We thank Dr. Leonid Gnatovskiy for his carefully and critical reading of the paper. This work was supported in part by grants from the National Institutes of Health (HL109054) and the Samuel and Jean Frankel Cardiovascular Center, University of Michigan (Inaugural Fund) to WZ and from the Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine to BL.

1. גזירת העכבר עוברי המחירים לקליק מעכבר ESCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שכבת מזין fibroblasts העוברי (MEFs) עכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום חם MEF (10% FBS בDMEM) עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחות מצופים ג&#39;לטין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של 0.1% ג&#39;לטין במים לתוך באר של צלחת 6-היטב או 5 מיליליטר לתוך צלחת 10 סנטימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר צלחות או מנות ב 37 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת חדר למשך לפחות 30 דקות. לשאוף את הג&#39;לטין לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה מוקרן MEFs במהירות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים בעדינות צינור חרוטי 15 מיליליטר או 50 מיליליטר. הוסף 5 מיליליטר של מדיום MEF מחומם מראש. לערבל את התאים לאט וצנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים בינוני MEF ולספור תאי קיימא. השתמש בכרכים הבאים של מדיום MEF: 2 מיליליטר לכל תאים היטב מצלחת 6 היטב ו- 10 מיליליטר לתאים מצלחת 10 סנטימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צלחת לתוך 6-גם צלחות או 10 מנות סנטימטר ב 1-2x 10 6 לכל צלחת / מנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות / מנות MEF על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 שעות לפחות 24 לפני שימוש. הערה: מחק צלחות / מנות MEF מבוגרות יותר משבוע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ESCs עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP עכבר ESCs על MEFs עד מחוברות 90%. מדיום סלולארי השימוש ES מורכב של 410 מיליליטר DMEM, 75 מיליליטר FBS, 0.1 מ&quot;מ MEM NEAA, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 0.1 מ&quot;מ פירובט, 100 U פן / סטרפטוקוקוס, ו0.1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 6-גם צלחות מצופים ג&#39;לטין, כמתואר ב1.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב מצלחות ולשטוף תאים עם DPBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב DPBS ולהוסיף 0.4 מיליליטר 0.25% טריפסין לתוך אחד היטב צלחת 6-היטב. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. הוסף 1 מיליליטר בינוני ES מחומם מראש להפסקת תגובת טריפסין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים ותאי צנטריפוגות ב 200 XG בינוני ולשאוב. תאי Resuspend ב 1 מיליליטר מדיום סלולארי ES ולספור את התאים. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ESCs צלחת על צלחות מצופים ג&#39;לטין בצפיפות של 3 x 10 4/2 סנטימטר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 על 2 ימים שבם ESCs להגיע מחוברות כ -90%. לשנות את המדיום היומיומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ESCs הם 90% ומחוברות, חזור על פעולות 1.2.2-1.2.5 להסיר את מתקני האכלת MEF לחלוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לקליק בידול על ידי היווצרות EB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום בידול אחריו כמו: 36 מיליליטר IMDM, 12 מיליליטר F12 של בשר חזיר, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 0.34 מיליליטר BSA (7.5%), 0.25 מיליליטר N2, 0.5 B27 מיליליטר, AA / מיליליטר 50 מיקרוגרם, ו0.45 מ&quot;מ 1-thioglycerol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב מהתאים ולשטוף עם DPBS. לשאוב DPBS ולהוסיף 0.4 מיליליטר 0.25% טריפסין לתוך אחד היטב צלחת 6-היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר בינוני בידול להפסיק את התגובה ופיפטה ומטה כדי לפזר אשכולות תאים לתאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ESCs ב XG 200 במשך 5 דקות וזורקים את המדיום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 1 x 10 6 &lt;/ Sup&gt; ESCs במדיום בידול 1 מיליליטר. ספירת התאים, ותרבות התאים בצלחת פטרי ניתוק הנמוך בריכוז של 1 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום בידול על 37 מעלות צלזיוס במשך צבירת EB ראשונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לאחר היווצרות EB, להעביר EBS ממנות ל -50 מיליליטר צינורות. ספין ב XG 200 דקות 1. הסר בינוני ולשטוף EBS עם 10 מיליליטר DPBS בלי Ca 2 + ו Mg 2 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב DPBS ולהוסיף 1 מיליליטר 0.25% טריפסין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. להוסיף 4.5 מיליליטר בינוני בידול כדי לעצור את התגובה. Pipet למעלה ולמטה כדי לנתק EBS לתוך תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. תאים בינוניים וresuspend לשאוב במדיום בידול 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים, ולדלל 2 x 10 6 תאים ל -1 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום בידול. להוסיף VEGF, BMP4 וActivin למדיום בריכוז סופי של 5 ng / ml / מיליליטר, 0.8 ng, ו5 ng / ml, בהתאמה. Cultuמחדש את התאים בצלחת פטרי להיווצרות EB שנייה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 40 שעות לאחר היווצרות EB שנייה, להעביר EBS 50 מיליליטר צינורות. לשטוף עם DPBS פעם, לנתק את EBS עם 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. Pipet למעלה ולמטה כדי לנתק EBS לתוך תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי Stempro-34 בינוניים עם 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml bFGF ו -12.5 FGF10 ng / ml. צלחת התאים ב2 x 10 5/2 סנטימטר בצלחות מצופה ג&#39;לטין. תרבות בחממת 37 ° C במשך כ 32 שעות לפני הבידוד לקליק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד mCPCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני ולשטוף עם DPBS. הוסף 0.5 מיליליטר 0.25% טריפסין לצלחות תרבות על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. להוסיף 4.5 מיליליטר בינוני בידול כדי לעצור את התגובה. Pipet למעלה ולמטה כדי לנתק EBS לתוך תאים בודדים. לאסוף את התאים על ידי תאי צנטריפוגה וגלולים ב2% FBS / PBS לFACS-טיהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ESCs מובחן על סדרן כביקורת השלילית. מתח שינוי כדי להתאים גללים קדימהter (FSC) והצד פיזור (SSC) כדי לבחור אוכלוסייה רצויה. השתמש קדימה לפזר לעומת פיזור צד וגובה פיזור קדימה לעומת רוחב להוציא פסולת וכפיל. בתת-האוכלוסייה שנבחרה, על פי ההתפלגות של בקרות ESC, לצייר שער של YFP חיובי על היסטוגרמה לחסל autofluorescence תא. לאסוף YFP + עלות לכל קליק מYFP + gating. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט המחירים לקליק המטוהר (תאי YFP +) ב6-גם צלחות עם מדיום בידול (1.3.1). תרבות 3-5 ימים נוספים על 37 מעלות צלזיוס במשך בידול של העלויות לקליק לשריר לב וSMCs. </li></ol></li></ol> 2. גזירה של האדם עוברי מחירים לקליק מESCs האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן האכלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שכבת מזין fibroblasts העוברי (MEFs) עכבר כפי שתואר לעיל בצפיפות של 2 x 10 4/2 סנטימטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על ESCs אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור ISL1 האנושי: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP או RFP ESCs באופן שגרתי על MEF באמצעות מדיום hESC רגיל (Knockout DMEM / F-12 385 מיליליטר, 100 מיליליטר SR Knockout, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 0.1 מ&quot;מ NEAA, 0.1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol, 10 ng / FGF הבסיסי מיליליטר). לפני בידול לב, להעביר ESCs אדם במצב חופשי מזין לפחות 2 קטעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ESCs אדם במצב חופשי מזין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחות מצופים לתרבות ESCs אדם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר matrigel על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. שים שפופרת 50 מיליליטר על קרח ולהוסיף 30 מיליליטר בינוני / F12 DMEM קר לתוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף matrigel 1 מיליליטר לתוך המדיום הקר ומערבבים היטב. הוסף 1 מיליליטר matrigel-DMEM הקר / 12 בינוני לתוך באר של צלחת 6-היטב או 5 מיליליטר לתוך צלחת 10 סנטימטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר צלחות / טמפרטורת מנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או בחדר לשעה 2. בינוני לשאוב לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול ESCs אדם לצלחות: תקשורת לשאוב מצלחת MEF ולשטוף ESCs אדם עם DPBS. לאחר מכן להוסיף dispase 1 מיליליטר (1 מ&quot;ג / מיליליטר) לבאר של צלחת 6-היטב. דגירה תאים ב -37 ° Cחממה עד קצוות של מושבות להתחיל לנתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון dispase. לשטוף עם DPBS פעמיים, ולאחר מכן להוסיף 2.5 מיליליטר / לכל מדיום גם mTeSR או בינוני מזגן MEF לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד תאים באמצעות מגרד תא ובזהירות pipet למעלה ולמטה כדי לשבור מושבות ESC אנושיות לגושים קטנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את גושי ESC ולדלל 1: 3 לצלחות מצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר / גם בינוני mTeSR או בינוני מזגן MEF ולשנות בינוני יומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ESCs אדם תרבות במדיום mTeSR או בינוני מזגן MEF על צלחות מצופים לפחות 2 קטעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות התמיינות CPC מESCs האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים ומחוברות ~ 90%, לשאוב את המדיום ולשטוף עם DPBS. אז דגירה hESCs ב 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר Dispase על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את hESCs עם DPBS פעמיים, להסיר תאים מצלחות עם מרים תא, אז resuspend מהדק תא במדיום בידול (DMEM / F12 המכיל 18% FBS, 0.1 מ&quot;מ NEAA, 2 מ&quot;מL-גלוטמין, 0.1 מ&quot;מ β-mercaptoethanol ו -50 מיקרוגרם / מיליליטר אסקורבית חומצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התאים לתוך צלחות מצורפים נמוכות במיוחד 6-גם להיווצרות EB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית בידול למחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני כל 3 ימים ולשמור על EBS בתרבות השעיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד HCPCS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף EBS לא יאוחר מהיום 9 של בידול לבידוד CPC אנושי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני ולשטוף EBS עם DPBS פעמיים. הוסף 0.5 מיליליטר 0.25% טריפסין היטב בכל תרבות צלחות 6-גם על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח שווה של מדיום בידול כדי לעצור את התגובה. Pipet למעלה ולמטה כדי לנתק EBS לתוך תאים בודדים. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות ותאי resuspend ב 2% FBS / DPBS. תאי סינון עם מסננת 40 מיקרומטר תא וטהר-FACS RFP + תאי CPC, כמתואר ב1.4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מסודרים HCPCS על צלחות מצופים geltin. HCPCS תרבות במדיום בידול ל7ימים -9 להתמיין לתאי שריר החלק וcardiomyocyte. 7 ימים לאחר הציפוי, תרבות מובחנת תאים עם 5% SR Knockout במדיום / F12 DMEM. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration.">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).</li><li>Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based+therapy+and+lessons+from+the+heart.">Stem-cell-based therapy and lessons from the heart.</a> Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).</li><li>Bondue, A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesp1:+a+key+regulator+of+cardiovascular+lineage+commitment.">Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment.</a> Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).</li><li>Bondue, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesp1+acts+as+a+master+regulator+of+multipotent+cardiovascular+progenitor+specification.">Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).</li><li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages.">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li><li>Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWI/SNF+protein+component+BAF250a+regulates+cardiac+progenitor+cell+differentiation+by+modulating+chromatin+accessibility+during+second+heart+field+development.">SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).</li><li>Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWI/SNF+in+cardiac+progenitor+cell+differentiation.">SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).</li><li>Wu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+a+bipotential+myocardial+and+smooth+muscle+cell+precursor+in+the+mammalian+heart.">Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart.</a> Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).</li><li>Spater, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+HCN4++cardiomyogenic+progenitor+derived+from+the+first+heart+field+and+human+pluripotent+stem+cells.">A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).</li><li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+ventricle,+outflow+tract,+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary/anterior+heart+field.">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).</li><li>Boheler, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+cardiomyocytes.">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li><li>Wada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+human+cardiomyocyte-like+cells+from+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).</li><li>Wamstad, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage.">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151 (1), 206-220 (2012).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs.">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. S., Barbas, T. A. L. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Joung, J. K., Sander, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALENs:+a+widely+applicable+technology+for+targeted+genome+editing.">TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PloS One. 6 (4), e18293 (2011).</li><li>Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+development+of+hematopoietic+and+cardiac+mesoderm+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).</li><li>Xu, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+medium+supporting+cardiomyocyte+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells.</a> Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).</li><li>Bizy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+light+chain+2-based+selection+of+human+iPSC-derived+early+ventricular+cardiac+myocytes.">Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes.</a> Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability ...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/52047/derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells">Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells</a>.
The following author is now listed as a co-corresponding author:
Lei Bu

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

מחלת לב נשארת הגורם המוביל בעולם כיום ושיעורי התמותה נותרו כמעט ללא שינוי בשני העשורים האחרונים (American Heart Association). יש צורך קריטי בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות למניעה או להפוך אי ספיקת לב בצורה יעילה. אסטרטגיה מבטיחה אחת היא טיפול המבוסס על תאים בעקבות ההתפתחות המהירה של תאי גזע ביולוגיה 1. בהקשר זה, עלות לכל קליק multipotent יכול להיות מקור מצוין לתא הטיפול בשל היכולת שלהם להתרבות, אך מחויב רק לבידול שושלת לב. לכן, שיטה יעילה וחזקה כדי ליצור ולבודד עלויות לקליק הוא בעלת חשיבות רבה ללימודי טיפול בתאי לב. פרוטוקול זה מתמקד בעלויות לקליק העוברית זוהו במהלך עובר ואיך הדור שלהם מESCs המוקדמים. עלות לכל קליק שונים היה מבודד מלב עוברי ובוגר, אפילו מעצם קישואים 2. במהלך התפתחות עובר, morphoge העצםחלבונים מגנטיים (BMPs), חברי כנפיים-סוג משפחת אתר האינטגרציה MMTV (Wnts) ואותות קטרים ​​לגרום המחויבות של Mesp1 + mesoderm multipotent 3. Mesp1 + תאים אז להתמיין המחירים לקליק העובריים 4. עלות לכל קליק אלה מסומנים בדרך כלל על ידי HCN4, homeobox NK2 5 (Nkx2-5), homeobox Isl LIM 1 (Isl1), T-תיבה 5 (Tbx5), ו2C הגורם משפר myocyte (Mef2c), יוצרים שדות לב ראשוניים והשני, ו לתרום לחלקים הגדולים של לב במהלך cardiogenesis 5-10. עלות לכל קליק שני Nkx2-5 + וIsl1 + / Mef2c + מסוגל להתמיין cardiomyocytes, תאי שריר חלק (SMCs), ותאי האנדותל 5-8. כך העלויות לקליק אלה יהיו להצמיח כלי דם של הלב, כמו גם רקמות לב והם מקור תא אידיאלי לטיפול מבוסס תאי לב. כתוצאה מכך, יצירת מחירים לקליק במבחנה הייתה מוקד מחקר עיקרי במחקרי לב וכלי דם. מאז יש לי ESCs יכולת הרחבה בלתי מוגבלתnd מייצג את תאי ICM בשלב הבלסטוציסט, בידול של ESCs לעלויות לקליק העוברית הבאים העובר הטבעי נחשב גישה הגיונית ויעילה להשגת המחירים לקליק. אחד גישה מיושמת באופן נרחב כדי להשיג מחירים לקליק מESCs היא כדי לצבור ESCs ל -11 EBS. כדי לשפר את יעילות הבידול, גורמים כימיים וצמיחה מוגדרות המבוססים על הידע של התפתחות לב היו בשימוש 12-14. עם זאת, אין סמנים מובהקים לקליק, במיוחד לא סמנים על פני קרום תא, המקובלים בתחום. כדי לטפל בבעיה זו, ESCs מתוכננים לציון Isl1 + או Mef2c מחירים לקליק + ונגזרים שלהם עם כתבי ניאון באמצעות מערכת / loxP Cre. Recombinase cre הוא דפק בתחת שליטתו של יזם / משפר Isl1 / Mef2c. RFP השתנה ניאון חלבון או גן YFP מונע על ידי אמרגן מכונן יכול להיות מופעל על ידי כריתה של קודון עצירת flox עם recombinase cre(ISL1: cre; pCAG-flox-STOP-flox-GFP או RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / Mef2c-cre; Rosa26YFP) 5,6. ברגע שESCs נבדל לעלויות לקליק שדה הלב השניה, cre מונע אמרגן / משפר Isl1 / Mef2c יפעיל את כתבי ניאון ויכולים להיות מועשר מחירים לקליק על ידי FACS לטיהור. בקצרה, שיטת צבירת EB משמשת ליצירת בידול ESC. כדי לשפר את יעילות בידול, מטופלים התאים המובחנים עם חומצה אסקורבית (AA) וגורמי גדילה כגון BMP4, Activin וVEGF 13,15. פרוטוקול זה מאפשר בידול חזק ויעיל CPC באמצעות עכבר והן ESCs אדם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="415">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Name</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:131px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Thermo scentific</td>
			<td>SH30070.03E</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knockout SR</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">10828028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Knockout DMEM</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">10829018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">11965118</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">11140050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">35050061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">17502048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">12587010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">11765062</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMDM</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">12440061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvate</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">11360070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">17105041</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stempro-34</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">10639011</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">11330032</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA&#160;</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">15260037</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin&#160;</td>
			<td>Life technology</td>
			<td align="right">25200056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ascobic Acid&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1753</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VEGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>293-VE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bmp4</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>314-BP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ActivinA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>338-AC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bFgf</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>233-FB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fgf10</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>345-FG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mTeSR</td>
			<td>Stemcell technologies</td>
			<td align="right">5850</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">354277</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of cardiac progenitor cells from embryonic stem cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

הפרוטוקול מראה גזירה של המחירים לקליק מכמה שורות תאי גזע עובריים. ESCs יקובץ ליצירת EBS להתמיין לעלויות לקליק. ESCs נשמרים באופן שגרתי על מתקני האכלת MEF (איור 1 א, ו) ומזינים להסיר לפני ההתמיינות. על הצבירה של ESCs לEBS במדיום בידול (איור 1 ב, ז), מטופלים EBS יצר הש?...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

גזירה של תאי לב ותאים מתאי גזע עובריים

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

derivation-of-cardiac-progenitor-cells-from-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K Views.  University of Michigan. In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Video: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

גזירת ובידול של הכלבים השחלות בתאי גזע Mesenchymal

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...