Name: organotypic culture method to study the development of embryonic chicken tissues
Uploaded: 2018-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues at JoVE.com

Die Autoren möchte Gregory Haller (Mount Saint Vincent Universität) zu danken, für seine Vorarbeiten bei der Entwicklung des Protokolls. Die Autoren auch möchte Nicholas Jones (Mount Saint Vincent University) danken für seine technische Expertise und Unterstützung bei den Dreharbeiten und Produktion von Audio/visuellen Teil des Manuskripts. Daniel Andrews wurde unterstützt durch die Finanzierung von MSVU und naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC) über ein Undergraduate Student Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal wird durch eine NSERC Discovery Grant unterstützt.

Hinweis: Für Embryo Bühnen, nutzen Sie die Hamburger und Hamilton12 (HH) Inszenierung Tabelle.
(1) Embryo Inkubation
<ol><li>Inkubieren Sie befruchteten Hühnereiern in einem sterilen, temperaturgeführte Inkubator bei 37 ° C ± 1 ° C und ~ 40 % Luftfeuchtigkeit.</li>
	<li>Drehen Sie die Eier 1 X pro Tag und es ihnen ermöglichen, zu HH34 inkubieren (8 Tage nach Befruchtung).</li>
</ol>2. Vorbereitung und Sterilisation von Materialien
<ol><li>Für 12 Embryonen, Autoklaven, 2 L destilliertes Wasser, 1 L 0,85 % Küken Kochsalzlösung, 12 glaspipetten, 1 Karton Papiertaschentuch, 24 2,5 x 2,5 cm Quadrate der halbdurchlässigen Filterpapier und 24 2,5 x 2,5 cm Quadrate aus Stahldraht mesh mit den Kanten nach unten gebogen. Um die Materialien zu sterilisieren Autoklaven bei 121 ° C für mindestens 15 Minuten. Hinweis: Das Autoklavieren der Materialien kann im Voraus erfolgen.</li>
	<li>Den Inkubator mit 70 % Ethanol durch Abwischen der Seiten, die Regale und die Tür zu sterilisieren. Platz 2-Kunststoff-Behälter mit autoklaviert destilliertes Wasser in die brutmaschine Feuchtigkeit zu halten. Prewarm Kultur-Inkubator auf 37 ° C ± 1 ° C und ~ 40 % Luftfeuchtigkeit. Sicherzustellen Sie, dass der Inkubator ist völlig dunkel; Wenn die Tür transparent ist, mit Alufolie bedecken.</li>
	<li>Prewarm 100 mL Nährmedium und 1 mL Penicillin, indem man sie in der Kultur-Inkubator.</li>
	<li>Decken Sie den Arbeitsbereich mit einem Papiertuch und Sterilisieren der Bank durch Besprühen mit 70 % igem Ethanol. 2 Paar Zangen, Dissektion Schere, einer Rasierklinge und einem Plastiklöffel mit 70 % Ethanol in ähnlicher Weise zu sterilisieren.</li>
	<li>Platz 12 steril 100 mm Petrischalen und 24 sterile 35 mm Petrischalen auf der Bank für den Einsatz. Stellen Sie sicher, dass die Gerichte bis zum Gebrauch in einem sterilen Beutel bleiben.</li>
</ol>(3) Embryo Vorbereitung
Hinweis: Ab diesem Zeitpunkt tragen Sie eine schützende Staub Gesichtsmaske zur Vermeidung einer Kontamination der Kulturen. Eine bakterielle oder pilzartige Infektion wird die Kultur ruinieren und besteht die Gefahr der Ausbreitung schnell auf alle Kulturen im Inkubator.
<ol><li>Crack öffnen Sie das Ei und den Embryo zu einem 100 mm Petrischale mit 0,85 % Küken Kochsalzlösung zu übertragen. Stadium des Embryos nach den anatomischen Merkmalen in der Hamburger und Hamilton Inszenierung Leitlinien12 beschrieben und bestätigen den Embryo ist am HH34.</li>
	<li>Schneiden Sie den Hals und dann halbieren Sie den Kopf des Embryos an der Mittellinie mit einer sterilisierten Rasierklinge. Mit steriler Pinzette entfernen Sie das Gehirn. Lassen Sie den Schnabel intakt.</li>
</ol>4. Kultur-Setup
<ol><li>Platz 2 der 35 mm Petrischalen in einem 100 mm Petrischale.</li>
	<li>Legen Sie ein Stahl Drahtgeflecht im Inneren jedes 35 mm Petrischale.</li>
	<li>Mit Pinzette, 1 der halbierten Köpfe auf ein Stück 2,5 x 2,5 cm halbdurchlässigen Filterpapier mit dem Auge nach oben übertragen. Stellen Sie sicher, das Gewebe ist sicher und rutscht nicht von durch leicht kippen.</li>
	<li>Mit Pinzette, sorgfältig legen Sie das Augengewebe und das Filterpapier auf das Stahl Drahtgeflecht in 1 der 35 mm Petrischalen, erstellen eine erhöhte Bühne mit dem Augengewebe an der Spitze.</li>
	<li>Wiederholen Sie 4.3 und 4.4 mit der anderen Hälfte Kopf.</li>
	<li>Mit einer sterilen Glaspipette, vorsichtig hinzugeben Sie Nährmedium direkt in jede Petrischale von 35 mm bis die Stufe des Filterpapiers. Tauchen Sie der halbe Kopf im Nährmedium nicht.</li>
	<li>Das Nährmedium in jede Petrischale 50 µL von 10.000 U/mL Penicillin-Streptomycin hinzufügen.</li>
	<li>Falten Sie ein Stück Seidenpapier in ein kleines Quadrat und legen Sie sie innen 100 mm Petrischale. Mit autoklaviert destilliertes Wasser befeuchten.</li>
	<li>Legen Sie die Kulturschale in den sterilen, dunklen Brutschrank bei 37 ° C ± 1 ° C und ~ 40 % Luftfeuchtigkeit für bis zu 4 Tage.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4 für jedes Embryo. Hinweis: Die Anzahl der Embryonen benötigt von der spezifischen Experiment abhängen; Hier beschreiben wir das Protokoll für 12 Embryonen.</li>
</ol>5. Kultur-Wartung
<ol><li>Einmal pro Tag die Kunststoff-Behälter in den Inkubator mit frischem, autoklaviert destilliertes Wasser nachfüllen.</li>
	<li>Täglich prüfen Sie alle Kulturen für bakterielle oder Pilzinfektionen. Kulturen, die aufgelöst haben oder in denen das Medium Farbe verändert hat, sind infiziert. Entsorgen Sie alle Kulturen, die infiziert sind.</li>
</ol>6. Fixierung
<ol><li>Nach der Kultivierung, entfernen Sie alle Gerichte aus dem Inkubator.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Zange, vorsichtig das Auge aus Filterpapier, kümmert sich nicht um das Gewebe reißen.</li>
	<li>Befestigen Sie das Augengewebe 4 % Paraformaldehyd in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung über Nacht bei 4 ° C oder in 10 % Neutral gepufferte Formalin über Nacht bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Das Gewebe bei 4 ° C in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung aufbewahren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+the+development+of+scleral+ossicles+in+the+chicken,+Gallus+gallus.">Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus.</a> Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).</li><li>Scholey, J. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll nutzt etablierten Gewebe züchten Techniken um ein Huhn Auge aus embryonalen Tag 8 (HH34) wachsen in Vitro für 4 Tage. Diese Raster-Kultivierung Methode wurde ursprünglich von Trowell15beschrieben. Wir optimieren ein Protokoll von Pinto und Halls 1991 Studie16 unter Verwendung einer halbdurchlässigen Membran mit dem Gitter, induktive Signalübertragung zwischen getrennten Gewebeschichten der embryonalen Auge15zu studieren. Mit dieser Methode kultiviert Roach 14 - Tage altes Huhn Femur6. Diese Methode hat auch Kultivierung Maus Gewebe6,17bewährt. Die Verwendung des Filterpapiers ist entscheidend für den Erfolg des Protokolls, da es, das Gewebe hilft zu nehmen Nährstoffe aus dem Medium effektiv ohne Sättigung oder submersing Gewebe.
Nährmedium bei einem richtigen pH-Wert ist entscheidend für ein optimales Wachstum. Das Medium sollte an oder nahe der physiologischen pH-Wert und die Verwendung von Phenol rot in das Medium als Indikator einen Vorteil sieht vor, dass pH-Änderungen leicht erkannt werden können. Serumfreie Medien können verwendet werden, und die Medien täglich wechselnden ist nicht notwendig und hat keinen Einfluss auf die Ergebnisse. Das Protokoll wurde mit einem handelsüblichen Medium entwickelt (siehe Tabelle der Materialien), die einen hohen Gehalt an Aminosäuren und Glukose; keine weitere Ergänzung der Medien ist erforderlich. Die meisten Vorkommen der Armen Gewebewachstum unter Verwendung dieses Protokolls ereignete sich, als die Nährmedien entweder an einen falschen pH-Wert war oder kontaminiert.
Das Auge kann überleben und wachsen für bis zu 4 Tage in Vitro, beginnend bei embryonalen Tag 8, wenn das Protokoll unter optimalen Bedingungen durchgeführt wird. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass die Überlebensfähigkeit über 4 Tage der Kultivierung beeinträchtigt wird. Folglich werden die Entwicklungsprozesse, die einen längeren Zeitraum erstrecken Änderungen des Protokolls erfordern. Eine weitere Einschränkung des Protokolls ist das Fehlen eines aktiven Blutfluss und Vaskularisierung. Blutgefäße sind wichtig für viele Entwicklungsprozesse nicht nur für die Lieferung von Nährstoffen, die Gewebe-9, die in-vitro-über haarartige Tätigkeit durch das Filterpapier auf dem ruht das Gewebe erreicht.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Entwicklung ganzer Organe oder große Stücke von Gewebe in Vitrozu studieren. Vertebrate Organe sind sehr komplex, und ihre Entwicklung wird durch viele verschiedene räumlich-zeitliche Muster geregelt. Die Studie dieser Entwicklungsstörungen Wege beruht auf der Fähigkeit, die Signale zu manipulieren, die sie zu regulieren. Aktuelle Methoden beschränken diese Manipulation zu relativ kleinen, lokalisierten Bereichen und genug niedrigen Konzentrationen zu embryonalen Tödlichkeit zu vermeiden. Zum Beispiel die ex Ovo -Methode der Kultivierung des gesamte Huhn Embryos im Kultur-18 oder die Methode zum Fenster Eier19 Manipulationen durchzuführen sind begrenzt, dass entweder der gesamte Embryo behandelt werden muss, die Letalität verursachen können, oder nur ein kleiner lokalisierter Bereich wird behandelt. Der Vorteil des hier vorgestellten Protokolls ist, dass die Wirkung dieser Signale auf ganzer Organe oder große Mengen von Gewebe, ohne Auswirkungen auf die embryonale Lebensfähigkeit untersucht werden kann. Dieses Protokoll ist keine Ergänzung mit Kohlendioxid wie in früheren Protokollen15erforderlich. Die Verzögerung in der Entwicklung, die wir beobachten ist von Vorteil, dass schnelle Entwicklungsprozesse untersucht werden können.

Das embryonale Huhn (Gallus Gallus) ist ein hervorragendes Modellorganismus häufig verwendet im Bereich der Biologie. Die Inkubationszeit beträgt etwa 21 Tage und viele Eier können inkubiert werden gleichzeitig, Experimente zu machen, schnell und effizient. Vielleicht ist vor allem der Embryo auch leicht manipuliert ermöglicht die umfassende Studie der wichtigsten Entwicklungsprozesse und der Gene und Proteine, die diese Prozesse steuern.
Das embryonale Huhn Auge ist ein komplexes Organ, das durch das Zusammenspiel einer Reihe von verschiedenen Geweben ähnlich wie viele andere Körpersysteme entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Entwicklung dieser Gewebe, besonders in fortgeschrittenen Stadien der Entwicklung. Z. B. möglicherweise die mehrschichtige Netzhaut von besonderem Interesse für alle, die die Entwicklung des Nervensystems. Alternative Methoden, die das Studium der anderen Augengewebe zu ermöglichen, wie z. B. die Hornhaut, Glaskörperblutung Körper, der Linse, der Sklera und die Augenlider für Forscher von Nutzen sind. Das Huhn embryonalen Auge enthält auch eine Reihe von flachen Knochen, der skleralen Gehörknöchelchen, die als Modell für die Untersuchung von intramembranous Knochen Induktion und Verknöcherung in Wirbeltieren1verwendet werden können.
Derzeit gibt es eine Reihe von Methoden zur Untersuchung der embryonalen Entwicklung. Mikroinjektionen von inhibitorischen Antikörpern oder anderen hemmenden Moleküle2,3, chirurgisch implantiert Microbeads Inhibitor4trieft und Elektroporation5 sind alle Methoden, die zum Downregulate Gene verwendet werden können oder in einem Embryo interessierender Proteine. Ähnliche Methoden sind an Upregulate Proteine verwendet. Diese Methoden sind nicht ohne ihre Grenzen. Beispielsweise wenn Sie Chemikalien verwenden, um die embryonale Entwicklung zu ändern, die tödlichen Auswirkungen auf den Embryo ausgewertet werden müssen, und dies schränkt die Verwendung der oben genannten Methoden, um lokalisierte Websites Anwendung bei Dosen niedrig genug, um die Überlebensfähigkeit der gewährleisten die Embryo.
In-vitro- Gewebekulturen wurde in einer Vielzahl von Organismen verwendet, um Entwicklung zu studieren und kann verwendet werden, um einige der oben genannten Einschränkungen zu umgehen. Beispielsweise sind die Oberschenkelknochen6, Feder Knospen7,8und Gliedmaßen9 des Huhns alle untersucht worden mit Gewebe züchten Methoden, wie die Hoden der Maus10 und die Wurzeln und stengel der Pflanzen11. Diese Methoden Wissenschaftler gewähren ein hohes Maß an Kontrolle über die Gewebeentwicklung, wie z. B. die Fähigkeit, die Temperatur schwanken und verändern die nährstoffverfügbarkeit. Die Isolierung des Gewebes aus der gesamte Embryo macht es auch weit weniger anfällig gegen die tödlichen Auswirkungen von Chemikalien, wodurch es Manipulation Studien auf globaler Ebene bei höheren Konzentrationen. Ein weiterer bemerkenswerter Vorteil der in-vitro- Kultivierung ist der Erhalt der zellulären Umgebung das Gewebe; die Anordnung der Gewebe relativ unverändert bleibt, die es ermöglichen, die Interaktionen zwischen verschiedenen Gewebe Arten9zu untersuchen. In-vitro- Kultivierung öffnet Türen zu weiteren experimentellen nähert sich somit in in Vivo oder in Ovo Modelle nicht verfügbar.
Derzeit ist die Entwicklung des embryonalen Auges mit Chemikalien besonders anspruchsvoll. Eine Reihe von extraembryonic Membranen abdecken des Embryos erschwert Microbeads oder Chemikalien anzuwenden; der Embryo ist auch sehr aktiv in der Eizelle, als es älter, wird eine ohnehin schwierige Methode weiter zu erschweren. Dieses Protokoll ermöglicht einen einfachen Zugang für das Auge und seine umgebenden Gewebe, diese Hindernisse zu beseitigen, und gleichzeitig neue Möglichkeiten, die Entwicklungsprozesse im Auge zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde gegründet, um die Induktion der skleralen Gehörknöchelchen innerhalb der embryonalen Auges zu studieren.

<table><tbody><tr><td>35 mm cell culture petri dishes</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td></tr><tr><td>100 mm cell culture petri dishes</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td></tr><tr><td>paper tissue</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton</td></tr><tr><td>wire mesh</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)</td></tr><tr><td>disposable glass pipettes</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>Borosilicate glass disposable 5 3/4&quot;</td></tr><tr><td>nutrient medium</td><td>Gibco</td><td>12591-038</td><td>Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)</td></tr><tr><td>penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td>10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised</td></tr><tr><td>filter paper</td><td>Whatman</td><td>1454 090</td><td>semi-porous filter paper 90mm</td></tr><tr><td>fertilized chicken eggs</td><td>Dalhousie University Agricultural College</td><td>n/a</td><td>can be obtained from local farms</td></tr><tr><td>sodium chloride (NaCl)</td><td>EMD</td><td>SX0420-3</td><td>sodium chloride crystals, reagent grade</td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td>VWR</td><td>89000-240</td><td>1 L pyrex autoclavable glass bottle</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td>70% molecular biology grade</td></tr><tr><td>tupperware containers</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought and sterilized with EtOH</td></tr><tr><td>disposable razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)</td></tr><tr><td>plastic spoons</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought and sterilized with EtOH</td></tr><tr><td>dust mask</td><td>3M</td><td>n/a</td><td>3M 8500 Comfort Mask</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>paraformaldehyde, reagent grade, crystalline</td></tr><tr><td>neutral-buffered formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>72210</td><td>10% neutral buffered formalin</td></tr><tr><td>phosphate buffered saline (PBS)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.4mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>15 ml falcon tubes</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td>presterilized centrifuge tubes</td></tr><tr><td>forceps</td><td>FST</td><td>n/a</td><td>fine forceps</td></tr><tr><td>chick saline&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>n/a&amp;nbsp;</td><td>0.85% NaCl</td></tr><tr><td>tinfoil</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought</td></tr><tr><td>paper towel</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>store-bought</td></tr></tbody></table>

organotypic culture method to study the development of embryonic chicken tissues

Das embryonale Huhn wird häufig als zuverlässige Modellorganismus für vertebrate Entwicklung verwendet. Seine Erreichbarkeit und kurze Inkubationszeit macht Zeit es ideal für Experimente. Derzeit ist die Studie dieser Entwicklungsstörungen Wege im Huhn Embryo mittels Inhibitoren und Drogen an lokalisierten Standorten und bei niedrigen Konzentrationen mit einer Vielzahl von Methoden. In-vitro- Gewebekulturen ist eine Technik, die es die Untersuchung von Gewebe getrennt vom Wirtsorganismus ermöglicht, während gleichzeitig viele der körperlichen Einschränkungen vorhanden, bei der Arbeit mit ganzen Embryonen, wie die Anfälligkeit der Embryonen zu umgehen hohe Dosen von potenziell tödlichen Chemikalien. Hier präsentieren wir Ihnen eine organotypischen Kultivierung Protokoll für die Kultivierung der embryonalen halben Kopf in Vitro, präsentiert neue Möglichkeiten für die Prüfung von Entwicklungsprozessen über den derzeit etablierten Verfahren.

Mit dieser Methode kann Auge embryonalen Huhn vom 8. Tag seiner Entwicklung (HH34) in Vitro für 4 Tage kultiviert werden. Vier Tage in Ovo Entwicklungsstand entspricht HH38.
Diese Kultivierung Methode unterstützt die Entwicklung der Feder Knospen rund um das Auge und an den Augenlidern (Abbildung 1 b). Diese Feder Knospen sind nicht vorhanden in Ovo im HH34 vor der Kultivierung (Abbildung 1A), darauf hinweist, dass Feder Knospe Entwicklung zur Zeit der Kultivierung initiiert wird, wie es in Ovo13 (Abbildung 1). Die Augenlider und blinzelnde Membran wachsen, um das Auge während der Kultivierung (Abbildung 1 b). abdecken Die Augenlider erscheinen nach der in-vitro- Kultivierung als zu Jahresbeginn die Kultivierung bei HH34 reiferen (Abbildung 1A), aber sind weniger als bei HH38 entwickelt (Abbildung 1). Diese Daten zeigen, dass die wesentlichen Aspekte der embryonalen Entwicklung unterstützt werden, wenn auch mit einigen kleinen Verspätung.
Nach der Kultivierung, seziert wir den vorderen Teil des Auges, die Bindehaut Papillen (transiente Ring 13-14 epithelialen Vorsprünge), zeigen, die handeln als ein weiteres Wahrzeichen, die darauf hinweist, dass die entwicklungspolitischen Veranstaltungen in Kultur unterstützt werden. In der Regel diese Papillen sind voll von HH34 gebildet (Abbildung 1), und degenerierte im Laufe der Zeit als sie Skeletogenic Verdichtungen in der zugrunde liegenden Mesenchym induzieren; Sie verschwinden von HH381 (Abb. 1F). Unsere Daten zeigen, dass dieser Degeneration in Vitro (Abbildung 1E tritt) und wird durch eine Abflachung der Papillen, die nach dem in Ovo -Muster der Entwicklung voraus. Ungefärbten Verdichtungen, sind jedoch nicht sichtbar in den Proben in-vitro- anders als bei HH38 (Abb. 1F). Wir verwendeten alkalischen Phosphatase Färbung, der frühen Osteoblasten-Aktivität, um weiter zu beurteilen, die Induktion von diesen Verdichtungen14erkennt; Dieser Vorgang erfolgt neben der Degeneration der Bindehaut Papillen in Ovo. Die Induktion der Skeletogenic Verdichtungen, die am HH34 beginnt (Abbildung 1), verläuft in-vitro- ausweislich der alkalischen Phosphatase Färbung (Abbildung 1 H). Diese Verdichtungen, jedoch sind nicht so groß wie sie bei HH3814 (Abb. 1I), sind wieder darauf hinweist, dass gibt es eine kleine Verzögerung in der Entwicklung. Wir schätzen, dass die 4 Tage der Kultivierung repräsentieren etwa 2 Tage der embryonalen Entwicklung; daher eine Verzögerung von ca. 50 %. Gemeinsam, diese Ergebnisse zeigen, dass die Induktion und Entwicklung der intramembranous Knochen, der skleralen Verdichtungen ist unterstützt in-vitro- und, dass die Entwicklungsprozesse wie Augenlid Wachstum und Feder-Bud-Bildung Vorgehen Vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57619/57619fig1.jpg"> Abbildung 1 . Morphologische Merkmale von in Vitro kultiviert, Augen, HH34 Augen und HH38 Augen. A - F sind ungefärbt und G - ich sind gebeizt für das Enzym alkalische Phosphatase (AP), aktive Osteoblasten innerhalb der skleralen Verdichtungen zu unterscheiden. A, Dund G zeigen Augen zu Beginn der Kultivierung Punkt am HH34. B, Eund H zeigen Augen nach 4 Tagen der in-vitro- Kultivierung. Cund F zeigen Augen nach 4 Tagen in Ovo Kultivierung auf HH38. Alle Augen sind seitlich betrachtet. (A) der Bindehaut Papillen sind in einem Ring um die Hornhaut sichtbar. Ein Sternchen gibt Papille #12, ersteres zu bilden. Der Pfeil zeigt die Kante des Augenlids in der nasalen Region des Auges. (B) der Bindehaut Papillen sind abgeflacht und begonnen zu degenerieren. Der Pfeil zeigt eine wachsende Feder Knospe. (C) der Bindehaut Papillen haben völlig verkommen und Augenlider und blinzelnde Membran gedeckt sind. Der offene Pfeil zeigt die Kante des Augenlids in der nasalen Region des Auges. Der solide Pfeil zeigt eine wachsende Feder Knospe. (D) A seziert vorderen Teil des Auges HH34. Das Sternchen zeigt an Papille #12. (E) A seziert vorderen Teil eine HH34 + 4 in-vitro- Auge mit abgeflachten Papillen. Die Papillen in der Schläfenregion (solide Pfeil) haben begonnen, zu degenerieren; Dies sind die ältesten Papillen in den Ring. (F) A seziert vorderen Teil des Auges HH38 mit den Augenlidern und Pflegeprodukt Membranen entfernt, wonach alle Papillen degeneriert sind. Die gestrichelten Linien zeigen die Position der zwei angrenzenden ungefärbten Verdichtungen. (G) A HH34 Auge gebeizt für AP zeigt sehr klein Skeletogenic Verdichtungen bezeichnend für den Start der Induktion. (H) A HH34 + 4 Augen gebeizt für AP zeigt vergrößerte, wachsende Skeletogenic Verdichtungen. (ich) A HH38 Auge gebeizt für AP zeigt große Skeletogenic Verdichtungen. Alle Maßstabsleisten sind 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57619/57619fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

Hier präsentieren wir eine organotypischen Kultivierung Protokoll zur embryonalen Organe wachsen in-vitro-. Mit dieser Methode kann die Entwicklung der embryonalen Gewebe untersucht werden und gleichzeitig ein hohes Maß an Kontrolle über die Kultur Umwelt.

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

organotypic-culture-method-to-study-development-embryonic-chicken

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K Aufrufe.  Mount Saint Vincent University. Hier präsentieren wir eine organotypischen Kultivierung Protokoll zur embryonalen Organe wachsen in-vitro-. Mit dieser Methode kann die Entwicklung der embryonalen Gewebe untersucht werden und gleichzeitig ein hohes Maß an Kontrolle über die Kultur Umwelt.

Serie: Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimierte<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Züchtung von Hühnerembryonen zu fortgeschrittenen Entwicklungsstadium

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Zeitraffer-Imaging von frühen Hühnerembryonen

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologie

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the formation of quail-chicken chimeras and the use of the chorioallantoic membrane (CAM) to sustain the development of ectopic tissues date back to the last century. Nowadays, the combination of these classical techniques with recent in vitro methodologies offers novel prospects to further explore organ formation.
Here we describe a two-step approach to study early- and late-stages of organogenesis. Briefly, the embryonic region containing the presumptive territory of the organ is isolated from quail embryos and grown in vitro in an organotypic system (up to 48 h). Cultured tissues are subsequently grafted onto the CAM of a chicken embryo. After 10 days of in ovo development, fully formed organs are obtained from grafted tissues. This method also allows the modulation of signaling pathways by the regular administration of pharmacological agents and tissue genetic manipulation throughout in vitro and in ovo developmental steps. Additionally, developing tissues can be collected at any time-window to analyze their gene-expression profile (using quantitative PCR (qPCR), microarrays, etc.) and morphology (assessed with conventional histology and immunochemistry).
The described experimental procedure can be used as a tool to follow organ formation outside the avian embryo, from the early stages of organogenesis to fully formed and functional organs.

This article provides an updated approach to the classical quail-chicken chimera system to study organ formation, by combining novel in vitro and in ovo experimental procedures.

Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Neurowissenschaften

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

Isolierung der embryonalen Gewebe und die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären Organe Thymus am Beispiel

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

Ein umfassender Überblick über die Protokolle für embryonale Hautexplantatkulturen von Vögeln

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

Autor im Rampenlicht: Einblick in die aktuellen experimentellen Explantationsmethoden für Vogelhaut

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

Zusammenfassung

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Optimierte

Ein Abgetaucht Filterpapier Sandwich für Langzeit

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

Zweistufigen Ansatz - und Ende-Frühstadium der Orgel Formation im Vogelgrippe-Modell zu erkunden: die Thymusdrüse und Nebenschilddrüsen Organogenese Paradigma

Hühnerembryo Spinal Cord Scheibe Kultur Protocol

Isolierung der embryonalen Gewebe und die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären Organe Thymus am Beispiel

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese

Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese