이 작품은 NIGMS 그랜트 P50GM107618에 의해 투자 되었다. 저자는 Zohar B. 와인 스타인 통찰력 있는 의견 및 원고에 대 한 제안 감사합니다.

참고: 대장균 박테리아의 성장을 억제 하는 어떤 작은 분자는 대각선 방법에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜, levofloxacin (레프), nalidixic 산 (NAL), 및 페니실린 G (PNG) 사용 됩니다 예를 들어, 이러한 약물 표시 현저한 3 방향 시너지 때문. 이 프로토콜의 워크플로 그림 6으로 표시 됩니다. 실 온에서 모든 단계를 실시 합니다. 박테리아와 약물의 신선한 aliquots 매일 사용 합니다. 대장균에 대 한 적절 한 biosafety 수준에서 실험을 수행 합니다.
1. 준비 단계
<ol><li>증류수 1 l 파운드 국물의 25 g을 추가 하 여 Luria Bertani (파운드) 미디어를 준비 하 고 혼합. 15 분 및 실내 온도에 압력가 미디어 저장소를 위한 121 ° C에 고압.</li>
	<li>살 균 50% 글리세롤과 세600 희석 하는 세균성 세포의 동일한 볼륨을 혼합 하 여 대장균 글리세롤 주식 준비 = 1 파운드 국물 하 고 동결-80 ° c.에 1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 150 µ L aliquots</li>
	<li>항생제, 레프, NAL, 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 각의 1 mL에 PNG의 20 밀리 그램을 디졸브. DMSO의 990 µ L로 레프 솔루션의 10 µ L를 혼합 하 여 레프 솔루션 100 x 0.2 µ g/mL를 희석. 0.2 mg/mL 레프, 그리고 20 mg/mL NAL 및 PNG 진행 단계에서 사용 합니다.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브를-20 ° c.에 동결 각 항생제의 aliquot 50 µ L</li>
	<li>받아 한 150 µ L 약 수의 대장균 -80 ° c.에서 해 동.</li>
	<li>14 mL 문화 관에 있는 LB 매체의 5 mL에 대장균 글리세롤 주식의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>밤새 200 rpm에서 37 ° C 배양 기에서 튜브를 흔들어.</li>
</ol>2. 직렬 희석 복용량 응답 실험
<ol><li>-20 ° C에서 약 레프, NAL, PNG의 한 약 수, 해 동 하 여 이들이 약물의 직렬 희석에 대 한 준비 10 분 동안 실내 온도에 그들을 두고.</li>
	<li>파운드-10%의 LB 미디어의 990 µ L를 혼합 하 여 µ L 1100와 용 매 (DMSO) 110 µ L를 준비 합니다.</li>
	<li>500 µ L 파운드 미디어의 450 µ L를 혼합 하 여 파운드-10% 레프의와 레프의 50 µ L를 준비 합니다.</li>
	<li>5 소용돌이 % 파운드-10 솔 가장 높은 설정에서 s. 96-잘 microplate에 웰 스의 4 행에 파운드-10%의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>5 파운드-10% 레프 소용돌이 가장 높은 설정에서 s. 20 µ L % 파운드-10 레프의 행 A. 첫 번째 잘 추가</li>
	<li>5 번 위아래로 pipetting 두 번째 음을 추가 하는 첫 번째 우물에서 20 µ L를 취하여 파운드-10% 레프에 대 한 두 배 직렬 희석을 준비 합니다. 반복이 모든 우물에 대 한 순차적으로 40 µ L (그림 7A), 11까지.</li>
	<li>제거 하 고는 micropipette를 사용 하 여 잘, 20 µ L 11에서 콘텐츠를 삭제 합니다.</li>
	<li>NAL 및 PNG 각각 microplate의 두 번째 및 세 번째 행을 사용 하 여 약 2.3-2.7 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>내부 긍정적인 컨트롤로 단계 2.3-2.7 마약 레프 네 번째 행에 다시 반복 합니다.</li>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 1시 10분의 OD600 문화 (단계 1.5-1.7)의 희석.</li>
	<li>셀 0.01의 OD600 파운드 미디어의 5 mL에 희석. 저수지로 부 어.</li>
	<li>멀티 채널 micropipette를 사용 하 여 마약 직렬 희석 단계 2.4 2.9에서에서 준비 희석된 셀의 80 µ L를 추가 합니다. 각 잘에 최종 약물 농도 그림 7A에 표시 됩니다. 증발을 방지 하기 위해 접시를 봉인.</li>
	<li>16 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어</li>
	<li>(반복 단계 1.5-1.7) 3 단계에서 사용 하는 새로운 세균성 문화를 시작 합니다.</li>
</ol>3. 선형 희석 복용량 응답 실험
<ol><li>(그림 7A 오른쪽) 플레이트 리더를 사용 하 여 2 단계에서 직렬 희석 복용량 응답 접시 세600 흡 광도 측정 하 고 다음 단계에 따라 결과 해석.</li>
	<li>각 행에 대해 아무 약물 제어의 성장과 함께 각 잘에서 성장 나누어 성장 정상화 그리고 OD600아무 약물 상태를 정상화 하 여 백분율 성장 계산할.</li>
	<li>각 약물에 대 한 50% 성장 억제 (IC50), 그림 7A 오른쪽에 주황색 표시는 우물을 찾습니다. 각 약물에 대 한 "직렬 IC50"로이 스 농도 지정 합니다.</li>
	<li>신선한 약물 aliquots을 녹여, 파운드-10%의 1 mL 파운드 미디어 및 약물의 농도 LB 미디어를 추가 하기 전에 각 약물의 직렬 IC50의 100 x 9:1 비율에서 약물을 혼합 하 여 파운드 미디어와 용 매 (DMSO)는 9:1 비율에 파운드-10% 약물을 혼합 하 여 준비 단계 3.3에서 선택한.</li>
	<li>파운드-10% 약물 및 그림 7B에 표시 된 볼륨에 % 파운드-10 솔을 혼합 하 여 약물 레프, NAL PNG 11 농도에 선형적으로 증가 복용량을 준비 합니다.</li>
	<li>내부 긍정적인 컨트롤로 레프의 네 번째 행에 선형으로 증가 복용량을 준비 합니다.</li>
	<li>1시 10분의 OD600 측정 문화권의 희석 단계 2.14에서에서 시작.</li>
	<li>셀 0.01의 OD600 파운드 미디어의 5 mL에 희석. 저수지로 부 어.</li>
	<li>마약 선형 희석 단계 사용 하 여 멀티 채널 micropipette 3.6에서에서 준비에 희석된 세포의 80 µ L를 추가 합니다. 각 잘에 최종 약물 농도 그림 7B에 표시 됩니다. 참고: 복용량 응답에서 중간이이 약에 대 한 직렬 IC50 받게 됩니다. 증발을 방지 하기 위해 접시를 봉인.</li>
	<li>16 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어</li>
	<li>(반복 단계 1.5-1.7) 4 단계에서 사용 하 여 2 개의 신선한 세균성 문화를 시작 합니다.</li>
</ol>4. 대각선 약물 상호 작용 실험
<ol><li>단계 3 (그림 7B)에서 선형 희석 복용량 응답의 OD600 흡 광도 측정 합니다.</li>
	<li>각 약물에 대 한 IC50 귀착되 고 준비 농도 100 x IC50 농도에서 마약 레프, NAL 및 PNG를 선택 합니다.</li>
	<li>신선한 약물을 녹여, 100 준비 각 x IC50 마약 및 레프 + NAL, 레프 + PNG 및 NAL + PNG 및 1의 볼륨에 의해 약 1:1 혼합물을 준비: 레프 + NAL + PNG의 볼륨 1:1 약물 혼합.</li>
	<li>그림 8에서 같이 약물 상호 작용 실험에 대 한 두 접시를 준비 합니다.</li>
	<li>1시 10분의 OD600 측정 문화의 희석 단계 3.11에서에서 시작.</li>
	<li>준비 세600 파운드 미디어의 두 10 mL에 2 개의 문화의 0.01 희석 =.</li>
	<li>문화 1과 판 1, 2, 2에서에서 셀의 80 µ L를 각각 추가 합니다. 증발을 방지 하기 위해 접시를 봉인. 16 h 37 ° c.에 대 한 번호판을 품 어</li>
</ol>5. 대각선 약물 상호 작용 점수
<ol><li>대각선 약물 상호 작용에 대 한 OD600 흡 광도 측정 실험 접시 4 단계에서.</li>
	<li>각 행에 대해 잘 아니 약 제어에 성장에 각 잘 성장 나누어 성장 정상화.</li>
	<li>각 행에 대 한 성장 저해 IC50, 오른쪽 오렌지 그림 8에서에 표시 된 가장 가까운 있는 열을 찾습니다. IC50 약이 잘에서의 상대 농도에 따라 할당 합니다.</li>
	<li>레프 + NAL, 레프 + PNG 및 NAL + PNG 및 레프 + NAL + PNG 복용량 응답, 각 조합에 단일 약물의 IC50 평균 예상된 IC50 계산 합니다. 평균는 정확한 예상된 IC50 계산에 대 한 간단한 근사12전에 설명한 대로 note.</li>
	<li>각 조합에서 예상된 IC50에 의해 관찰된 IC50 나누어 소수 금지 농도 (FIC) 점수를 계산 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+therapeutics:+when+the+whole+is+greater+than+the+sum+of+the+parts.">Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts.</a> Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+synergy?.">What is synergy?.</a> Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).</li><li>Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+and+their+interactions.">Drugs and their interactions.</a> Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).</li><li>Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+and+the+evolution+of+antibiotic+resistance.">Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).</li><li>Leh&#225;r, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+combination+effects+and+biological+robustness.">High-order combination effects and biological robustness.</a> Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).</li><li>Loewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+problem+of+synergism+and+antagonism+of+combined+drugs.">The problem of synergism and antagonism of combined drugs.</a> Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).</li><li>Foucquier, J., Guedj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+drug+combinations:+current+methodological+landscape.">Analysis of drug combinations: current methodological landscape.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 3 (3), (2015).</li><li>Wood, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+interactions+and+the+battle+against+combinatorics+in+multidrug+therapies.">Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).</li><li>Berenbaum, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+testing+for+synergy+with+any+number+of+agents.">A method for testing for synergy with any number of agents.</a> Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).</li><li>Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bioassay+to+identify+antimicrobial+drugs+through+drug+interaction+fingerprint+analysis.">Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis.</a> Scientific Reports. 7, 42644 (2017).</li><li>Horn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-order+drug+combinations+are+required+to+effectively+kill+colorectal+cancer+cells.">High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells.</a> Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).</li><li>Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+measurement+and+factorization+of+high-order+drug+interactions+in+Mycobacterium+tuberculosis.">Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis.</a> Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenomics+and+orthology-based+design+of+antibiotic+combination+therapies.">Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies.</a> Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).</li><li>Mason, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+antibiotic+interactions+using+descriptors+derived+from+molecular+structure.">Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).</li><li>Yilancioglu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-independent+prediction+of+drug+synergies+using+only+drug+lipophilicity.">Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).</li><li>Beppler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+emergent+interactions+in+three-way+combinations+of+stressors.">Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors.</a> Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).</li><li>Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+identification+of+synergistic+and+antagonistic+emergent+interactions+among+three+or+more+drugs.">Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs.</a> Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

병원 체 또는 종양에 대 한 약물 조합의 사용은 건조 항생제 파이프라인의 상황 특히 매력적인 전망 이다. 그러나,이 잠재력은 적어도 2 개의 어려움에 의해 방해 된다. 첫 번째 어려움이 가능한 조합의 천문학적입니다. 있다, 예를 들어 100 항생제 중 4950 가능한 없음을 조합. 100 항생제 사이 모든 가능한 조합 (2100) 지구에 박테리아의 수와 동일한 크기 순서에는 (10 ~30). 이러한 가능성 중 강하게 시너지 조합을 예측 하는 방법 수많은 전산 연구의 대상이 되었습니다. 두 번째 어려움은 상위 약물 상호 작용의 측정. 고려 전산 플랫폼 특정 10-약물 조합을 특정 병원 체에 대 한 강력한 시너지는 제안할 수 있습니다. 약물 상호 작용을 테스트 하는 전통적인 방법을 확인 하거나이 가설을 반박 하려면 너무 비용이 많이 드는, 따라서 많은 약물 시너지 효과의 연구 과학적 탐구의 경계에 밖으로 왔다. 거의 30 년 전 처음 제안 하 고 몇 가지 최근 시너지 화면에 사용 된 대각선 방법 많은 쌍 사이 상호 작용의 테스트 함으로써 첫 번째 문제에 대 한 강력한 기반을 제공 합니다. 그것은 전통적인 분석 실험의 유익한 샘플링에 의해 두 번째 문제를 해결 하 고 상위 약물 상호 작용의 연구를 수 있습니다.
우리는 중요 한 것은 주의 우리의 프로토콜 사용 하 여 선형 주입 약물 상호 작용 측정을 위해도 약한 상호 작용 검출을 위한 감도 제공. 선형 먹이 지 오른쪽 농도 범위를 설정 하는 것은 도전 작업입니다. 첫 번째 수행 직렬 희석, 하 여 우리 선형 먹이 지에 대 한 검색 공간에 대 한 정보통된 결정을 확인 합니다. 그러나, 2-fold 사용 하는 프로토콜을 수정할 수 또는 높은 직렬 희석에 대 한 약물 상호 작용 테스트. 이러한 수정 실험 시간 단축을 허용 더 많은 상호 작용;의 테스트 그러나, 그것은 강하게 상승 또는 대립만 상호 작용을 검출 하는 감도 할 것입니다.
우리가 설명 하는 프로토콜 없음을 또는 3 방향 상호 작용의 측정을 보여줍니다. 프로토콜의 중요 한 측면은 단일 에이전트 플레이트 변이 때문에 바이어스를 최소화 하기 위해 조합으로 같은 접시에는. 따라서, 사소한 수정에 의해 7-방향 조합까지 상호 작용을 측정 하는 프로토콜을 조정할 수 있습니다. 7 개 이상의 약물의 조합 되며 하나 이상의 96-잘 미 판과 추가 고려 사항 간 plate 복제 등 올바른 데이터 통합을 보장 하기 위해 이동 해야 합니다.
대각선 방법의 주목할 만한 한계 분석 결과에서 각 약 관심의 표현 형을 억제 해야 하는 제한입니다. 따라서, 대각선 방법은 활성 에이전트 불활성 adjuvants 간의 상호 작용을 이해 하는 데 유용 하다. 이러한 'potentiating' 상호 작용 행복 또는 높은 단일 에이전트 모델 대체 모델에서 공부 될 수 있습니다.
상위 약물 상호 작용의 분석을 위한 중요 한 고려 사항은 이다 "예상 IC50."에 대 한 null 모델 선택 두 약물 결합, 결합의 효과 단일 약물 효과에 비교할 수 있습니다. 3 약물 결합 될 때 하나의 효과 또는 없음을 효과에 결합의 효과 비교할 수 있습니다. 예를 들어 3 개의 약의 모든 인덱스도 조합 시너지 인 경우 다음 그것은 예상 수 있습니다 수이 약 3 방향 시너지를 보여줄 것 이다. 없음을 상호 작용에서 예상 되는 무슨에서 3 방향 상호 작용의 편차는 최근 별명 "긴급 상호 작용"16,17. 편의상 3 가지 방식의 조합 "net 상호 작용의," null 모델을 정의 하는 단일 약물 효과로 측정을 우리의 프로토콜에 설명 합니다. 그러나, 프로토콜에서 얻은 데이터도 3 방향 조합의 긴급 상호 작용을 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 우리의 분석에 3 방향 조합의 예상된 IC50 단일 약 IC50s의 평균으로 정의. 또는 예상된 IC50 없음을 조합 (~1.1-1.2)의 IC50s의 평균으로 정의할 수 있습니다. 관찰된 IC50이 대체 예상된 IC50 나눈, 획득된 FIC는 앞에서 설명한12로 3 가지 방식의 조합에 대 한 긴급 FIC을 제공 합니다. 이 레프 + NAL + PNG는 세 가지 약물 중 없음을 상호 작용에서 예상 되는 것 보다 더 시너지 레프 + NAL + PNG 응급 시너지 효과 보여주는 계시 한다.

약물 조합을 의외로 높은 또는 낮은 효과 시너지 또는 대립 약물 상호 작용, 각각,12,3에 해당 하는 구성 약물의 효과 주어 표현 형에 전시 수 있습니다. 시너지 조합 사용 효능 증가 복용량 단계적 확대 및 부작용 완화를 위해 복용량 감소 수 있습니다. 조합 치료 또한 세포질 기계, 저항4잠재적인 진화 탈출 메커니즘을 차단 함으로써 여러 난관을 적용할 수 있습니다. 따라서, 3 개 이상의 약물의 조합은 정기적으로 병원 체 또는 암 치료5에 사용 됩니다.
시너지와 적개심 개별 약물 효과 주어 예상된 효과 대 한 조합의 관찰된 효과 비교에 의해 정의 됩니다. 약물 상호 작용에 대 한 모델 중에서 베 가산 가장 엄격 하 고 잘 정의 된 null 모델 (그림 1)6, 그리고 유추 시너지/적개심 상호 작용은 사용 하는 약물 농도의 독립 6 , 그러나 7.,로 베 모델은 실험적으로 없음을 상호 작용 시험에 대 한 비용이 많이 드는. 약물 상호 작용 분석 실험은 전통적으로 약물 농도 조합 (바둑판 분석 결과)의 2D 매트릭스의 구성 (그림 2). 5 복용량이 각 약품 사용 경우 25 조합 필요, 하나에 해당 하는 미 판 실험 복제에서 실시 하는 경우의 절반. 이 방법의 비용 베 가산 모델 다중 약물 조합 (그림 3)에 대 한 시너지 효과 측정을 금지합니다. 예를 들어 10 방법 상호 작용을 테스트 하려면 전통적인 방법 필요 이상의 100 천 microplates, 엄격 하 고, 잘 theorized 고 농도 독립적인 베 가산 모델에서 상위 시너지 효과의 실험 측정을 금지 8.
현재 임상 치료 가능한 약물 조합 중 일부만을 사용합니다. 예를 들어 결핵의 표준 치료 3 항생제의 조합 이다. 결핵균 (Mtb) 치료에 사용 되는 약 20 항생제가 있다. Mtb에 대 한 강한 시너지를 잠재력 각 20 마약 중 1140 가능한 3 방향 조합 있다. 많은 약물 중 약물 상호 작용을 측정 하기 위해 비용 효율적인 방법 되었습니다, 잠재적으로 생명을 구하는 시너지 조합 안 된 남아 있습니다.
여기, 우리만 바둑판 분석 결과 (그림 4 의 대각선을 샘플링 하 여 쌍이 들어와 3 방향 약 상호 작용을 측정 하는 간단한 프로토콜을 설명 하 고 그림 5). 바둑판 실험의 대각선 샘플링의 기본 개념은 Berenbaum 19789에 있는 그의 정액 일에서에 이론 됩니다. 그러나,이 방법은 최근에 마약 시너지 화면10,,1112에 적용 되었습니다. 선물이 우리의 프로토콜 대장균 (E. 콜라가)와 성장 표현 형. 그러나, 우리는 프로토콜 생물학 종 및 관심의 표현 형의 독립적 이며 따라서 다른 생물학 문맥에서 상위 약 시너지 효과의 측정에 적용할 수 있습니다 주의.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="528">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1.5 mL Semi Micro Cuvette&#160;</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97000-586</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">1.5 mL &#160;Eppendorf&#160;Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:125px;">USA Scientific</td>
			<td>4036-3204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">1000 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">14 mL Breathable Cell Culture Tube</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>60819-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">200 &#181;L Tips</td>
			<td style="width:125px;">Geneseesci</td>
			<td>24815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Panasonic</td>
			<td>MIR-262-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C Shaker Incubator</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 mL Cell Culture Serological Pipette</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>53300-421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Microplates</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>15705-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breathable Sealing Film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2920-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">DMSO</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>41647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Escherichia coli</td>
			<td style="width:125px;">ATCC</td>
			<td>700926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Glycerol</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">LB Broth Powder</td>
			<td style="width:125px;">RPI</td>
			<td style="width:119px;">L24065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">28266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micropipette</td>
			<td style="width:125px;">GILSON</td>
			<td style="width:119px;">PIPETMAN Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:125px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">Synergy H1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multichannel micropipette</td>
			<td style="width:125px;">VistaLab</td>
			<td style="width:119px;">1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Nalidixic acid</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N8878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:223px;">Penicillin G</td>
			<td style="width:125px;">Sigma</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Pump</td>
			<td>Drummond&#160;</td>
			<td>4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent Reservoir</td>
			<td style="width:125px;">VWR</td>
			<td>89094-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:125px;">BIO-RAD</td>
			<td>1702525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-320-807</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

diagonal method to measure synergy among any number of drugs

시너지 약물 조합 개별 약물의 효과에 비해 더 높은 효능이 있다. 바둑판 분석 실험, 어디 약물 많은 복용량 결합 되어, 약물 상호 작용의 중요 한 측정을 허용 합니다. 그러나,이 분석 실험은 비용이 많이 드는 고 많은 약물 간의 상호 작용을 측정 하기 위한 잘 확장 되지 않습니다. 몇몇 최근 연구는 약물 상호 작용 측정의 전통적인 바둑판 분석 결과 대각선 샘플링을 사용 하 여 보고 있다. 이 대체 방법은 크게 약물 상호 작용 실험의 비용을 감소 하며 많은 약물과 조합에 대 한 상호 작용을 측정 여기, 3 없음을 상호 작용 및 5 일에서 중복, 3 항생제 중 한 3 방향 상호 작용을 측정 하는 프로토콜 3 96-잘 microplates 및 표준 실험실 장비를 사용 하 여 설명 합니다. 선물이 Levofloxacin + Nalidixic 산 + 페니실린 G 3-항생제 결합은 시너지를 보여주는 대표적인 결과. 우리의 프로토콜 많은 약물 및 다른 생물 학적 상황에서 병원 체와 종양에 대 한 다중 약물 시너지 효과 대 한 효율적인 화면에 대 한 허용 하는 상호 작용을 측정 하기 위해 확장 됩니다.

이전에 우리 3 약물 간의 없음을 상호 작용 보고: 레프, NAL와 PNG 두 약물 4 x 4 매트릭스13,14에서 결합 했다 소형된 바둑판 분석 실험에서 테스트에 따라. NAL 레프 상승 했다, 그러나 PNG 레프와 NAL13,14와 대립 될 알려졌다. 여기, 우리 확인이 없음을 상호 작용 대각선 분석 결과 사용 하 여 이러한 세 가지 약물 중에서 3 가지 방식의 상호 작용을 측정 하 고. 우리의 결과 레프 + NAL + PNG 시너지 3 방향 항생제 조합 임을 보여 줍니다. 그림 7 의 오른쪽에 주어진 개별 실험 절차 섹션의 결과 대 한 도식 적인 표현 및 그림 8. 여기, 선물이 고 그림 9에 3 개의 판 읽기에서 대표적인 원시 결과 해석. 상단 플레이트 읽기 직렬 및 선형 희석 실험 단계 2와 3 단계에서 실시에 해당 합니다. 아래 2 개의 격판덮개 독서는 중복 상호 작용 접시 4 단계에서 실시.
그림 9 에서 원시 데이터 표시 최고 성장 0.55, 주위 하지만 미디어 자체의 0.05 광학 밀도 높은 약물 농도의 OD600 에서 관찰 어디에 성장이. 따라서, 우리 정의로 IC50 (0.55-0.05)/2 = 0.25. 각 복용량 응답에 대 한이 값을 가장 가까운 있는 웰 스 오렌지와 함께 표시 됩니다.
그림 9A 의 상반신 직렬 복용량 응답 실험 2 단계에서 결과 보여 줍니다. 레프에 대 한 IC50 웰 스 4 ng/mL에 해당 하는 열 10에서 2 복제입니다. NAL 및 PNG에 대 한 IC50 3 µ g/mL와 25 µ g/mL, 각각 있다. 이러한 농도 그림 7B에 표시 된 1 x 농도에 해당 합니다. 그림 9B 의 아래쪽에서 선형 복용량 응답 실험 3 단계 결과 보여줍니다. 레프, NAL, PNG의 IC50 x, 0.8 x 0.4 그리고 1.2에서 찾을 수 있습니다 x, 각각. 이 농도 4 단계에 대 한 1 X IC50으로 할당 됩니다.
해당 실험은 그림 9B, 어디는 IC50 우물에 표시 된 두 개의 복제 하는 두 접시는 오렌지와 함께 표시 됩니다. 1 접시, 모든 단일 약물 그들의 IC50 1 배 농도에서 있다. 인덱스도 또는 3 가지 방식의 조합에 대 한 예상된 IC50 모든 조합 또한 1 배 농도 대 한 예상된 IC50 만들기 구성 약물의 산술 평균으로 계산 됩니다. 2 접시, 레프 및 PNG 그들의 IC50 1 배 농도에서 하지만 NAL IC50 1.2 x. 각 조합에 대 한 예상된 IC50이 IC50 값의 산술 수단을 사용 하 여 정의 됩니다. 예를 들어 레프 + NAL NAL + PNG에 대 한 예상된 IC50는 1.1 x. 약물 상호 작용 점수 (FIC)를 위한 각 조합 플레이트의 오른쪽에 표시 된 예상된 IC50와 IC50 관찰 나누어 계산 됩니다. 두 접시의 FIC 점수 검사 레프 + NAL 및 레프 + NAL + PNG는 시너지, 레프 + PNG와 NAL + PNG는 대립 하는 방법을 보여 줍니다. FIC 점수 두 접시에는 동의 프로토콜의 신뢰성을 지 원하는입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig1.jpg"> 그림 1: 모델 정의 베 가산 약물 상호 작용 모델에 대 한 Null. 2 5 x 5 매트릭스는 microplate에 마약 A에서와 같이 한 축에 증가 선형, 고 정량 phenotype (오른쪽 상단)을 억제 하는 약물의 최고 농도. 이 행렬의 중간, 어디 equipotent 마약을 연결 하는 선 각 단일 약물의 농도 약 대답으로 동일한 농도에 표시 됩니다. 셀이 "체커 판" 약물 농도 조합에 추가 되,이 라인에 표현 하는 기록된 형 웰 스 연결에 대 한 동등한 것으로 예상 된다. 이 자기-자기 약물 상호 작용 실험에서 표현 형 (녹색 점선으로 표시)을 묘사 하는 isobole 선형, 가산 null 모델 정의 될 예정입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig2.jpg"> 그림 2: 없음을 약물 상호 작용 베 가산 약물 상호 작용 모델. 두 약물은 그림 1과 같이 바둑판 분석 결과에 결합 되, 관찰 된 isophenotypic 컨투어 직선, 볼록 또는 오목 수 있습니다. 오른쪽, 가능한 isophenotypic 등고선 (녹색 파선) 바둑판 분석 실험에 겹쳐 있다. 직선 isophenotypic 컨투어가 있는 약물 조합은로 베-첨가제, 윤곽은 베 첨가물 이다 자기 자기 약물 상호 작용에서 다른 정의 의해. 때 isophenotypic 컨투어 크게 오목 또는 볼록, 결합 시너지 또는 대립, 각각 이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig3.jpg"> 그림 3: 3 방향 약물 상호 작용 베 가산 약물 상호 작용 모델. 없음을 상호 작용에 대 한 바둑판 분석 결과 마찬가지로, 3 약물 각 약품 한 축에 증가 선형 3D 그리드 (는 "checkercube")에서 결합 됩니다. 3 마약 동일 했다, isophenotypic 표면 편평한, 3 약물 조합에 대 한 가산 정의 될 예정입니다. 표면 더 오목 또는 볼록이 베 추가 null 모델 보다는, 약물 조합 있다면 시너지 또는 대립, 각각. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig4.jpg"> 그림 4: 없음을 약물 상호 작용을 측정 하기 위해 대각선 방법. 각 바둑판 분석 결과, 자홍색 사각형에 표시 된 지역에만 측정 됩니다. i 및 ii는 선형 단일 약물 농도 증가 하 고. iii는 두 약물의 1:1 혼합물을 만들고 마치 그것이 하나의 약물이이 혼합물을 선형 titrating에 의해 평가 됩니다. FIC는은 관찰된 IC50 나눈 두 단일 약물의 예상된 IC50 조합입니다. 로 베 가산 모델에 대 한 예상된 IC50 두 단일 약물의 평균 IC50에 의해 직선 근사 줄. FIC 값 베 추가 쌍 1 이며 시너지 또는 대립 쌍, 각각2,12대 1 보다 낮은 이상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig5.jpg"> 그림 5: 3 방향 약 상호 작용을 측정 하기 위해 대각선 방법. 각 checkercube 분석 결과 표시 영역 으로만 측정 됩니다. i, ii 및 iii는 선형 단일 약물 농도 증가 하 고. iv 1 함으로써 측정: 1:1 혼합물의 3 약물과 단일 약물 마치 선형이 혼합물을 titrating. 소수 억제 농도 예상된 IC50 주어진 3 개의 단일 약물으로 나눈 조합에서 관찰된 IC50 과 같습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig6.jpg"> 그림 6: 여기에 설명 된 대각선 방법 프로토콜 및 각 microplate에 대 한 설치 정보에 대 한 워크플로. 하루 4 접시는 중복에 실시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig7.jpg"> 그림 7: 직렬 및 선형 희석 복용량 응답 실험. 한 약물 및 해당 최종 약물 농도 대 한 직렬 희석 복용량 응답 (A) 준비 합니다. 대장균 세포 격판덮개;에 추가 됩니다. 다음 날에 사용의 선형 16 h. 직렬 IC50, 주황색으로 표시 된 각 약물에 대 한 선택 후 성장 기록 희석 복용량 응답 실험. (B) 한 약물 및 해당 최종 약물 농도 희석 선형 복용량 응답의 준비. 대장균 세포 격판덮개;에 추가 됩니다. 성장 후 16 h 기록 됩니다. 각 약물에 대 한 다음 날에 사용 될 것입니다 선택한 IC50s 마약 상호 작용 실험 오렌지에 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig8.jpg"> 그림 8: 약물 상호 작용 실험. 상호 작용 실험의 준비는 단일 유사 약물 선형 복용량 응답를 제외 하 고 1:1 또는 1:2 사용 되는 약물의 1:1 혼합물 또는 3 약물 복용량 응답, 각각. IC50s 오렌지에 묘사 된 하 각 복용량 응답, 관찰 FIC 점수를 계산 하는 데 사용 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57713/57713fig9.jpg"> 그림 9: 대표 실험 결과. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 얻은 대표적인 결과 주요 텍스트에서 제공 하는 세부 정보와 함께 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57713/57713fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

약물의 여러 시너지 효과 측정에 대각선 메서드

이 프로토콜에서 우리가 어떻게 베 가산 기반 약물 상호 작용 측정 쌍 및 3 방향 약물 조합을 설명 합니다.

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.3K 조회수.  Sabanci University. 이 프로토콜에서 우리가 어떻게 베 가산 기반 약물 상호 작용 측정 쌍 및 3 방향 약물 조합을 설명 합니다.

비디오: Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

연구

생물학

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

인슐린 주입 및 성인에서 인슐린 민감도를 측정하는 Hemolymph 추출 Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 CGH)

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

에 미세 소관 역학을 측정하는 plusTipTracker 소프트웨어를 사용<em&gt; 운송에 필요한 정보 미국 교통부</em&gt; 성장 콘

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Using a Thermal Camera to Measure Heat Loss Through Bird Feather Coats

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of thermoregulation in birds across a variety of ecological circumstances. However, few studies characterize the contribution of the feathers alone to thermoregulation. Several previous studies have established methods for measuring the insulation value of animal pelts, but they require destructive sampling methods that are problematic for birds, whose feathers are not distributed evenly across the skin. More information is needed about 1) how the contribution of feathers to thermoregulation varies both across and within species and 2) how feather coats may change over space and time. Reported here is a method for rapidly and directly measuring the thermal performance of feather coats and the skin using dried whole skin specimens, without the need to destroy the skin specimen. This method isolates and measures the thermal gradient across a feather coat in a way that measurements of heat loss and metabolic cost in live birds, which use behavioral and physiological strategies to thermoregulate, cannot. The method employs a thermal camera, which allows the rapid collection of quantitative thermal data to measure heat loss from a stable source through the skin. This protocol can easily be applied to various research questions, is applicable to any avian taxa, and does not require destruction of the skin specimen. Finally, it will further the understanding of the importance of passive thermoregulation in birds by simplifying and accelerating the collection of quantitative data.

This protocol describes the quantification of heat transmission through a flat skinned avian specimen using a thermal camera and hot water bath. The method allows obtaining of quantitative, comparative data about the thermal performance of feather coats across species using dried flat skin specimens.

열 카메라를 사용하여 새 깃털 코트를 통해 열 손실을 측정합니다.

Feathers are essential to insulation, and therefore to the cost of thermoregulation,&#160;in birds. There is robust literature on the energetic cost of ...

약물의 여러 시너지 효과 측정에 대각선 메서드

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

라이트 농도의 변화에 Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

인슐린 주입 및 성인에서 인슐린 민감도를 측정하는 Hemolymph 추출 Drosophila melanogaster

게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 CGH)

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

에 미세 소관 역학을 측정하는 plusTipTracker 소프트웨어를 사용

시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

고해상도 Respirometry 천연 화합물 존재 그대로 베타 세포의 미토 콘 드리 아 기능을 측정 하

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약물의 여러 시너지 효과 측정에 대각선 메서드

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라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

인슐린 주입 및 성인에서 인슐린 민감도를 측정하는 Hemolymph 추출 Drosophila melanogaster

게놈 복사 번호 변종의 탐지를위한 배열 비교 게놈 교잡 (배열 CGH)

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