המחברים להכיר התוכנית עיקור כלבים UNESP-FCAV מתבקשים לספק את השחלות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים FAPESP (תהליך מס 2013/14293-0), שכמיות.

הניסוי בוצע עם השחלות של ארבעה כלבי תערובת הנשי, שנתרמו לאחר ניתוח אלקטיבי-תוכנית עיקור כלבים. ניסוי זה אושרה על ידי ועדת האתיקה על השימוש בבעלי חיים של UNESP-FCAV (פרוטוקול מס 026991/13).
1. הכנה ניסיוני
<ol><li>להכין או לרכוש 500 מ"ל תמיסת סטרילית של Dulbecco באגירה פוספט (DPBS) ללא סידן או מגנזיום.</li>
	<li>להכין את collagenase אני מדמין פתרון על ידי ערבוב µg 40 של האנזים ב 1 מ"ל של DPBS. סינון באמצעות מסנן מזרק 0.2 µm ואחסן aliquots 2 מ"ל ב-20 ° C.</li>
	<li>להכין את התקשורת התרבות הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM) גלוקוז נמוך עם סרום עוברית 10%, 1% של אנטיביוטיקה.</li>
	<li>לאסוף חומרים עקר: מנות מספריים, מלקחיים, בקבוקון תרביות רקמה, צינורות, פיפטות 10 מ ל ו מ ל.</li>
	<li>השימוש בציוד מעבדה תרבות תא רגיל: בטיחות ביולוגית cabinet (BSC), חממה תרבות תא שוכן בגובה 5% CO2 ו 38 ° C וצנטריפוגה.</li>
	<li>לנקות את BSC: עם ידיים בכפפות, לעקר אותה עם 70% EtOH, באמצעות נורות UV.</li>
</ol>2. בידוד של גזע Mesenchymal מן השחלה
<ol><li>לאחר הניתוח, שמור את השחלות PBS בקרח צינור חרוטי, עד להגעתם במעבדה.</li>
	<li>ממלאים שתי צלחות פטרי 100 מ מ 10 מ"ל ל- PBS.</li>
	<li>להסיר את השחלות מהצינור ולהעביר אותם הפטרי הראשון עם PBS. לשטוף אותם עם ערבוב תנועות.</li>
	<li>בעדינות לאחזר את השחלה ולמקם אותו לתוך תבשיל אחר. עם פינצטה סטרילי, מספריים, מינצ הרקמה לחתיכות קטנות מאוד, בערך בגודל של 1 מ מ בלבד.</li>
	<li>להעביר את רקמת השחלה 35 מ מ פטרי ולהוסיף 2 מ של collagenase. מינצ הרקמה קצת יותר.</li>
	<li>מניחים על צלחת פטרי בחממה ב 38 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ומנערים בעדינות את צלחת פטרי עם תנועות מעגליות בכל 20 דקות.</li>
	<li>לאחר 3 שעות, הסר את הפטרי של החממה.</li>
	<li>העבר את התוכן של המנה צינור 15 מ"ל. הוסף 5 מ של התרחבות המדיה.</li>
	<li>היפוך בעדינות את הצינור לפני צנטריפוגה. Centrifuge הצינור ב g 2100 x במשך 7 דקות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר עם 3 מ"ל של התרחבות המדיה.</li>
	<li>העברה בגדר בקבוק T25. מקם את הבקבוק בתוך החממה עם 5% CO2 ב 38 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. הערה: החלק החשוב ביותר של ההליך היא לשנות את המדיה לאחר 3 שעות של דגירה.</li>
	<li>הסר את הבקבוק של החממה ולהסיר את התקשורת עם הרקמה הנותרת. להוסיף 3 מ"ל של התקשורת הרחבה טריים של הבקבוק.</li>
	<li>שינוי התקשורת כל 48 שעות, להתבונן בקבוק הנהרות הסלולר. הערה: השלבים העיקריים של ההליך יכול להיות שנצפו באיור1.</li>
</ol>3. הרחבה של גזע Mesenchymal מן השחלה
<ol><li>
מעבר תא
	<ol>
<li>כאשר התאים להגיע למפגש, להסיר את המדיה מהבקבוק.</li>
		<li>לשטוף את הבקבוק עם 3 מ"ל של PBS. הסר את PBS.</li>
		<li>להוסיף 1.5 מ של טריפסין ולשים הבקבוק בחממה ב 38 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות טפח בעדינות את הבקבוק כדי לסייע התאים כדי לנתק. הערה: תאים צריך להגיע למפגש כ 5 - 7 d לאחר ציפוי הראשונית.</li>
		<li>להוסיף 3 מ"ל של הרחבת מדיה ולהעביר את התוכן צינור חרוטי.</li>
		<li>Centrifuge הצינור ב x 2100 גרם במשך 7 דקות להסיר את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של התרחבות המדיה.</li>
		<li>Homogenize בעדינות את התוכן של הצינור.</li>
		<li>קח את aliquot של µL 10 המדגם לבצע תא ספירת להחזיר את הצינור עם תאי החממה.</li>
		<li>מקום 10 µL של המיקס לתוך hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ספירת התאים
	<ol>
<li>להשתמש המטרה X 10 של המיקרוסקופ ולהתמקד קווי הרשת hemocytometer.</li>
		<li>לספור את התאים ב- 5 ריבועים קטנים (איור 2).</li>
		<li>הכפילו את המספר שנספרו ב- 50,000 כדי להעריך את מספר תאים למיליליטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הבידול של גזע Mesenchymal מן השחלה
הערה: מבחני בידול בוצעו על פי הנחיות נוסדה בשנת היל. et al. 9.
<ol><li>זרע 1.0 x 104 תאים לכל טוב, שהפקידים, שימוש לצלחת תרבות 4-. טוב.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של התרחבות המדיה.</li>
	<li>בעדינות להתסיס את המנה עם תנועות מעגליות.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, להחליף את המדיה תרבות התקשורת בידול רצוי.</li>
	<li>עבור osteogenic, adipogenic, chondrogenic בידול, דגירה התאים עם התקשורת אינדוקציה עבור 30 d, עם החלפת מדיה בכל ערכות התמיינות ספציפיים ד 3 שימשו עבור כל אחד מבחני אלה.</li>
	<li>על שושלת היוחסין neurogenic בידול, דגירה את התאים עבור 10 d בתקשורת אינדוקציה, עם החלפת מדיה בכל בתלת-ממד. התקשורת המשמש כאן הכילה DMEM גלוקוז נמוך, חומצה ולפרואית 2 מ מ, הידרוקורטיזון 1 מיקרומטר, 10 מיקרומטר forskolin, 5 מ מ אשלגן כלורי, 5 אינסולין µg/mL ומיקרומטר 200 butylated hydroxyanisole.</li>
	<li>עבור מבשרי האנדודרם, תקופת דגירה של 5 d בתקשורת האנדודרם לפי הוראות היצרן מגיב.</li>
	<li>עבור תא הנבט הקדמוני שושלת היוחסין בידול, דגירה התאים בתקשורת אינדוקציה עבור 14d, עם החלפת מדיה בכל בתלת-ממד. התקשורת המשמש כאן הכילה DMEM, 10% FBS, 1 מ מ נתרן פירובט, 10 ננוגרם למ"ל LIF, חומצות אמינו שאינן חיוניות 1 מ"מ, 2 מ מגלוטמין, 5 אינסולין µg/mL, 0.1 מ מ β-mercaptoethanol, putrescine מיקרומטר 60, transferrin µg/mL 20, 10 ננוגרם למ"ל העכבר גורם הגדילה באפידרמיס, 1 ng/mL אנושי בסיסי פיברובלסט גורם גידול, האדם ng/mL 40 גליה התא neurotrophic קו-derived factor פניצילין 15 מ ג/ליטר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D., Atala, A., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells.">Mesenchymal stem cells.</a> Handbook of Stem Cells (2nd Edition). , 513-527 (2013).</li><li>Zipori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+stem+cells:+state+rather+than+entity.">The nature of stem cells: state rather than entity.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).</li><li>Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+surface+epithelium:+biology,+endocrinology,+and+pathology.">Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology.</a> Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).</li><li>Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+interconversions+in+normal+ovarian+surface+epithelium+and+ovarian+carcinomas:+an+exception+to+the+norm.">Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).</li><li>Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+cultures+derived+from+adult+human+ovaries.">Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17 (2005).</li><li>Gong, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-like+cells+established+by+culture+of+adult+ovarian+cells+in+mice.">Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice.</a> Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).</li><li>Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cells+and+follicular+renewal+in+the+postnatal+mammalian+ovary.">Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary.</a> Nature. 428 (6979), 145 (2004).</li><li>Deans, R. J., Moseley, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+clinical+uses.">Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses.</a> Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).</li><li>Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal-like+stem+cells+in+canine+ovary+show+high+differentiation+potential.">Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential.</a> Cell Proliferation. 50 (6), 12391 (2017).</li><li>Dominici, M. L. B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).</li><li>Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+transplants+of+bone+marrow+cells.">Osteogenesis in transplants of bone marrow cells.</a> Development. 16 (3), 381-390 (1966).</li><li>Kuznetsov, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-colony+derived+strains+of+human+marrow+stromal+fibroblasts+form+bone+after+transplantation+in+vivo.">Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בזאת אנו מספקים ראיות כי MSCs ניתן לבודד מרקמות השחלה הכלביים, אשר נחשב פסולת ביולוגית לאחר ovariectomy. בשל העובדה כי ניתן למצוא סוגי תאים רבים בשחלה, הצענו פרוטוקול לבחירת MSCs בהתבסס על שדבקו מהירה פלסטיק, אשר בהצלחה נבחרים תאים שגדל טפט עם מורפולוגיה פיברובלסט דמוי.
הדוח הראשון ש?...

מספר מחקרים שפורסמו להתמקד בתאי גזע גדל באופן משמעותי בעשר השנים האחרונות, מאמץ המחקר כי הושגה על ידי המטרה הקולקטיבית של גילוי טיפולי רפואה רגנרטיבית עוצמה. תאי גזע יש שני סמנים המעצב הראשי: העצמי - שיפוץ ובידול. גזע mesenchymal אחראי על תחלופת רקמת רגיל, יש קיבולת מוגבלת יותר של בידול בהשוואה בתאי גזע עובריים1. לאחרונה, מחקרים רבים הראו מגוון רחב של הבידול של MSCs, נושא בדיון אם קיימים הבדלים בין תאי גזע עובריים והוא בוגר כל2.
Ovarium פני האפיתל היא uncommitted שכבה של תאים, יחסית פחות הבדיל, אשר מבטאת שני סמנים אפיתל, mesenchymal3, שמירה על היכולת להבדיל בין סוגים שונים של תאים בתגובה אותות סביבתיים4. המיקום המדויק של תאי גזע בשחלה אינה ידועה; עם זאת, שהוא הוצע כי אבות bipotential, albuginea tunica להצמיח בתאי הנבט5. מחקרים אימונולוגי יש שיערו כי תאים אלה יש מקור סטרומה6 או ממוקם או מקורב ביותר השחלה משטח7. מאז בתאי גזע mesenchymal אקספרס קולטנים רבים יש תפקיד חשוב ב תא אדהזיה8, תוכנן ניסוי כדי לבדוק את ההשערה כי בחירת אוכלוסיה של תאים עם הדבקה מהירה לבודד אוכלוסיה של תאים בבירור characterizable כמו mesenchymal בטבע. לאחרונה, הקבוצה שלנו דיווחו על ההטיה של MSCs מרקמות השחלה בהתבסס על הקיבולת של הדבקה על משטח הפלסטיק של המנה תרבות ב ה 3 הראשון של תרבות, על מנת לקבל אוכלוסייה מטוהרים של תאים מפגין הדבקה מהירה9. כאן נתאר שיטת שפותחו עבור בידוד תאי גזע mesenchymal של רקמת השחלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="666">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">DPBS&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">14190144</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Tissue flask</td>
			<td style="width:151px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">CLS3056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">12484-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">StemPro Adipogenesis Differentiation Kit</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">A1007001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">A1007101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">StemPro Osteogenesis Differentiation Kit</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">A1007201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">STEMdiff Definitive Endoderm Kit</td>
			<td style="width:151px;">StemCell</td>
			<td style="width:123px;">5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:151px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD45</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 2035S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD34</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 2411GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD90</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 1036G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">CD44</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">MCA 1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Nestin</td>
			<td style="width:151px;">Milipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">&#946;-Tubulin&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Milipore</td>
			<td style="width:123px;">MAB1637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">DDX4</td>
			<td style="width:151px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">PA5 -23378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">IgG- FITC</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">STAR80F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">IgG- FITC</td>
			<td style="width:151px;">AbD Serotec</td>
			<td style="width:123px;">STAR120F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation and differentiation of canine ovarian mesenchymal stem cells

עניין גזע mesenchymal (MSCs) גדל בעשור האחרון בשל הקלות שלהם של בידוד, הרחבת והתרבות. לאחרונה, מחקרים הוכיחו יכולת התמיינות רחב שקיימים תאים אלה. השחלה מייצג מועמד מבטיח טיפולים מבוססי תאים בשל העובדה כי הוא עשיר ב MSCs וכי לעתים קרובות נמחקים לאחר ניתוחים ovariectomy כפסולת ביולוגית. מאמר זה מתאר נהלי הבידוד, הרחבה, ואת הבידול של MSCs נגזר מן השחלה הכלביים, ללא הצורך של מיון תא טכניקות. פרוטוקול זה מייצג כלי חשוב עבור רפואה רגנרטיבית בשל תחולתה רחבה של תאים אלה מאוד דיפרנציאבילית בניסויים קליניים, משתמש טיפולית.

בידוד תאי גזע mesenchymal מן השחלה הכלבים:
ההליך בידוד MSC השחלות מסוכם באיור1. לאחר הניתוח, רקמות הא, collagenase עיכול, שינוי מדיה 3 שעות לאחר תחילת התרבות, אוכלוסיה MSC בשם עם מאפיינים פלסטיק-דבק מהיר הופרדה בהצלחה מר...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells at JoVE.com

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

במסמך זה, אנו מתארים שיטה עבור בידוד, הרחבה, הבידול של גזע mesenchymal מרקמות השחלה הכלביים.

גזירת ובידול של הכלבים השחלות בתאי גזע Mesenchymal

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד, להרחיב ולהבדיל גבעולים mesenchymal מוכר נגזר רקמת השחלות כלבים. ניסוי זה בוצע עם השחלות של ארבעה כלבים נקבה בן כלאיים שנתרמו לאחר ניתוח אלקטיבי בתוכנית עיקור כלבים. ניסוי זה אושר על ידי ועדת האתיקה על השימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סאו פאולו, FVAC.תוצאות מייצגות. דיון.מסקנה.

derivation-differentiation-canine-ovarian-mesenchymal-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.6K Views.  São Paulo State University (UNESP). המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד, להרחיב ולהבדיל גבעולים mesenchymal מוכר נגזר רקמת השחלות כלבים. ניסוי זה בוצע עם השחלות של ארבעה כלבים נקבה בן כלאיים שנתרמו לאחר ניתוח אלקטיבי בתוכנית עיקור כלבים. ניסוי זה אושר על ידי ועדת האתיקה על השימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סאו פאולו, FVA...

Video: Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

גזירה של שריר לב נקי במיוחד מתאי גזע האנושי המושרה pluripotent באמצעות בידול מאופנן מולקולה קטן ולאחר גלוקוז רעב

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...