עבודה זו מומן על ידי גרנט NIGMS P50GM107618. המחברים תודה זהר B. וינשטיין להערות תובנה של הצעות על כתב היד.

הערה: כל מולקולה קטנה זה מעכב התפתחות חיידקים e. coli יכול לשמש עבור שיטת אלכסוני. ב פרוטוקול זה, levofloxacin (לב), חומצה nalidixic (NAL), ו פניצילין G (PNG) ישמש כדוגמה, מאז תרופות אלה להראות סינרגיה משולשת מובהקת. זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצג באיור 6. לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר. השתמש aliquots טריים של חיידקים, תרופות כל יום. לבצע את הניסוי תחת רמות אבטחה מתאים e. coli.
1. הכנה צעדים
<ol><li>להכין לוריא-Bertani (LB) מדיה על-ידי הוספת 25 גר' מרק LB 1 ליטר של מים מזוקקים ומערבבים. אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות וחנות המדיה בלוק בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכן e. coli גליצרול מניות על ידי ערבוב נפחים שווים של גליצרול 50% סטרילי, תאים חיידקיים מדולל כדי OD600 = 1 LB מרק ומקפיאים 150 aliquots µL 1.5 mL צינורות microcentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לפזר 20 מ ג של אנטיביוטיקה, לב, NAL ו- PNG ב- 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כל אחד. לדלל לב פתרון 100 x 0.2 µg/mL על ידי ערבוב µL 10 של פתרון לב עם 990 µL של דימתיל סולפוקסיד. השתמש 0.2 מ"ג/מ"ל לב, 20 מ"ג/מ"ל NAL ו- PNG בשלבים בהליך.</li>
	<li>Aliquot 50 µL של כל אנטיביוטיקה ל 1.5 mL microcentrifuge צינורות, הקפאת ב-20 ° C.</li>
	<li>Aliquot µL לקחת 150 אחד של e. coli מ-80 מעלות צלזיוס. הפשרה.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של e. coli גליצרול מניות ב 5 מ ל LB מדיה בשפופרת תרבות 14 מ.</li>
	<li>לרעוד הצינורות 37 ° C חממה בן לילה-200 סל ד.</li>
</ol>2. טורי דילול ניסוי מנה-תגובה
<ol><li>קח את אחד aliquot של סמים לב, NAL ו- PNG מ-20 ° C, להשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. להפשיר ולהתכונן דילולים טורי של תרופות אלו.</li>
	<li>להכין 1100 µL של סול LB - 10% על ידי ערבוב 990 µL של התקשורת LB µL 110 של הממס (דימתיל סולפוקסיד).</li>
	<li>להכין µL 500 של לב LB - 10% על ידי ערבוב µL 450 של מדיה LB µL 50 של לב.</li>
	<li>מערבולת סול LB - 10% עבור 5 s ב ההגדרה הגבוהה ביותר. הוסף 20 µL של סול LB - 10% העליון ארבע השורות של בורות מים microplate 96-ובכן.</li>
	<li>מערבולת לב LB - 10% עבור 5 s ב ההגדרה הגבוהה ביותר. להוסיף 20 µL של LB - 10% לב הבאר הראשונה בשורה א</li>
	<li>היכונו דילול טורי כפולה לב LB - 10% על ידי לקיחת 20 µL מן הבאר הראשונה, הוספת הבאר השנייה, pipetting לאורך חמש פעמים. חזור על הפעולה עבור כל בארות ברצף עד ה-11 טוב, אשר בסופו עם 40 µL (איור 7 א).</li>
	<li>להסיר ולמחוק 20 µL של התוכן של ה-11, שימוש של micropipette.</li>
	<li>חזור על הצעדים 2.3-2.7 הסמים NAL ו- PNG באמצעות לשורות microplate, השני והשלישי בהתאמה.</li>
	<li>חזור על הצעדים 2.3-2.7 התרופה לב שוב על השורה הרביעית כפקד של חיובי פנימי.</li>
	<li>שימוש ספקטרופוטומטרים, למדוד את יתר600 של 1:10 דילול של התרבות (שלבים 1.5-1.7).</li>
	<li>לדלל את התאים ב 5 מ של מדיה ליברות יתר600 של 0.01. שופכים לתוך מאגר.</li>
	<li>שימוש של micropipette רב-ערוצי, להוסיף µL 80 של התאים מדולל דילולים טורי סמים מוכנה בשלב 2.4-2.9. ריכוז התרופה האחרונה היטב כל מוצג איור 7 א. חותם את הצלחת כדי למנוע התאיידות.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל h 16 ב 37 º C.</li>
	<li>מתחילים תרבות חדשה חיידקי לשימוש בשלב 3 (חזור על צעדים 1.5-1.7).</li>
</ol>3. ליניארי דילול ניסוי מנה-תגובה
<ol><li>למדוד את ספיגת600 OD לצלחת מנה-תגובה דילול טורי משלב 2 שימוש בקורא צלחת (איור 7 א נכון) ולפרש את התוצאות בהתבסס על השלבים הבאים.</li>
	<li>לנרמל את הצמיחה על ידי חלוקת הגידול בכל טוב עם הגידול בפקד סמים אין עבור כל שורה ולחישוב אחוזי הצמיחה על ידי נרמול OD600למצב ללא סמים.</li>
	<li>לכל סם, אתר הבארות שיש עיכוב גדילה ~ 50% (IC50), שמוצג כתום איור 7 א נכון. הקצה את הריכוז בבארות האלה כמו "IC50 טורי" לכל סם.</li>
	<li>הפשרת סמים טרי aliquots, להכין 1 מ"ל של סול LB - 10% על ידי ערבוב LB ומדיה הממס (דימתיל סולפוקסיד) 9:1 יחס, סמים LB - 10% על ידי ערבוב LB ומדיה סמים על יחס 9:1, הריכוז של התרופה איפה x 100 של IC50 סדרתי של כל תרופה לפני הוספת התקשורת ליברות , כפי שבחרת בשלב 3.3.</li>
	<li>להכין מנות באופן ליניארי הגוברת של סמים לב, NAL ו- PNG בריכוזים 11, על ידי ערבוב LB - 10% sol כרכים שמוצג באיור 7 בוהסמים LB - 10%.</li>
	<li>להכין מנות באופן ליניארי הגוברת של לב על השורה הרביעית כפקד של חיובי פנימי.</li>
	<li>למדוד את יתר600 של ה-1:10 דילול של התרבות התחיל בשלב 2.14.</li>
	<li>לדלל את התאים ב 5 מ של מדיה ליברות יתר600 של 0.01. שופכים לתוך מאגר.</li>
	<li>מוסיפים 80 µL של התאים מדולל על דילולים ליניארי סמים מוכנה בשלב 3.6 באמצעות micropipette רב-ערוצי. ריכוז התרופה האחרונה היטב כל מוצג באיור 7. הערה: באמצע גם המנה-תגובה יקבלו את IC50 סדרתי של הסם. חותם צלחת כדי למנוע התאיידות.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל h 16 ב 37 º C.</li>
	<li>התחל שתי תרבויות חיידקי טריים לשימוש בשלב 4 (חזור על צעדים 1.5-1.7).</li>
</ol>4. אלכסוני סמים אינטראקציה ניסוי
<ol><li>למדוד את ספיגת600 יתר על דילול ליניארי מנה-תגובה מ שלב 3 (איור 7 ב).</li>
	<li>לכל סם, לבחור הריכוז, גרמו IC50, להכין סמים לב, NAL ו- PNG בריכוזים x IC50 100.</li>
	<li>הפשרת סמים טריים, היכונו 100 x IC50 עבור כל הסמים ולהכין תערובות 1:1 סמים לפי נפח של לב + NAL, לב + PNG ו- NAL + PNG ו- 1:1:1 סמים תערובת לפי נפח של לב + NAL + PNG.</li>
	<li>להכין שתי צלחות לניסויים אינטראקציה סמים כמוצג באיור8.</li>
	<li>למדוד את יתר600 של ה-1:10 דילול של התרבויות התחיל בשלב 3.11.</li>
	<li>להכין OD600 = 0.01 דילולים של שתי תרבויות ב שני 10 מ ל LB מדיה.</li>
	<li>מוסיפים 80 µL של התאים מתרבות 1 ו- 2 על צלחות 1 ו- 2, בהתאמה. חותם את הצלחות כדי למנוע התאיידות. דגירה הלוחות עבור h 16 ב 37 º C.</li>
</ol>5. אלכסוני סמים אינטראקציה עם ציונים
<ol><li>למדוד ספיגת600 יתר לאינטראקציה סמים אלכסוני הניסוי צלחות משלב 4.</li>
	<li>לנרמל את הצמיחה על ידי חלוקת הגידול בכל טוב עם הגידול בפקד סמים לא טוב עבור כל שורה.</li>
	<li>עבור כל שורה, אתר את העמודה בעלת הצמיחה עיכוב הקרוב ביותר IC50, שמוצג כתום באיור 8 צודק. הקצה IC50 מבוסס על הריכוז היחסי של סמים בתוך הבאר הזו.</li>
	<li>לב + NAL, לב + PNG של מינון-תגובות NAL + PNG ולב + NAL + PNG, לחשב IC50 הצפוי על ידי חישוב ממוצע של IC50 של התרופות יחיד בכל שילוב. שימו לב כי בממוצע הערכה פשוטה לחישוב IC50 הצפוי המדויק כפי שתואר לפני12.</li>
	<li>לחשב ריכוז מעכבות החלקי (FIC) ציונים על-ידי חלוקת את IC50 נצפתה על ידי IC50 הצפוי בכל שילוב.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השימוש של שילובים תרופתיים נגד פתוגנים או גידולים הוא פרוספקט אטרקטיבי, במיוחד בנסיבות של הצינור לאנטיביוטיקה ייבוש. עם זאת, פוטנציאל זה היא הקשו על ידי לפחות שני קשיים. הקושי הראשון הוא מספר אסטרונומי של צירופים אפשריים. לדוגמה, ישנם 4950 pairwise. צירופים אפשריים בין 100 אנטיביוטיקה. כל השילובים האפשריים בין 100 אנטיביוטיקה (2100) נמצא באותו סדר גודל הצפוי עם המספר של חיידקים על פני כדור הארץ (~ 1030). כיצד לחזות שילובים חריפה סינרגטי בין האפשרויות הללו כבר את הנושא של מחקרים רבים חישובית. הקושי השני הוא המדד של אינטראקציות בסמים גבוהים. קח בחשבון כי פלטפורמה חישובית יכול להציע כי שילוב 10-סמים מסוימים הוא סינרגטי בחריפות נגד חיידקים מסוימים. שיטות מסורתיות כדי לבדוק אינטראקציות בסמים הוא יקר מדי לאמת או להפריך השערה זו, ולכן המחקר של סינרגיה בין תרופות רבות כבר מחוץ לגבולות של חקירה מדעית. שיטת אלכסוני, אשר הועלתה לראשונה לפני כמעט 30 שנה והיה בשימוש מספר מסכי סינרגיה האחרונה מספקים בסיס חזק הבעיה הראשונה, בכך שהוא מאפשר בדיקה של האינטראקציה בין זוגות רבים. הוא פותר את הבעיה השנייה על ידי הדגימה אינפורמטיבי של מבחני המסורתי ומאפשר לימוד גבוהים תרופתיות.
חשוב לציין נציין כי הפרוטוקול שלנו משתמשת מינון לינאריים למדידות אינטראקציה עם סמים, כדי לספק את הרגישות לגילוי אפילו אינטראקציות חלשות. הקמת טווח ריכוז נכון עבור מינון לינאריים הוא משימה מאתגרת. מאת הראשון מבצע לדילול טורי, לנו לקבל החלטה מושכלת לגבי שטח החיפוש עבור מינון לינאריים. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות שונה לשימוש קיפול כפול או דילולים טורי גבוה יותר עבור סמים בדיקות האינטראקציה. שינוי כזה לקצר את זמן הניסוי ולאפשר בדיקה של אינטראקציות יותר; ואולם זה אין רגישות כדי לזהות אינטראקציות רק בחום סינרגטי או עוינת.
פרוטוקול שהסברנו מציג את המדידה של אינטראקציות pairwise או משולשת. היבט חשוב של הפרוטוקול הוא אחד הסוכנים באותה צלחת כמו השילוב, כדי לצמצם הטיה בשל הבדלים צלחת. לכן, ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי למדוד את האינטראקציות עד 7-הדרך שילובים על-ידי שינויים טריוויאלי. שילובים של תרופות יותר מ-7 ידרוש יותר מפעם אחת microplate 96-ובכן, שיקולים נוספים יש לנקוט כדי להבטיח שילוב הנתונים הנכונים, כגון משכפל הבין-plate.
מגבלה הבולטים של השיטה אלכסונית היא ההגבלה כי כל תרופה וזמינותו חייב לעכב את פנוטיפ של עניין. לכן, השיטה אלכסוני אינו שימושי להבנת את האינטראקציות בין סוכנים פעילים וחיסונים adjuvants אינרטי. אינטראקציות 'שמגדיל יכולתו' כזה עשויים להילמד תחת מודלים חלופיים כגון מודלים אושר או סוכן יחיד הגבוהה ביותר.
שיקול חשוב לניתוח של אינטראקציות בסמים גבוהים הוא הבחירה null מודל "מצופה IC50." כאשר שתי תרופות משולבות, האפקט של השילוב בלבד ניתן להשוות את ההשפעות התרופה יחיד. כאשר שלושת התרופות משולבות, ניתן להשוות האפקט של השילוב אפקטים בודדים או אפקטים pairwise. לדוגמה, אם כל השילובים pairwise של שלושת התרופות סינרגטי, ואז זה יש לצפות כי תרופות אלו יראה סינרגיה-כיוונית. הסטייה של אינטראקציה משולשת מה צפוי של אינטראקציות pairwise לאחרונה שכונה "אינטראקציה מתהווים"16,17. פשטות, פרוטוקול שלנו מתאר את המדידה של 3 חלקים של שילוב "נטו אינטראקציה," אשר מגדיר את המודל null השפעות סמים בכול. עם זאת, הנתונים המתקבל מהגדרת הפרוטוקול עשוי לשמש גם כדי לחשב את האינטראקציה מתהווה של השילוב-כיוונית. בניתוח שלנו, אנו מגדירים את IC50 הצפויה של השילוב-כיוונית כממוצע של הסם יחיד IC50s. לחלופין, IC50 צפויה יכולה להיות מוגדרת כממוצע של IC50s של שילובים pairwise (~1.1-1.2). כאשר IC50 נצפתה מחולק ב- IC50 הצפוי חלופית זו, FIC שהושג מספק את FIC מתהווים השילוב-כיוונית, כמו שתואר לעיל12. שיקול זה מגלה כי לב + NAL + PNG הוא סינרגטי יותר מאשר מה מצופה מכל האינטראקציות pairwise בין שלושת התרופות, הוכחת כי לב + NAL + PNG יש סינרגיה מתהווה.

שילובים תרופתיים ייתכן שיישומים השפעה מפתיעה גבוה או נמוך על הפנוטיפ נתון להשפעות של סמים המרכיבים אותה, המתאים סינרגטי או אויבת תרופתיות, בהתאמה1,2,3. השימוש של שילוב סינרגטי עשוי לאפשר המינון להגדלת היעילות וצמצום במינון להקלה לוואי. שילוב הטיפולים עשוי לחול גם עיכובים מרובים למכונאות הסלולר, ובכך חוסם מנגנוני הבריחה אבולוציונית פוטנציאל ההתנגדות4. לכן, שילובים של שלושה או יותר תרופות משמשים באופן שגרתי פתוגן או סרטן הטיפול5.
סינרגיה, אנטגוניזם מוגדרים על-ידי השוואה בין השפעת שילוב לעומת אפקט הצפויה בהתחשב סמים בודדים תופעות שנצפו. בין המודלים תרופתיות, לואי additivity היא המחמירה והקפדנית ביותר יש מודל null מוגדרים היטב (איור 1)6ואת האינטראקציה סינרגיה הנגזרת/אנטגוניזם אינו תלוי ריכוז התרופה בשימוש 6 , 7. לעומת זאת, המודל Loewe היא השפעול יקר אפילו עבור מבחן pairwise אינטראקציה. מבחני אינטראקציה סמים באופן מסורתי המרכיבים של מטריצה דו-ממדית של שילובים תרופתיים ריכוז (וזמינותו לוח שחמט) (איור 2). 5 מנות משמשים עבור כל סם, אם 25 שילובים נדרשים, התואם לאחד מחצית microplate אם מתבצעות בשכפול. העלות של גישה זו אוסרת על סינרגיה מדידה לפי מודל additivity Loewe עבור שילובי סמים רב (איור 3). לדוגמה, כדי לבדוק את האינטראקציה של 10-way, שיטות מסורתיות ידרוש יותר מ 100 אלף microplates, ולסיסמא מדידה ניסיוני של סינרגיה גבוהה-הזמנה לפי מודל additivity Loewe מחמירים, theorized היטב, שאינו תלוי-ריכוז 8.
טיפולים קליניים שוטפים מנצלים רק שבריר של שילובים תרופתיים אפשרי. לדוגמה, הטיפול הסטנדרטי של שחפת פעילה הוא שילוב של שלושה אנטיביוטיקה. ישנם כ 20 אנטיביוטיקה המשמשים לטיפול שחפת Mycobacterium (שחרור מהיר למוט אוכף). ישנם 1140 הקומבינציות אסידו בין 20 תרופות, כל אחד עם פוטנציאל יש סינרגיה חזקה נגד שחרור מהיר למוט אוכף. שם כבר אין שיטה חסכונית כדי למדוד את תגובות בין תרופתיות בין תרופות רבות, הצלת חיים פוטנציאל סינרגטי שילובים נשארים שלא נבדקו.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוט למדוד pairwise וכיוונית תרופתיות באמצעות דגימת רק באלכסון של וזמינותו לוח שחמט (איור 4 , איור 5). הרעיון הבסיסי של דגימה האלכסון של ניסוי לוח שחמט היתה תיאוריה על-ידי Berenbaum בעבודתו החלוצי ב 19789. ובכל זאת, גישה זו רק לאחרונה הוחל סמים סינרגיה מסכי10,11,12. אנו מציגים את הפרוטוקול שלנו עם Escherichia coli (e. coli) ותפקיד של צמיחה. עם זאת, נציין כי הפרוטוקול עצמאי של מינים ביולוגיים, פנוטיפ של עניין, ולכן ניתן להחיל את המידה של סמים גבוהים סינרגיה בהקשרים ביולוגיים אחרים.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Semi Micro Cuvette&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL &amp;nbsp;Eppendorf&amp;nbsp;Microcentrifuge Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L Tips</td><td>Geneseesci</td><td>24830</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Breathable Cell Culture Tube</td><td>VWR</td><td>60819-761</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L Tips</td><td>Geneseesci</td><td>24804</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L Tips</td><td>Geneseesci</td><td>24815</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MIR-262-PA</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C Shaker Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Cell Culture Serological Pipette</td><td>VWR</td><td>53300-421</td><td></td></tr><tr><td>96-well Microplates</td><td>VWR</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Breathable Sealing Film</td><td>USA Scientific</td><td>2920-0010</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41647</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>700926</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth Powder</td><td>RPI</td><td>L24065</td><td></td></tr><tr><td>Levofloxacin</td><td>Sigma</td><td>28266</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>PIPETMAN Classic</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel micropipette</td><td>VistaLab</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixic acid</td><td>Sigma</td><td>N8878</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pump</td><td>Drummond&amp;nbsp;</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservoir</td><td>VWR</td><td>89094-658</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>BIO-RAD</td><td>1702525</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-320-807</td><td></td></tr></tbody></table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

שילוב סינרגטי סמים יש על יעילות גבוהה יותר בהשוואה להשפעות של סמים בודדים. מבחני לוח שחמט, איפה הסמים משולבים במינונים רבים מאפשרים מדידה רגיש של תגובות בין תרופתיות. עם זאת, מבחני האלה יקרות, אל תגדיל גם עבור מדידת אינטראקציה בין תרופות רבות. מספר מחקרים שנערכו לאחרונה דיווחו על סמים אינטראקציה מדידות באמצעות דגימה אלכסוני של לוח שחמט מסורתי וזמינותו. מתודולוגיה חלופית זו במידה רבה מקטין את העלות של סמים אינטראקציה ניסויים ומאפשר אינטראקציה המדידה שילובים עם תרופות רבות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד את האינטראקציות pairwise שלושה, אחד אינטראקציה משולשת בין שלושה אנטיביוטיקה על כפולות, תוך חמישה ימים, תוך שימוש רק שלושה microplates 96-ובכן וציוד מעבדה סטנדרטיים. אנו מציגים תוצאות נציג מראה כי שילוב שלוש-אנטיביוטיקה Levofloxacin + חומצה Nalidixic + פניצילין G הוא סינרגטי. פרוטוקול שלנו להרחבה מדרגית כדי למדוד אינטראקציות בין תרופות רבות, בהקשרים אחרים ביולוגי, המאפשרות מסכי יעיל עבור סינרגיה סמים רב נגד פתוגנים וגידולים.

בעבר דיווחנו את האינטראקציות pairwise בין שלושה סוגי סמים: לב, NAL ו- PNG מבוסס על בדיקות מבחני ולמחקר לוח שחמט, שבו שתי התרופות היו בשילוב13,מטריצה 4 x 414. בעוד NAL ולא לב היו סינרגטי, PNG דווח להיות עוינת עם13,לב והן NAL14. כאן, אנחנו אומת אינטראקציות pairwise אלה נמדד אינטראקציה משולשת בין תרופות אלו שלושה שימוש assay אלכסוני של. התוצאות שלנו להפגין כי לב + NAL + PNG היא שילוב סינרגטי של אנטיביוטיקה 3-way. ייצוג סכמטי עבור התוצאות של סעיפים בודדים ניתוח ניסיוני ניתנו בצד ימין של איור 7 ו איור 8. כאן, אנו מציגים לפרש תוצאות raw נציג שלוש קריאות צלחת, הניתנות באיור9. הקריאה הפלטה מקביל דילול טורי וארוך ניסויים שנערכו שלבים 2 ו- 3. התחתון שני בצלחת הקריאות צלחות אינטראקציה כפולים שנערך בשלב 4.
הנתונים הגולמיים באיור 9 מראה כי הצמיחה העליונה היא סביב 0.55, אבל יש צפיפות אופטית 0.05 של התקשורת עצמה, כפי שנצפתה ה OD600 של ריכוז גבוה סמים שבה אין צמיחה. לכן, אנו מגדירים IC50 כמו (0.55-0.05)/2 = 0.25. עבור כל מנה-תגובה, הבארות ממוקם קרוב לערך זה מוצגים עם כתום.
החצי העליון של איור 9A מציגה את התוצאות של שלב 2, טורי מנה-תגובה ניסוי. בארות IC50 לב הוא עמודה 10 עובדים בשני משכפל, אשר תואמות את 4 ng/mL. IC50 עבור NAL ו- PNG נמצאים 3 µg/mL 25 µg/mL, בהתאמה. ריכוזים אלה תואמים ריכוז 1 x שמוצג באיור 7. החצי התחתון של איור 9B מציגה את התוצאות של שלב 3, ניסויים של מנה-תגובה לינארית. לב, NAL, IC50 של PNG נמצאים 0.4 x, 0.8 x ו- 1.2 x, בהתאמה. ריכוזים אלה מוקצות כמו ה 1 X IC50 שלב 4.
שתי צלחות המתאים שכפול שני ניסויים מוצגות באיור איור 9B, איפה IC50 בארות מוצגים עם כתום. בצלחת 1, כל התרופות יחיד יש IC50 שלהם 1 x ריכוז. IC50 הצפוי עבור שילוב pairwise או משולשת מחושב לפי הממוצע החשבוני של סמים המרכיבים אותה, שהופך IC50 הצפוי עבור כל שילובי גם 1 x ריכוז. בצלחת 2, לב ו- PNG יש IC50 שלהם-ריכוז 1 x, אך NAL IC50 ב 1.2 x. IC50 הצפוי עבור כל שילוב מוגדר באמצעות אמצעי האריתמטיקה של ערכים אלה IC50. לדוגמה, IC50 הצפוי עבור לב + NAL ו- NAL + PNG היא 1.1 x. האינטראקציה סמים ניקוד (FIC) עבור כל צירוף הוא מחושב על ידי חלוקת נצפתה IC50 עם IC50 הצפוי, כפי שמוצג על הצד הימני של הלוחות. בדיקה של עשרות FIC שתי צלחות מדגים לב + NAL ולא לב + NAL + PNG הם סינרגטי, ואילו לב + PNG ו- NAL + PNG הם אויבת. FIC ציוניהם ב שתי צלחות הם מסכימים, המשנה את המהימנות של הפרוטוקול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> איור 1: Null ההגדרה המודל עבור לואי additivity סמים אינטראקציה דגם- 5 x 5 שתי מטריצות על microplate, שבו סמים A באופן ליניארי גדל בציר אחד כפי שמוצג בחלק השמאלי, ריכוז העליון של התרופה מעכב הפנוטיפ לכימות (למעלה מימין). התוספת של מטריצות אלה מוצג באמצע, שבו הקווים המחברים equipotent סמים ריכוזים של כל תרופה יחידה יש ריכוז זהה כמו סמים א כאשר תאים נוספים על "בשביל" של שילובים תרופתיים ריכוז, צפוי כי פנוטיפ מוקלט על הקו הזה יהיה שווה בשביל הבארות שהיא מתחברת. בניסוי זה האינטראקציה האני-עצמי בסמים, isobole המתארים את הפנוטיפ (מוצג עם קו ירוק מקווקו) צפוי להיות ליניארי, הגדרת המודל additivity null. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> איור 2: תרופתיות Pairwise לפי מודל האינטראקציה של סמים additivity Loewe. כאשר שתי תרופות משולבות ב- assay לוח שחמט כמו באיור 1, קווי המתאר isophenotypic נצפתה עשוי להיות ישר, קמורה או קעורה. בצד ימין, קווי המתאר isophenotypic אפשרי (קווים ירוק מקווקו) הם יונחו על מבחני לוח שחמט. שילובים תרופתיים עם קווי מתאר isophenotypic ישר הן לאו-תוסף, קווי המתאר אינם שונים בכשל תרופתי האני-עצמי, אשר הוא לואי-תוסף לפי ההגדרה. כאשר קווי המתאר isophenotypic באופן משמעותי קעורים או קמורים, השילוב הוא סינרגטי או עוינת, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> איור 3: 3 חלקים תרופתיות לפי מודל האינטראקציה של סמים additivity Loewe. בדומה וזמינותו לוח שחמט עבור אינטראקציות pairwise, שלוש-סמים משולבים ברשת תלת-ממד ("checkercube"), שבו כל תרופה הוא גדל באופן ליניארי בציר אחד. אם הסמים שלושה היו זהים, פני השטח isophenotypic צפוי להיות שטוח, מגדיר את additivity עבור שלושה שילובים תרופתיים. אם השטח יותר קעורים או קמורים יותר מודל null זה לאו-תוסף, שילובים תרופתיים הם סינרגטי או עוינת, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> איור 4: שיטת באלכסון כדי למדוד תרופתיות pairwise. עבור כל לוח שחמט assay, נמדדים רק את האזורים המוצגים מלבנים בצבע ארגמן. i ו- ii הם ליניארי סמים בכול ריכוזים. השלישי הוא מוערך על ידי תערובת 1:1 של שתי תרופות ו באופן ליניארי titrating תערובת זו כאילו היא תרופה בודדת. FIC שווה IC50 נצפתה בשילוב מחולק את IC50 הצפויה של שתי תרופות יחיד. עבור המודל additivity לאו, IC50 הצפוי נאמדת באמצעות IC50 הממוצע של התרופות שני יחיד. ערך FIC 1 עבור זוגות לואי-תוסף והיא נמוכה או גבוהה מ- 1 עבור זוגות סינרגטי או עוינת, בהתאמה2,12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> איור 5: שיטת באלכסון כדי למדוד-כיוונית תרופתיות. עבור כל checkercube assay, נמדדים רק את האזורים המוצגים. i, ii ו- iii נמצאים ליניארי סמים בכול ריכוזים. iv נמדד על ידי ביצוע של 1:1:1 תערובת של שלושת התרופות באופן ליניארי titrating תערובת זו כאילו היה תרופה בודדת. הריכוז המעכב החלקי שווה ה IC שנצפה50 בשילוב מחולק את IC50 הצפוי מקבלים שלוש תרופות יחיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> איור 6: זרימת עבודה עבור הפרוטוקול בשיטה אלכסונית המתוארים בזאת ואת פרטי ההתקנה עבור כל microplate. הצלחת באיור 4 יום מתבצע תוך שכפול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> איור 7: דילול טורי וארוך מנה-תגובה ניסויים. (א) הכנה של דילול טורי מנה-תגובה סמים וריכוזי סמים הסופית המתאימה. E. coli תאים נוספים לצלחת; צמיחה נרשם לאחר ה 16 IC50 טורי, שמוצג כתום, נבחרה עבור כל סם טעם למחרת של ליניארי דילול מנה-תגובה ניסויים. (B) הכנה של דילול ליניארי מנה-תגובה סמים וריכוזי סמים הסופית המתאימה. E. coli תאים נוספים לצלחת; צמיחה נרשם לאחר 16 שעות. לכל סם, IC50s שנבחר אשר ישמש בליום סמים אינטראקציה ניסויים מוצגים ב orange. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> איור 8: סמים אינטראקציה ניסויים. הכנת ניסויים האינטראקציה הוא דומה יחיד סמים ליניארי מינון-תגובות, למעט 1:1 או 1:1:1 תערובת של תרופות משמש לשניים או שלוש תרופות במינון-תגובות, בהתאמה. נצפתה IC50s עבור כל מנה-תגובה, מתואר ב orange, משמשים לחישוב FIC ציונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> איור 9: נציג ניסוי תוצאות. נציג התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול המתואר מוצגים, עם פרטי ההתקשרות לטקסט הראשי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs at JoVE.com

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

שיטת באלכסון כדי למדוד סינרגיה בין כל מספר של סמים

ב פרוטוקול זה, נתאר כיצד להפוך Loewe סמים additivity אינטראקציה מדידות של pairwise ואת שילובים תרופתיים-כיוונית.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

diagonal-method-to-measure-synergy-among-any-number-of-drugs

Research

JoVE Journal

Biology

18.3K Views.  Sabanci University. ב פרוטוקול זה, נתאר כיצד להפוך Loewe סמים additivity אינטראקציה מדידות של pairwise ואת שילובים תרופתיים-כיוונית.

Video: Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Genetics

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Cancer Research

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of both synthetic lethal interactors leads to loss of cell viability or cell death. The best studied synthetic lethal interaction is between BRCA1/2 and PARP1, with PARP1 inhibitors being used in clinical practice to treat patients with BRCA1/2 mutated tumors. Large genetic screens in model organisms but also in haploid human cell lines have led to the identification of numerous additional synthetic lethal interaction pairs, all being potential targets of interest in the development of novel tumor therapies. One approach is to therapeutically target genes with a synthetic lethal interactor that is mutated or significantly downregulated in the tumor of interest. A second approach is to formulate drug combinations addressing synthetic lethal interactions. In this article, we outline a data integration workflow to evaluate and identify drug combinations targeting synthetic lethal interactions. We make use of available datasets on synthetic lethal interaction pairs, homology mapping resources, drug-target links from dedicated databases, as well as information on drugs being investigated in clinical trials in the disease area of interest. We further highlight key findings of two recent studies of our group on drug combination assessment in the context of ovarian and breast cancer.

Large genetic screens in model organisms have led to the identification of negative genetic interactions. Here, we describe a data integration workflow using data from genetic screens in model organisms to delineate drug combinations targeting synthetic lethal interactions in cancer.

זרימת עבודה של שילוב נתונים לזיהוי שילובי תרופות המכוונים לאינטראקציות קטלניות סינתטיות

A synthetic lethal interaction between two genes is given when knock-out of either one of the two genes does not affect cell viability but knock-out of ...

Spheroid Drug Sensitivity Screening in Glioma Stem Cell Lines

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens are performed on cells grown in a monolayer. However, these two-dimensional (2D) models are considered less accurate compared to three-dimensional (3D) spheroid cell models; this is especially true for glioma stem cell lines. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening of spheroid lines; mouse and human glioma stem cell lines are used as an example. This protocol describes a 3D spheroid drug sensitivity and synergy assay that can be used to determine if a drug or drug combination induces cell death and if two drugs synergize. Glioma stem cell lines are&#160;modified to express RFP. Cells are plated in low attachment round well bottom 96 plates, and spheres are allowed to form overnight. Drugs are added, and the growth is monitored by measuring the RFP signal over time using the Incucyte live imaging system,&#160;a fluorescence microscope embedded in the tissue culture incubator. Half maximal inhibitory concentration (IC50), median lethal dose (LD50), and synergy score are subsequently calculated to evaluate sensitivities to drugs alone or in combination. The three-dimensional nature of this assay&#160;provides a more accurate reflection of tumor growth, behavior, and drug sensitivities in vivo, thus forming the basis for further preclinical investigation.

In vitro drug sensitivity screens are important tools for discovering anti-cancer drug combinations. Cells grown in spheres activate different signaling pathways and are considered more representative of in vivo models than monolayer cell lines. This protocol describes a method for in vitro drug screening for spheroid lines.

In vitro drug sensitivity screens are important tools in the discovery of anti-cancer drug combination therapies. Typically, these in vitro drug screens ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

Immunology and Infection

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

סינרגיה מיקרוביאלית בדיקות על ידי באמצעות מדפסת הזרקת דיו לוח שחמט אוטומטיות מערך ושיטת להרוג זמן ידנית

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The Quadruple&#160;checkerboard, also called the Q-checkerboard, aims at maximizing the number of possible combinations that can be obtained between four drugs in one experiment to minimize the time and work needed to accomplish the same results with other protocols. This protocol is based on the simple micro dilution technique where the drugs are diluted and combined together in several 96-well plates.
In the first set of 96-well plates, Muller-Hinton broth is added followed by the first required drug (e.g., Cefotaxime here) to serially dilute it. After the first step is done, another set of 96-well plates is used to dilute the second drug (e.g., Amikaci), which will be transferred by removing a specific volume of drug 2 and put in the corresponding wells in the first set of 96-well plates that contains drug one. The third step is done by adding the required concentrations of the third drug (e.g., Levofloxacin), to the appropriate plates in the initial set containing combination of drug 1 and 2. The fourth step is done by adding the required concentrations of the fourth drug (e.g., Trimethoprim-sulfamethoxazol) into the appropriate plates in the first set. Then, E. coli ESBL bacterial inoculum will be prepared and added.
This method is important to evaluate all the possible combinations and has a wider range of possibilities to be tested furthermore for in vivo testing. Despite being a tiring technique requiring a lot of focus, the results are remarkable and time saving where a lot of combinations can be tested in a single experiment.

This protocol describes how to study all possible combinations that can be obtained between four drugs in one single experiment. This method is based on the standard 96-well plate micro dilution assay and the calculation of fractional inhibitory concentrations (FICs) to evaluate the results.

לוח בדיקה מרובע: שינוי לוח השחמט התלת מימדי לחקר שילובי סמים

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

Agonism and Antagonism: Quantification

When drugs are administered, they can elicit either an agonist or antagonist effect on the body. Agonism occurs when a drug activates a specific receptor, triggering a biological response. On the other hand, antagonism happens when a drug binds to the same receptors but blocks their activation, thereby preventing a biological response.
To quantify these effects, researchers use a dose-response curve, which provides valuable information about the potency and efficacy of a drug. Potency refers to the amount of drug required to produce a particular response, while efficacy measures the maximum therapeutic effect achievable with the drug.
In addition to agonism and antagonism, drug interactions play a significant role in determining the overall effect. Drug interactions can be additive or synergistic. Additive effects occur when the combined effect of two drugs equals the sum of their individual effects. For example, if one drug lowers blood pressure by ten units and another drug lowers it by fifteen units, their combined effect would be a reduction of twenty-five units in blood pressure.
Synergism, on the other hand, happens when the combined effect of two drugs exceeds the sum of their individual effects. This is commonly observed in the treatment of heart disease, where the combined effect of aspirin and clopidogrel on preventing blood clots surpasses what either drug could achieve alone.
To visually represent these interactions, researchers often use isobolograms. Isobolograms provide a graphical representation of the quantitative relationship between two drugs and their combined effect. This visual tool enables researchers to analyze and understand the nature of drug interactions more effectively.
Understanding the dynamics of drug effects and interactions is crucial in developing safe and effective treatments. Researchers can optimize drug therapy regimens, minimize adverse effects, and maximize therapeutic outcomes by comprehending the mechanisms of agonism, antagonism, and synergism.

שיטת באלכסון כדי למדוד סינרגיה בין כל מספר של סמים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה²