Name: organotypic culture method to study the development of embryonic chicken tissues
Uploaded: 2018-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues at JoVE.com

המחברים רוצה להודות גרגורי האלר (הר סנט וינסנט אוניברסיטת) עבור עבודתו ראשוני בפיתוח של הפרוטוקול. המחברים רוצה גם להודות ג'ונס ניקולס (אוניברסיטת סנט וינסנט הר) עבור שלו מומחיות טכנית ועזרה עם הצילומים וייצור של חלק אודיו-ויזואלית של כתב היד. דניאל אנדרוז נתמכה על ידי מימון MSVU ו מדעי הטבע הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) דרך פרס מחקר של סטודנטים לתואר ראשון. תמרה א פרנץ-Odendaal נתמך על ידי מענק גילוי NSERC.

הערה: עבור העובר בשלבים, לנצל את ההמבורגר והמילטון12 (HH) היערכות טבלה.
1. העובר דגירה
<ol><li>דגירה הביצים עוף מופרית חממה סטרילי, בטמפרטורה מבוקרת-37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות.</li>
	<li>להפוך את הביצים 1 x ליום ולאפשר להם דגירה עד HH34 (8 ימים לאחר ההפריה).</li>
</ol>2. הכנה ועיקור של החומרים
<ol><li>עבור 12 עוברי, החיטוי 2 ל' מים מזוקקים, 1 ליטר של תמיסת מלח צ'יק 0.85%, פיפטות זכוכית 12, 1 קופסה של נייר טישו, 24 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ ריבועי נייר סינון נקבוביים למחצה ו- 24 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ ריבועים של תיל פלדה רשת עם קצוות מעוגלים כלפי מטה. כדי לעקר את החומרים, החיטוי אותם ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. הערה: autoclaving של החומרים יכול להיעשות מראש.</li>
	<li>לעקר את החממה עם 70% אתנול שתמחקי את הצדדים, מדפים, הדלת. מניחים 2 מיכלי פלסטיק המכיל בלוק מזוקקים מים בתוך החממה כדי לשמור על לחות. Prewarm החממה תרבות כדי 37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות. להבטיח שהחממה חשוך לחלוטין; אם הדלת שקוף, מכסה אותו עם נייר כסף.</li>
	<li>Prewarm 100 מ של חומר מזין בינוני, 1 מ"ל של פניצילין על-ידי הצבתם בחממה תרבות.</li>
	<li>מכסה את סביבת העבודה עם מגבת נייר, לעקר את הספסל על ידי התזה עם 70% אתנול. לחטא 2 זוגות של מלקחיים, חיתוך מספריים, סכין גילוח, כפית פלסטיק עם 70% אתנול באופן דומה.</li>
	<li>צלחות פטרי סטריליות 100 מ מ מקום 12 ו- 24 צלחות פטרי סטריליות 35 מ מ על הספסל לשימוש. ודא שהמנות נשארים בשקית סטרילית עד השימוש.</li>
</ol>3. עובר הכנה
הערה:, מנקודה זו ואילך, תלבש מסיכת פנים מגן אבק כדי להימנע מזיהום התרבויות. זיהום חיידקי או פטרייתי יהרוס את התרבות, ויש סיכון של זה מתפשטת במהירות בכל התרבויות בחממה.
<ol><li>לפצח את הביצה ולהעביר את העובר צלחת פטרי 100 מ מ המכיל תמיסת מלח צ'יק 0.85%. בשלב העובר על פי התכונות אנטומי תיאר המבורגר, המילטון היערכות הנחיות12 , לאשר העובר הוא HH34.</li>
	<li>חתך את הצוואר, ואז קטיעות ראש העובר בקו האמצע באמצעות תער מעוקר. בעזרת מלקחיים סטרילי, מסירים את המוח. להשאיר את האף ללא פגע.</li>
</ol>4. תרבות ההתקנה
<ol><li>2. המקום של 35 מ מ פטרי בתוך צלחת פטרי 100 מ מ אחד.</li>
	<li>מניחים רשת תיל פלדה בתוך צלחת פטרי כל 35 מ מ.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, העברה 1 של ראשי זיבצנטן פיסת נייר סינון נקבוביים למחצה 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ עם העין פונה כלפי מעלה. ודא הרקמה מאובטחת לא להחליק על-ידי הטיית אותו מעט.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, בזהירות המקום רקמת העין, נייר הסינון על גבי רשת התיל פלדה 1 של 35 מ מ פטרי, יצירת במה מוגבהת עם רקמת העין על העליונה.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.3 ו- 4.4 עם חצי ראש אחרים.</li>
	<li>בזהירות בעזרת פיפטה של זכוכית סטריליים, להוסיף את מזין בינוני ישירות לתוך צלחת פטרי כל 35 מ מ עד שהוא מגיע לרמת נייר הסינון. לא להטביע את הראש חצי במדיום התזונתי.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של 10,000 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין המדיום מזין בכל צלחת פטרי.</li>
	<li>מקפלים פיסת נייר טישו לתוך כיכר קטנה ומניחים אותו בתוך 100 מ מ פטרי. להרטיב אותה במים מזוקקים בלוק.</li>
	<li>מקם את המנה תרבות לתוך החממה סטרילי, כהה-37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות עד 4 ימים.</li>
	<li>חזור על שלבים 3 ו- 4 עבור כל העובר. הערה: מספר העוברים צריך יהיה תלוי בניסוי מסוים; כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עוברי 12.</li>
</ol>5. תרבות תחזוקה
<ol><li>פעם אחת ביום, למעלה למעלה את מיכלי פלסטיק בחממה עם מים מזוקקים טריים, בלוק.</li>
	<li>מדי יום בדוק בכל התרבויות עבור זיהומים חיידקים או פטריות. תרבויות זה יש התפוררה או שבהם המדיום השתנה צבע נגועים. למחוק את כל התרבויות שהודבקו.</li>
</ol>6. קיבוע
<ol><li>בעקבות culturing, הסר את כל המנות של החממה.</li>
	<li>באמצעות זוג מלקחיים, להסיר בעדינות את העין נייר הסינון, מטפל לא לקרוע את הרקמה.</li>
	<li>לתקן את רקמת העין paraformaldehyde 4% 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח בן לילה ב 4 ° C או בפורמלין באגירה נייטרלי 10% למשך הלילה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>אחסן את הרקמה ב 4 ° C 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+the+development+of+scleral+ossicles+in+the+chicken,+Gallus+gallus.">Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus.</a> Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+motor+proteins+in+echinoderm+embryos:+an+argument+in+support+of+antibody+inhibition+experiments.">Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).</li><li>Horakova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+FGFR+inhibitors+on+chicken+limb+development.">Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).</li><li>Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbead+Implantation+in+the+Zebrafish+Embryo.">Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).</li><li>Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Embryonic+Chick+Eyes.">Electroporation of Embryonic Chick Eyes.</a> Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).</li><li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+organ+culture+of+embryonic+chick+femora:+a+system+for+investigating+bone+and+cartilage+formation+at+an+intermediate+level+of+organization.">Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).</li><li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+inhibitory+action+of+BMPs+and+their+relationships+with+activators+in+feather+formation:+implications+for+periodic+patterning.">Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning.</a> Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).</li><li>McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+functions+by+localizing+the+region+of+proliferation+in+early+developing+feather+buds.">Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds.</a> Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).</li><li>Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+take+on+an+old+story:+chick+limb+organ+culture+for+skeletal+niche+development+and+regenerative+medicine+evaluation.">A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation.</a> European Cells &amp; Materials. 26, 91-106 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Spermatogenesis+in+Explanted+Adult+Mouse+Testis+Tissues.">In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues.</a> PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).</li><li>Ochoa-Villarreal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+culture+strategies+for+the+production+of+natural+products.">Plant cell culture strategies for the production of natural products.</a> BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+biology+of+feather+follicles.">The developmental biology of feather follicles.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).</li><li>Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+cellular+dynamics+during+the+development+of+intramembranous+bones:+the+scleral+ossicles.">An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles.</a> Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Pinto, C. B., Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+understanding+of+the+epithelial+requirement+for+osteogenesis+in+scleral+mesenchyme+of+the+embryonic+chick.">Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).</li><li>Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia.">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).</li><li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development.">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה עושה שימוש רקמת הוקמה culturing הטכניקות להשגת צמיחת יש עין עוף מיום עובריים 8 (HH34) במבחנה 4 ימים. שיטה זו רשת culturing תוארה במקור על ידי Trowell15. אנחנו אופטימיזציה פרוטוקול מ של פינטו ואולם 1991 המחקר16 ניצול קרום נקבוביים למחצה עם רשת ללמוד אינדוקטיבית אותות ?...

העוף עובריים (גאלוס גאלוס) הוא אורגניזם מודל מצוין נפוץ בתחום הביולוגיה. תקופת הדגירה שלו הוא בערך 21 ימים, ביצים רבות יכול להיות מודגרות בו זמנית, ביצוע ניסויים מהיר ויעיל. ואולי הכי חשוב, העובר בקלות גם מטופל, המאפשרים לימוד מקיף של תהליכים התפתחותיים המפתח, של גנים, חלבונים כי הכונן תהליכים אלה.
עין עוף עובריים היא איבר מורכב אשר מפתחת דרך האינטראקציה של מספר ברקמות שונות דומה מערכות גוף רבות אחרות. שיטה זו מאפשרת למידת ההתפתחות של רקמות אלה, במיוחד בשלבים מתקדמים של פיתוח. לדוגמה, ייתכן הרשתית רב שכבתית עניין מיוחד הלומדים הפיתוח של מערכת העצבים. שיטות אלטרנטיביות שמאפשרות המחקר של רקמות העין אחרות כגון הקרנית, הגוף vitreal, העדשה, את sclera העפעפיים הם להועיל לחוקרים. העין עובריים עוף מכיל גם סדרה של עצמות שטוחות, עצמות השמע scleral, אשר יכול לשמש כמודל לחקר של עצם intramembranous אינדוקציה, התקשות חולייתנים1.
כיום, ישנן מספר שיטות חקר התפתחות. Microinjections של נוגדנים מעכבות או אחרים מולקולות מעכבות2,3, שהושתל. גרגרי טבולים מעכב4, אלקטרופורציה5 הם כל השיטות יכול לשמש downregulate גנים או חלבונים עניין בהעובר. שיטות דומות משמשות upregulate חלבונים. שיטות אלה אינן ללא המגבלות שלהם. לדוגמה, בעת שימוש בכימיקלים כדי לשנות את ההתפתחות, הערכת ההשפעות קטלני על העובר, זה מגביל את השימוש השיטות דלעיל לאתרים לשפות אחרות של יישום במינונים נמוכים מספיק כדי להבטיח את השרידות של . אני אדם מסוכן
במבחנה culturing רקמות שימש במגוון רחב של אורגניזמים ללמוד פיתוח, יכול לשמש כדי לעקוף חלק מהמגבלות הנ. לדוגמה, femora6, נוצה ניצנים7,8ו הגפיים9 של העוף כל נחקרו באמצעות רקמות culturing שיטות, כמו שיש את האשכים של העכבר10 ושורשים והגבעולים של צמחים11. שיטות אלה מעניקים מדענים רמה גבוהה של שליטה על הפיתוח רקמות, כגון היכולת להשתנות הטמפרטורה ולשנות את זמינות חומרי הזנה. בידודו של הרקמה של העובר כל גם עושה את זה הרבה פחות רגישים להשפעות קטלני של כימיקלים, ובכך מאפשר מניפולציה מחקרים בקנה מידה עולמי בריכוזים גבוהים. יתרון בולט נוסף של במבחנה culturing הוא שימור הסביבה התאית של הרקמה; הסידור של רקמות נותר כמעט ללא שינוי, כך שניתן ללמוד את האינטראקציות בין סוגי רקמות שונות9. לפיכך, במבחנה culturing פותח דלתות נוספות ניסיוני גישות שאינן זמינות במודלים vivo או בכל ovo .
כיום, ללמוד על התפתחות העין עוף עובריים שימוש בכימיקלים הוא מאתגר במיוחד. מספר של ממברנות extraembryonic לכסות את העובר, ולכן קשה ליישם את גרגרי או כימיקלים; העובר הוא מאוד פעיל בתוך הביצה גם כאשר הוא מזדקן, שמסבך עוד יותר את שיטת כבר קשה. פרוטוקול זה מאפשר גישה נוחה לעין, הרקמות הסובבות שלו, ביטול מחסומים אלה, גם בעת מתן הזדמנויות חדשות לבחון תהליכים התפתחותיים בתוך העין. פרוטוקול זה הוקם כדי ללמוד את תנאי הגיוס של עצמות השמע scleral בתוך העין עובריים.

<table><tbody><tr><td>35 mm cell culture petri dishes</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td></tr><tr><td>100 mm cell culture petri dishes</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td></tr><tr><td>paper tissue</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton</td></tr><tr><td>wire mesh</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)</td></tr><tr><td>disposable glass pipettes</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Borosilicate glass disposable 5 3/4&quot;</td></tr><tr><td>nutrient medium</td><td>Gibco</td><td>12591-038</td><td>Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)</td></tr><tr><td>penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised</td></tr><tr><td>filter paper</td><td>Whatman</td><td>1454 090</td><td>semi-porous filter paper 90mm</td></tr><tr><td>fertilized chicken eggs</td><td>Dalhousie University Agricultural College</td><td>n/a</td><td>can be obtained from local farms</td></tr><tr><td>sodium chloride (NaCl)</td><td>EMD</td><td>SX0420-3</td><td>sodium chloride crystals, reagent grade</td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td>VWR</td><td>89000-240</td><td>1 L pyrex autoclavable glass bottle</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td>70% molecular biology grade</td></tr><tr><td>tupperware containers</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought and sterilized with EtOH</td></tr><tr><td>disposable razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)</td></tr><tr><td>plastic spoons</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought and sterilized with EtOH</td></tr><tr><td>dust mask</td><td>3M</td><td>n/a</td><td>3M 8500 Comfort Mask</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>paraformaldehyde, reagent grade, crystalline</td></tr><tr><td>neutral-buffered formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>72210</td><td>10% neutral buffered formalin</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.4mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>15 ml falcon tubes</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td>presterilized centrifuge tubes</td></tr><tr><td>forceps</td><td>FST</td><td>n/a</td><td>fine forceps</td></tr><tr><td>chick saline&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>n/a&amp;nbsp;</td><td>0.85% NaCl</td></tr><tr><td>tinfoil</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought</td></tr><tr><td>paper towel</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought</td></tr></tbody></table>

organotypic culture method to study the development of embryonic chicken tissues

העוף עובריים הוא נפוץ כאורגניזם מודל אמין לפיתוח חוליות. הנגישות שלה, דגירה קצרה תקופה הופך אותו לאידיאלי עבור ניסויים. כיום, המחקר של המסלולים הללו התפתחותית של העובר עוף מבוצע על-ידי החלת מעכבי וסמים באתרים המותאמות לשפות אחרות, בריכוזים נמוכים, תוך שימוש במגוון שיטות. במבחנה culturing רקמות היא טכניקה המאפשרת המחקר של רקמות הופרדו האורגניזם המארח, בזמן בו זמנית תוך עקיפת רבים של המגבלות הפיזיות נוכח בעת עבודה עם כל העוברים, כגון הרגישות של העוברים על מינונים גבוהים של כימיקלים קטלני. כאן, אנו מציגים את organotypic culturing פרוטוקול culturing את העוף מתחלקים חצי ראש במבחנה, המציג הזדמנויות חדשות עבור בחינת תהליכים פיתוחיים מעבר השיטות כיום הוקמה.

באמצעות שיטה זו, עין עוף עובריים יכולים להיות מחונן יום 8 של התפתחותו (HH34) במבחנה 4 ימים ארבעה ימים של ovo פיתוח מקביל HH38.
שיטה זו culturing תומך בפיתוח של נוצה ניצנים סביב העין, על העפעפיים (איור 1B). אלה ניצנים נוצה אינם נו...

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues at JoVE.com

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

organotypic-culture-method-to-study-development-embryonic-chicken

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K Views.  Mount Saint Vincent University. כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

Video: Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

מותאם באופן מיטבי<em&gt; Ex-אובו</em&gt; Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biology

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the formation of quail-chicken chimeras and the use of the chorioallantoic membrane (CAM) to sustain the development of ectopic tissues date back to the last century. Nowadays, the combination of these classical techniques with recent in vitro methodologies offers novel prospects to further explore organ formation.
Here we describe a two-step approach to study early- and late-stages of organogenesis. Briefly, the embryonic region containing the presumptive territory of the organ is isolated from quail embryos and grown in vitro in an organotypic system (up to 48 h). Cultured tissues are subsequently grafted onto the CAM of a chicken embryo. After 10 days of in ovo development, fully formed organs are obtained from grafted tissues. This method also allows the modulation of signaling pathways by the regular administration of pharmacological agents and tissue genetic manipulation throughout in vitro and in ovo developmental steps. Additionally, developing tissues can be collected at any time-window to analyze their gene-expression profile (using quantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) and morphology (assessed with conventional histology and immunochemistry).
The described experimental procedure can be used as a tool to follow organ formation outside the avian embryo, from the early stages of organogenesis to fully formed and functional organs.

This article provides an updated approach to the classical quail-chicken chimera system to study organ formation, by combining novel in vitro and in ovo experimental procedures.

גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Neuroscience

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

סקירה מקיפה של פרוטוקולי תרבית צמחילת עור עוברי בעופות

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

מחבר זרקור: תובנה לגבי המתודולוגיות הניסיוניות הנוכחיות של צמחי עור העופות

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מותאם באופן מיטבי

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ'יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה