שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באבחון של מחלות מיאלואידיות כגון תסמונות myelodysplasia או מחלות המטולוגיות אחרות המתפתחות עם חריגות התבגרות בשושלת התאים המיאלואידיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מפחיתה את הסובייקטיביות של החוקר בניתוח ובפרשנות זו. שיטה זו יכולה לספק תובנה שלתוכם הם הפרמטרים המפלים ביותר עבור myelodysplasia.
זה מאפשר לכמת את ההבדלים מאוכלוסיות תאים מיאלואידיות נורמליות. הפגנת ההליך תהיה טיפאני פיקו, פוסט-דוקטורט מהמעבדה שלנו. התחל על ידי ערבוב 600 microliters של מדגם התא הראשי עם 10 מיליליטר של חיץ כביסה בצינור חרוט 15 מיליליטר עבור שני צנטריפוגות ו 10 מיליליטר של חיץ כביסה טרי לכל לשטוף.
לאחר הכביסה השנייה, להשעות מחדש את גלולה ב 400 microlitres של חיץ כביסה טרי, ולהעביר 350 microliters של ההשעיה התא לתוך צינור FACS פוליפרופילן חמישה מיליליטר, המכיל את הלוח כולו של נוגדנים עמוד השדרה. לאחר ערבוב יסודי של התאים, פיפטה שווה כמויות של פתרון הנוגדן התא לתוך שלושה צינורות פוליפרופילן חדשים, ולהביא את הנפח הסופי בכל צינור עד 200 microliters עם מאגר כביסה טרי לפי הצורך. לאחר מכן, מוסיפים את הנפח המתאים של נוגדנים נגד סמני פני התא של עניין עם ערבוב, עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
בסוף הדגירה, מוסיפים שני מיליליטר של תותב lysing עם ערבוב, עבור דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לאסוף את התאים lysed על ידי צנטריפוגה, ולהשליך את כל מלבד האחרון 50 microliters של על טבעי בכל צינור, מבלי להפריע גלולה. להשעות מחדש את כדורי על-טבעי הנותרים, עם ערבוב עדין, ולהוסיף שני מיליליטר של חיץ כביסה טרי לכל מדגם.
לאחר הכביסה השנייה, להשליך את העל טבעי, משאיר כ 50 microliters שאריות נפח בכל צינור, מבלי להפריע גלולה. להשעות מחדש את גלולה ב 200 microliters של PBS עם ערבוב, לניתוח מיידי. כדי לקרוא את הדגימות על ציטומטר זרימה, פתח תחילה ניסוי חדש בתוכנת ציטרומטר הזרימה, ושנה את שם הניסוי לפי השם, סוג המדגם והתאריך.
צור דגימה חדשה לשלושה צינורות, וציין את הנוגדנים המשמשים בכל צינור בפריסת הניסוי. פתח את הגדרות הציטרומטר ובחר הגדרות יישום כדי להחיל את הערכים המתקבלים בהגדרה החודשית. פתח גליון עבודה גלובלי חדש וצור את חלקות הנקודות המתאימות לארגון תאי הסינגלים, כמו גם לאוכלוסיות הגרנולוציטים, המונוציטים, הפיצוץ והלימפוציטים.
צור גליון עבודה כללי חדש עבור פקדי הפיצוי. לאחר מכן, לרכוש 500, 000 אירועים מכל צינור, בקצב רכישה בינוני, ייצוא הנתונים כמו fcs 3.0 קבצים, לאחר האימות הטכני שלהם. לפני שתתחיל ניתוח חדש, הורד את קבצי הציסטה המכילים את נתוני מח העצם הרגילים, עבור שושלת אדומה נויטרופילית, מונוציטית וגרעין, ואת קבצי הניתוח בפורמט inp.
לאחר מכן, שמור את הנתונים בשולחן העבודה. על מנת לשמור את התבגרות נויטרופילים לבסיס הנתונים, תחילה לפתוח את התוכנה Infinicyt ולאחר מכן לפתוח את קובץ ציסטה המתאים נתוני התבגרות נויטרופילים. ציירו את מסלול ההבשלה בגרף ה-APS, והחסכו את מסלול ההבשלה של הנויטרופילים למסד הנתונים.
פתח את קובץ fcs עבור התבגרות שושלת נויטרופילים כי יש לנתח. העלה את קובץ inp התבגרות נויטרופילים מהטבליה פרופילים. הניתוח לשושלת זו מחולק לשלושה שלבים.
התחל עם מבחר של פיצוצים חיוביים, מחויבים נויטרופילים CD34. לשם כך, השתמש בהצטלבות של שבעה שערים, כדי לאפשר בחירה של CD34 חיובי, CD117 חיובי, HLADR נמוך, CD10 שלילי, CD13 חיובי, CD11 b שלילי אירועים. המשך את הניתוח עם הבחירה של CD117 חיובי, CD34 שלילי נויטרופילים מבשרי.
המשך את הניתוח עם הבחירה של תאים נויטרופילים בוגרים יותר. לאחר מכן, הצג את הניתוח של תאי שושלת מונוציטים. צייר את מסלול ההבשלה בגרף ה- APS.
ודא כי החץ המציין את תחושת ההתבגרות מכוון מתאים לא בוגרים, מונוציטיים, CD14 שלילי, IREM2 שלילי, למונוציטים בוגרים, חיובי CD14, IREM2 חיובי. שמור את מסלול ההבשלה עבור שושלת מונוצטית למסד הנתונים. פתח את קובץ fcs עבור התבגרות שושלת מונוציטית שיש לנתח.
העלה את הפרופיל לניתוח שושלת מונוציטית. כדי לזהות את תאי השושלת המונוציטיים, השתמש בהצטלבות של ארבעה שערים המאפשרת בחירה של CD64 חיובי גבוה, CD117 חיובי, CD117 שלילי, אירועים חיוביים HLADR. הקצה אירועים אלה לכרטיסיה המונוציטית בעץ הירארכיית האוכלוסין.
פתח את קובץ הציסטה של NRC שיש לשמור במסד הנתונים של NRC. צייר את מסלול ההבשלה בגרף ה- APS ושמור את מסלול ההבשלה של התאים האדומים הגרעיניים למסד הנתונים. פתח את קובץ fcs שיש לנתח.
העלה מהפרופילים את תבנית הניתוח עבור תאים אדומים בעלי גרעין. הניתוח עבור שושלת זו מחולק לשני שלבים. החל עם הבחירה של CD34 חיובי, אריתרויד מחויב תקיעות.
כאן, השתמש בהצטלבות של שבעה שערים כדי לאפשר בחירה של CD34 חיובי, CD117 חיובי, HLADR נמוך, CD105 חיובי, CD33 שלילי, CD36 חיובי, CD71 אירועים חיוביים. הקצה אירועים אלה בכרטיסיה NRC בהירארכיית האוכלוסיה. הסר את CD34 אריתרואיד חיובי ביצע תקיעות מן הנראות.
כדי לזהות תאים אריתרואידיים בוגרים יותר, השתמש בהצטלבות של ארבעה שערים המאפשרים אפליה של CD45 שלילי ו- CD45 חיובי נמוך, פיזור צדדי נמוך, CD36 חיובי גבוה, ו CD71 חיובי גבוה. לאחר מכן, הסר את ה- CD36 בצד הגבוה פיזור טסיות דם נמוכות מהתאים האדומים הגרעיניים והקצה אוכלוסיה זו ללשונית NRC. כדי להעריך התבגרות מיאלואידית בתא מח העצם, פתח את קובץ הציסטה המתאים לשושלת העניין מהתיק שיש להעריך.
שמור רק את האירועים שהוקצו ללשונית של הנויטרופילים בעץ הירארכיית האוכלוסין גלויים. צייר את מסלול ההבשלה בגרף ה- APS וטען את מסד הנתונים המתאים להבשלתו של הנויטרופילים במח עצם רגיל, והשווה נתונים. אם הנתונים תואמים לפחות באופן חלקי, התוכנה תיצור דיאגרמת הבדלי התבגרות מנורמלת ורצועה של פרמטרים כדי להמחיש את הבדלי ההבשלה.
כדי להשוות את התבגרות המונוציטים בתא מח העצם, עבור מקרה חדש עם נתונים ממח עצם רגיל, כולל במסד הנתונים מונוציטים, פתח את קובץ הציסטה המתאים לשושלת התאים המונוציטית. השאר רק את האירועים שהוקצו לטאב מונוציטים בעץ הירארכיית האוכלוסיות גלויים וצייר את מסלול ההבשלה בגרף APS. טען את מסד הנתונים המתאים התבגרות מונוציטים במח עצם רגיל, ולהשוות נתונים.
כדי להשוות את התבגרות התאים האדומים בגרעין בתא מח העצם, עבור מקרה חדש, עם נתונים ממח העצם הרגיל, הכלולים במסד הנתונים של NRC, פתח את קובץ הציסטה המתאים לשושלת ה- NRC. השאר רק את האירועים שהוקצו בכרטיסיה NRC בעץ הירארכיית האוכלוסין גלויים. ולצייר את מסלול ההבשלה בגרף APS.
טען את מסד הנתונים המתאים להבשלת NRC במח עצם רגיל, והשווה נתונים. לאחר מכן, כדי להמחיש את משמעות ההבדלים בין הקובץ החדש לנתונים הכלולים במסד הנתונים, לחץ על הבדלי התבגרות מנורמלים ושינוי גודל תצוגה. זכור ששיטות שמשתמשות באלגוריתמי הסיווג ההיררכי בניתוח נתונים ציטומטריים של זרימה הן סובייקטיביות ביותר ולא מדויקות מטבען, מכיוון שהן אינן נחשבות לחפיפה בין אוכלוסיית התאים.
ההערכה של מקרים חדשים של ציטופניה, החשודים כ- MDS נגד מסדי הנתונים של התבגרות נורמלית מיאלואידית, מאפשרת זיהוי של אנטיגנים התבגרות מבוטאים באופן חריג של שושלת נויטרופילים, מונוציטים ו- NRC, גם במקרים ללא חריגות ציטולוגיות או ציטוגניות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לרכוש את הנתונים הציטומטריים של הזרימה, באופן סטנדרטי, כדי לבצע הגדרת ציטומטר חודשית, בדיקות יומיות, כדי pipette בקפדנות את הנוגדן לפני השימוש, ולכבד את זמני הכתמים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כמו מצפן כדי להשוות את קבוצת המקרים השונה, ולהענה על שאלות נוספות, כגון מהי ההטבעה הטיפטית הסופית עבור קבוצה מסוימת של מקרים.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך עבור החוקרים המעוניינים לחקור דפוסי התבגרות תאים מיאלואידיים, במקרים של hematopoiesis שיבוט של פוטנציאל בלתי מוגדר לזהות את השינויים הטיפיים הסופיים הקשורים באופן אמין עבור תהליך דיספלסטי. שים לב כי עדכון מסד הנתונים עם מספר גדל של נתונים מתורמים בריאים עשוי לשפר את החוסן של הניתוח.
