באמצעות הכימיה MiSeq V2 אשר פלטי עד 15 מיליון קריאות (2 amplicons * 10,000 מולקולות * 10 קורא עבור תיקון השגיאות * דוגמאות 75 = 15 מיליון רצף פעולות הקריאה). חוקרים יכולים להשתנות מספר מולקולות נכנס רצף או מספר דוגמאות במאגר רצף יחיד להפעיל כדי להתאים את סף גילוי. במחקרים שלנו, כיוונו למצוא מוטציות עם סף גילוי של 0.0001 VAF (1:10, 000) שימוש בלוח ג'ין אילומינה. אנו משתמשים באופן שגרתי 250 ng של הקמת ה-DNA על מנת להבטיח כי מספיקות מולקולות נלכדים על מנת להשיג את סף גילוי הנ ל. חוקרים יכולים לבחור להתחיל עם כמות נמוכה יותר של ה-DNA (50 ng מומלץ) אם המגבלה זיהוי הרצוי > 0.001 VAF.
כפי UMIs יצורפו אל האינדקסים i5, רצף הגדרות יש תועלת בהתאם. לדוגמה, השתמשנו 16 N UMIs, בהגדרות רצף היו סוף לזווג 2 x 144 קריאות, 8 מחזורים של אינדקס 1 ו- 16 מחזורים של אינדקס 2 לעומת המחזורים 8 הרגיל של אינדקס 2. הגידול במחזור אינדקס 2 יפוצה על ידי ירידה במספר הכולל של מחזורי המוקצים את הקריאות. אם החוקרים להשתמש 12N UMIs10,17, צריך לשנות את ההגדרות 12 מחזורים של אינדקס 2.
שיטה זו מבוססת-UMI רצף ממוטבת כדי לתקן שגיאות רצף. זה נשאר שיוצרת בהתמודדות עם ה-PCR jackpotting, וזו בעיה עבור כל שיטה המבוססת על הגברה. ביצענו סיבובים של רצף שלאחר ובדיקת פוסט-ביואינפורמטיקה באמצעות ddPCR, אנחנו בקושי לזהות מידע מוטעה עקב PCR jackpotting. למרות זאת, מומלץ כי החוקרים לערוך את הניסויים באמצעות פולימראז דיוק גבוה כדי להבטיח הגברה נמוכה שגיאות.

כפי שאנו גיל, מחשיפה מוטגנים ושגיאות סטוכסטי במהלך חלוקת התא כתוצאה הצטברות של סטיות סומאטית הגנום, וזאת ביסוד בפתוגנזה מהותי של שינוי ממאיר, מחלות נוירו-התפתחותית, רפואת ילדים הפרעות והזדקנות נורמלית1,2. מוטציות סומאטית עם פוטנציאל נהיגה המחלה הם סמנים אבחון ו prognostic חשוב זיהוי מוקדם, הסיכון ניהול3,4,5. על מנת להבין טוב יותר את clonogenesis הפיזיולוגיות, אשר להודיע קליניים ומחקר החלטות, כימות מדויק ואפיון של מוטציות אלו ישנה חשיבות רבה. הדור הבא רצפי (הגדרות) הנמצא בשימוש כיום ללמוד מוטציות המשובטים בדגימות DNA הטרוגניות; עם זאת, המיתרים מוגבל לזיהוי מוטציות ב > אלל variant 0.02 נקודות שבר (VAF) — בשל שיעור השגיאה מובנית של 0.5 – 2.0% רצף פלטפורמות6,7,8. כתוצאה מכך, מעקב אבחונית, prognostically משמעותית גרסאות הסומטית-VAF התחתונה אינה יכולה להיות מושגת באמצעות הגדרות סטנדרטית.
לאחרונה, פותחו שיטות שונות כדי לעקוף את שיעור שגיאה של המיתרים8,9,10,11. שיטות אלה לנצל תיוג מולקולרית, המאפשר תיקון שגיאות לאחר רצף. כל מולקולה או מקטע גנומי בספריה רצף מתויג עם אקראי ייחודי מולקולרית המזהה (UMI) הייחודיים את המולקולה. UMIs נבנות על ידי צירופים של מחרוזת אקראי נוקלאוטידים (N 8-16). ברקוד מדגם ספציפי השני גם משולב שזרימת העבודה המאפשר ריבוב הדגימות מרובים לתוך הרצף המיתרים אותו לרוץ. PCR-הגברה מבוצעת על ספריית תגים מולקולרי, לאחר מכן נשלחת הספרייה עבור רצף. במהלך הכנת ספריה, צפוי כי שגיאות יהיה אקראי הציג את מקטע גנומי במהלך הגברה PCR ורצף8. להסרת רצף אקראי שגיאות, רצף raw קריאות מקובצות לפי אומי. ממצאים רצף אינן צפויות להיות נוכח קריאות כל עם UMI אותו במיקום גנומי זהה בשל אופיו סטוכסטי של מבוא, ואילו להיות מוגבר, וסודרו ב קריאות כל המשתפים את UMI אותו בנאמנות חלופה אמיתית. הממצאים הם bioinformatically הוסר. כאן, אנו מתארים שלוש שיטות של שגיאות רצף (ECS) ממוטבים במעבדה דנ א לזהות משתנים נוקלאוטיד יחיד (SNVs) ואת ההכנסה קטן-מחיקות (Indels), ולכל RNA להקל על כימות של ביטוי גנים להלן הגדרות הסף שגיאה.
השיטה הראשונה מתארת דרך לחפש אירוע נדיר סומאטית באמצעות גנים ספציפיים תחל עוצב על ידי החוקרים. לפני הכנת ספריה, חוקרים עליך לעצב תחל למקד את שברי ריבית. השתמשנו את Primer3 אפליקציה (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Amplicons של 200 – 250 bp הינם אידיאליים עבור תגובת שרשרת פולימראזית (PCR). כמו אלה, לאחר UMIs כבר שילבו, ליצור חופפים קריאות סוף-לזווג עם 150 bp לזווג-end קריאות. התנאים עיצוב פריימר אופטימלית כדי לשמש הם: גודל פריימר מזערי = 19; גודל אופטימלי פריימר = 25; גודל מרבי פריימר = 30; Tm מינימום = 64 ° C; Tm אופטימום = 70 מעלות צלזיוס; Tm מרבי = 74 מעלות צלזיוס; ההפרש המרבי Tm = 5 ° C; תוכן GC מינימום = 45; מרבית התוכן GC = 80; מספר כדי להחזיר = 20; סוף יציבות מירבית 3' = 100.
שיטה 2, נתאר שיטת שילוב פרוטוקול ה-ECS-DNA עם כימיה אילומינה סקר SNVs המשובטים, כמו שנדיר למצוא 0.0001 VAF באמצעות לוחות הגן זמינים מסחרית הכוללים מאות amplicons קטן Indels. יש להשתמש TruSight מיאלואידית רצף הפאנל (אילומינה) עבור הניסוי שלנו ואנו עיצב לוח מורחבת לכלול גנים נוספים עניין למחלות מיאלואידית רפואת ילדים. הלוחות הללו לא הציעו מזהי מולקולרי ייחודי (UMIs) שתאפשר תיקון שגיאות, אז הוספנו משלנו אסטרטגיה מתאם הפאנלים. ECS אמור לעבוד באותה מידה טוב עם כל יתר החלוניות להעשרת עבור גנים הקשורים מחלות שונות. בעקבות הדי בידוד כימות עוקבות רקמות או דגימה של עניין, מומלץ לקיים לפחות 500 ng מלאי דנ א לכל דגימה. אנחנו עושים באופן שגרתי ספריה רצף יחיד באמצעות 250 ננוגרם של ה-DNA, כדי לתפוס כמו שבר גנומית ייחודי הרבה ככל האפשר עבור במורד הנהר קורא מניעת כפילויות וחישוב VAF. ספריה רצף שכפל אופציונלי יכול להתבצע עם ה-250 הנותרים ng של ה-DNA. . אנחנו תמיד עושים שתי ספריות שכפל לכל דגימות, שאנו מחשיבים רק את האירועים שזוהו באופן עצמאי בשני משכפל כמו תוצאות חיוביות נכון. אנחנו גם ליישם מודל גנומית שגיאה בינומי עמדה ספציפית כדי להגביר את הדיוק של variant מתקשר4,13.
לבסוף, אנו מתארים שיטה צימוד ECS כדי רצפי RNA על כימות התעתיק באמצעות לוחות QIAseq ממוקד RNA מדף (Qiagen). UMIs הדרוש עבור מניעת כפילויות תיקון שגיאות שילבו את ערכות ו חוקרים יכול להפוך ספריות בעקבות ההמלצות של היצרן. Bioinformatically, חוקרים אפשר לעקוב הצבר שתואר ECS-ה-dna אשר יוסברו בפירוט בסעיף פרוטוקול.

<table><tbody><tr><td>Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>UMI i5 adapter sequences</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Ligation Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Digital PCR System</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight Myeloid Sequencing Panel</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td>Johns Hopkins University</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Customized QIAseq Targeted RNA Panel</td><td>Qiagen</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

rare event detection using error-corrected dna and rna sequencing

שיטות קונבנציונליות הדור הבא רצפי (הגדרות) אפשרו עבור אפיון גנומית עצום עבור למעלה מעשור. באופן ספציפי, המיתרים שימש כדי לנתח את הספקטרום של מוטציות המשובטים בממאירות. אבל הרבה יותר יעיל יותר שיטות מסורתיות סנגר, המיתרים מאבקים עם זיהוי מוטציות המשובטים, subclonal נדיר עקב שלה שגיאה גבוהה בשיעור של ~0.5–2.0%. לפיכך, המיתרים רגיל יש הגבלה של זיהוי מוטציות הן > אלל variant 0.02 נקודות שבר (VAF). בעוד משמעות קלינית מוטציות נדיר בחולים ללא מחלה ידועה עדיין לא ברור, חולים שטופלו ללוקמיה השתפרו באופן משמעותי את תוצאות כאשר מחלה שיורית < 0.0001 מאת cytometry זרימה. על מנת להמתיק את הרקע artefactual של המיתרים, פותחו שיטות רבות. כאן אנו מתארים שיטה עבור שגיאות ה-DNA ו- RNA רצף (ECS), אשר כרוך תיוג מולקולות בודדות של אינדקס 16 bp אקראי עבור תיקון שגיאות וגם אינדקס ספציפי לחולה bp 8 עבור ריבוב. השיטה שלנו יוכלו לזהות ולעקוב המשובטים מוטציות ב- variant אלל שברים (VAFs) בשני סדרי גודל נמוך יותר מהמגבלה זיהוי של המיתרים ונדירים כמו 0.0001 VAF.

עם Targeted Error-Corrected רצף עבור ה-DNA, ערכנו הוכחה של עיקרון הניסוי דילול מוטציה החולה DNA ב- DNA גנומי מסחרי. החולה היתה מוטציה ב- GATA1 (chrX:48650264, C > G) עם VAF המקורי של 0.19. נדגים באיור 1 כי ECS היא כמותית לרמה של 1:10,000 עבור משתנה נוקלאוטיד יחיד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> איור 1: סדרת דילול GATA1 SNV הוכחת כי ECS היא כמותית לרמה של 1:10,000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
אנו גם מראים כי ECS-הדנ א מזהה בצורה אמינה מוטציות נדירות המשובטים ב גנים שהדו-שיח למבוגרים לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) אנשים קשישים בריאים4. השגנו דוגמאות המעיל באפי 20 אנשים בריאים במחקר בריאות של האחות הפקידה בערך ~ 10 שנים בנפרד. אנחנו מיושם הפרוטוקול פאנל ה-ECS-DNA על דגימות אלה. עבור ניסוי זה, אנו הותאם אילומינה TruSight מיאלואידית רצף לוח המורכב amplicons 568 (מידע נוסף על רשימת גנים ב- https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html), רציף ספריות 80 מאנשים 20 (אוספים 2 בנקודות זמן שונות, משכפל 2 לכל אדם בכל פעם הצבע) באמצעות פלטפורמה אילומינה NextSeq, אשר נוצר ממוצע הקריאות לזווג-end 47.7 מיליון ו ממוצע של 3.4 מיליון שגיאות רצפי הקונצנזוס לכל ספריה4. הכיסוי נוקלאוטיד מתכוון לכל ספריה היה בערך 6000 x (3.4 מיליונים מחולק 568). עבור כל דגימה, אנחנו נבנה פרופיל שגיאה ספציפית מיקום באמצעות ספריות ברצף שאינם מגיעים באותה דגימת זרע. מצאנו 109 מוטציות סומאטית המשובטים שהיו קיימים שני ושכפול של נקודת זמן אוסף אחד לפחות. מוטציות אלה יש VAF החל 0.0003 – 0.1451. אנחנו נבחר מוטציות 21 עם ייצוגים הקוסמית ידוע, ואומת כל 21 מוטציות בגן אחד או שניים אוסף זמן כרשם באמצעות ddPCR (n = 34, איור 2, הותאם צעיר. ואח 20164).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> איור 2: מוטציות המזוהה על-ידי ה-ECS אומתו באמצעות ddPCR עם VAFs מאוד concordant. (n = 34, שונה צעיר. ואח 20164). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
לגבי רמת ביטוי שגיאות באמצעות פרוטוקול ה-ECS-RNA, אנחנו אישית פאנל הגן באמצעות הכימיה QIAseq המורכב 416 הגנים הידועים להיות מזוהה עם סוגים שונים של סרטן (הותאם מהחלונית QIAseq Transcriptome סרטן אנושי), ואנחנו מוגבר של אקסון לרוב ביטוי של גנים נתון (ג'ין רשימה 1 חומר משלים). ריצפנו את ספריות באמצעות פלטפורמה אילומינה MiSeq בתבנית לזווג-סוף נתן ממוצע של 8.3 מיליון קורא לכל ספריית, והצלחנו לתפוס ממוצע של רצפי הקונצנזוס שגיאות 0.417 מיליון. הראינו כי רמת ביטוי של התעתיק שפע נמוך (< התעתיק 1,000 ספירת 50 ng של RNA סה כ) הוא מאוד לשחזור בין משכפל (נקודת נתונים n = 300, איור 3). אימות על-ידי ddPCR (בשישה גנים הנבחר של מעלה בדרגות שונות של הביטוי) הראו כי רמת ביטוי של גנים כראוי נכבש על ידי פרוטוקול ה-ECS ללא צורך נורמליזציה.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> איור 3: העליון, המתאם של התעתיק נחשב על ידי ה-ECS-RNA בין בית באותה דגימת זרע (n = 300). התחתון, התעתיק ספירות המזוהה על-ידי ה-ECS אומתו על ידי ddPCR (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing at JoVE.com

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

rare-event-detection-using-error-corrected-dna-and-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

12.0K Views.  Washington University School of Medicine. הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

Video: Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Cancer Research

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen application of the method is the identification of rare mutations in circulating cell-free DNA from liquid biopsies, with a relevance in cancer diagnostics and stratification of oncological patients for personalized therapy. As a proof of concept, the test has been designed to detect the BRAFV600E mutation in the BRAF gene, which is important to identify the sub-group of melanoma patients that can benefit from targeted therapies with BRAF inhibitors. However, this colorimetric test can be easily generalized to other somatic mutations of clinical relevance due to the use of universal detection probes, thus providing strong potential in oncological diagnostics.
The test detects 0.5% of BRAFV600E in an excess of BRAFWT DNA, which matches the sensitivity of some commercial instrumental assays. Such sensitivity is clinically relevant for diagnostic purposes, allowing the early identification of drug-sensitive patients. In contrast to commercial assays based on real-time PCR, this test requires minimal instrumentation and processing, as it can be performed on DNA amplified with a standard PCR (or isothermal techniques) and provides a naked-eye readout with a one-tube reaction of a few steps in only one hour. At present, the test has been used only on synthetic DNA samples. However, the latter have been designed to mimic a real sample amplified from circulating cell-free DNA, to favor the translation of the test to clinical diagnostics.

This protocol permits the naked-eye identification of point mutated DNA in a 200-fold excess of wild type DNA molecules, by exploiting gold nanoparticles and paramagnetic microparticles.

The protocol describes a naked-eye colorimetric test for the detection of somatic point mutations in an excess of wild type DNA. The future foreseen ...

Biochemistry

<meta charset="utf8"></head><body>אופטימיזציה של זיהוי מוטציות בתדר נמוך עם PCR חוסם מסוג פראי

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting for drug resistance mutations and circulating tumor cell mutations during therapy. Traditional Sanger sequencing has 5%-20% wild-type mutation detection, so its limit of detection cannot meet the corresponding requirements. The wild-type blocking technologies that have been reported to overcome this include blocker displacement amplification (BDA), non-extendable locked nucleic acid (LNA), hot-spot-specific probes (HSSP), etc. These technologies use specific oligonucleotide sequences to block wild-type or recognize wild-type and then combine this with other methods to prevent wild-type amplification and amplify mutant amplification, leading to characteristics like high sensitivity, flexibility, and convenience. This protocol uses BDA, a wild-type blocking PCR combined with Sanger sequencing, to optimize the detection of RHOA G17V low-frequency somatic mutations, and the detection sensitivity can reach 0.5%, which can provide a basis for MRD monitoring of angioimmunoblastic T-cell lymphoma.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: קידום איתור מוטציות בתדירות נמוכה ברקמות סרטניות

This article introduces the application of a low-frequency detection method based on Sanger sequencing in angioimmunoblastic lymphoma. Provide a basis for applying this method to other diseases.

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

זיהוי גנטי של וריאנטים נדירים מן הרצף נקווה שימוש Splinter

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

הערכה של ה-DNA זיהום בדגימות ה-RNA בהתבסס על Ribosomal DNA

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Naked-Eye Detection of Rare Point Mutations in DNA

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

חסימת PCR מסוג Wild בשילוב עם ריצוף Sanger לאיתור מוטציה סומטית בתדר נמוך

זיהוי גנטי של וריאנטים נדירים מן הרצף נקווה שימוש Splinter