This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director&#8217;s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

הערה: מידע ספק לכל חומרים כימיים המשמשים בפרוטוקול זה כבר מופיע בטבלה 1 ו רשימת חומרים. כל הפתרונות והציוד הבאים במגע עם תאים חייבים להיות סטרילי, ויש להשתמש בי טכניקת ספטית בהתאם. לבצע את כל incubations התרבות בC ° 37 humidified, 5% CO 2 באינקובטור, אלא אם כן צוין אחרת. בפרוטוקול זה, כל הבידול מבוצע ב6-גם צלחות, שבי hiPSCs הם זורעים. בעקבות בידול וטיהור, יכולים להיות מנותקים תאים וreplated לשימוש במורד הזרם. 1. הכנה בינונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבינוני E8, להפוך את פתרון מניות עבור כל רכיב בינוני (NaHCO 3, חומצה אסקורבית L-2-פוספט, סלניט נתרן, transferrin, אינסולין, FGF2, TGFB1) ולאחסן את הפתרונות ב -20 ° C. הוספת הכמות מתאימה של פתרונות מניות לבקבוק DMEM / F12 ולסנן לעקר. Concentr הפתרוןניתן למצוא ation והתקנת תגובה לרכיבי המניות והבינוניים E8 בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון החוץ-התאי, להפשיר את מטריצת קרום במרתף (מסופקת בדרך כלל על 10 מ&quot;ג / מיליליטר) בשעה 4 ° CO / N. Matrigel משמש בדרך כלל לתרבות תאי גזע pluripotent כי תאי גזע pluripotent אדם יכולים לדבוק גם לחומר זה באמצעות integrin אלפא-6-beta-1 9. ברגע שהפשיר, לעשות aliquots 2.25 מ&quot;ג (250 μl) על קרח באמצעות טיפים pipet הקר כקרח וצינורות ולאחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר precoating צלחות עם ECMS, להפשיר וaliquot הפתרון תאי המטריצה ​​(ECMS) על קרח. מערבבים את ECMS ובינוני DMEM / F12 קר כקרח על יחס של 1: 200 על קרח. לשמור על קור רוח כדי למנוע התמצקות ECMS מוקדמת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין, להוסיף 10 מיליליטר של B27 מינוס אינסולין לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לRPMI / B27 (עם אינסולין) בינוני, להוסיף 10 מיליליטר של תוסף B27 (עם insulin) ו -5 מיליליטר של אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדיום גלוקוז הנמוך, להוסיף 10 מיליליטר של תוסף B27 ו -5 מיליליטר של אנטיביוטיקה פן-סטרפטוקוקוס לתוך 500 מיליליטר של תקשורת RPMI נטול גלוקוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבינוני / הקפאת ההקפאה, לערבב בסרום שור עוברי יחד עם dimethylsulfoxide (DMSO) בשעה 9: 1. מדיום ההקפאה ניתן לאחסן עד חודש 1 על 4 מעלות צלזיוס. הערה: יש לסנן כל כלי התקשורת ומאוחסן ב 4 ° C ושימוש בתוך 2 שבועות, אלא אם כן צוין אחרת. כל הכרכים מגיב / פתרון משמשים להלן מיועדים לבודד היטב בצלחת 6-היטב, אלא אם צוינו אחרת. </li></ol> 2. טרום ציפוי צלחות 6-גם עם ECMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ECMS ידי ערבוב מטריצת מרתף קרום (למשל, Matrigel) עם תקשורת DMEM / F12 קר כקרח על יחס של 1: 200, ולאחר מכן להחיל 2 מיליליטר של ECMS הטרי היטב כל אחד לצלחת 6-היטב. כל טוב בצלחת 6-גם יקבל כ 90 מ&quot;ג ECMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ECMS מצופה צלחות עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. מייד לפני תאי ציפוי, לשאוב DMEM פתרון F12 / מכל טוב. אז הצלחות תהיה מוכנות לקבל תאים. </li></ol> 3. ההפשרה hiPSCs קפוא הערה: באופן קרוב בצע הליך זה כפי שהוא עשוי להוביל לculturing האופטימלי ובידול במורד הזרם של hiPSCs לhiPSC-CMS הבא מחזור ההקפאה / הפשרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון אחד של hiPSCs לכל טוב של 6-גם צלחת. הכן צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 9 מיליליטר של מדיום E8 קר עם מעכבי ROCK (10 מיקרומטר) לכל בקבוקון. מעכב ROCK משפר הישרדות hiPSCs הבאה הקפאה 10. שמור את הצלוחיות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס להפשיר את התאים עד קרח קוטר גביש כ 5 מ&quot;מ שנשאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרסיס החיצוני של צלוחיות עם 70% אתנול. נגב את הצלוחיות עם נייר טישו לפני שעברת אותם למכסה המנוע למינרית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים לתוך צינור חרוטי מוכן. יש לשטוף tהוא בקבוקון פעם אחת עם 500 μl של מדיום E8 ולהעביר את המדיום המכיל את התאים המופשרים לאותו צינור חרוטי. צנטריפוגה ב RT למשך 4 דקות ב 200 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לאחר צנטריפוגה ועדינות resuspend התא גלולה עם 2 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK (10 מיקרומטר). להעביר את תאי resuspended לאחד היטב צלחת 6-היטב מראש מצופה עם ECMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום עם מדיום E8 ללא מעכבי ROCK לאחר 24 שעות של culturing. תאים צריכים דבקו בזמן הזה. </li></ol> 4. Passaging של hiPSCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, hiPSCs מעבר לאחר שהגיע 75% confluency -80% בצלחת 6-היטב. לשאוב את מדיום התרבות. מהירות לשטוף בארות עם 1 מיליליטר של סטרילית, RT PBS. לשאוב PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 0.5 mM EDTA או פתרון ניתוק תא 1x (לדוגמא, Accutase) ודגירה של 1-7 דקות ב RT. הזמן מתאים לדגירת EDTA משתנה עם קו hiPSC. מצפה לראות o מסתלסל גלויהעיבוי r של מושבות בקצוות, כמו זה מצביע על כך שפתרון EDTA או ניתוק תא מוכן להסרה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב EDTA או פתרון ניתוק תא. הוסף 1 מיליליטר של מדיום E8 בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרומטר. לעקור מושבות hiPSC בהיטב על ידי pipetting שוב ושוב למעלה ולמטה וריסוס את מושבות עם טפטפת P1000. מושבות צריכה להיות מחולקות 5-10 גושי תא אחרי ההשלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המושבות שמושעות ב 1 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבש את גושי תאים הגדולים לגושים קטנים במדיום E8. הוספת נפח מתאים של תקשורת E8 עם מעכב להשעית התא לדלל את התאים. נפח התקשורת להוסיף לדילול תלוי בצפיפות התאים ומספר הבארות שנזרע. באופן אידיאלי, 80% גם של hiPSCs אחת, ומחוברות צריכים להיות מדולל 01:12. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 11 מיליליטר בינוני E8 עם מעכב ROCK ל1 מיליליטר הקיים של ceפתרון ll בצינור חרוטי 15 מ&quot;ל כאמור לקבלת דילול 01:12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוסף triturate גושי תאים לרסיסי תא קטנים (סביב 50-200 תאים בכל בר הוא הטובים ביותר). הימנע על-triturating כמו זה מפחית הישרדות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ECMS מהצלחות מצופים מראש ולהוסיף 2 מיליליטר של תאי resuspended לתוך כל טוב. כ -100,000 תאים לכל גם צלחת 6-גם הוא אידיאליים. שואף לוותר התאים באופן שווה סביב היטב כדי למנוע הצטברות של תאים במרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של culturing, להחליף בינוני עם בינוני E8 ללא מעכבי ROCK. לשנות את מדיום התרבות כל שעה 24 עד התאים להיות מחוברות 80%. לאחר מכן, התאים מוכנים למעבר שוב. זה בדרך כלל לוקח 3-6 ימים בין הקטעים להגיע 80% confluency. </li></ol> 5. hiPSCs הקפאה הערה: באופן קרוב בצע הליך זה כפי שהוא עשוי להוביל לculturing האופטימלי ובידול במורד הזרם של ירךמנג&#39;רים לhiPSC-CMS הבאים מחזור ההקפאה / הפשרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית צינורות קירור עם שם שורת התאים, סוג התא, מספר מעבר, ותאריך הקפאה. כקו מנחה כללי, להשתמש בבקבוקון אחד לכל גם צלחת 6 באר. הכן צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא 9 מיליליטר של מדיום E8 עם מעכב ROCK (10 מיקרומטר). הכן הקפאה בינונית עם FBS 90% ו -10% DMSO, ולשמור בינוני על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב תקשורת והתרבות, להוסיף 500 μl של 0.5 mM EDTA או פתרון ניתוק תא 1x ודגירה של 2-7 דקות ב RT. משך חשיפת פתרון EDTA או ניתוק תא משתנה משורת תאים לשורת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב EDTA או פתרון ניתוק תא. הוסף 1 מיליליטר של מדיום E8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקור מושבות hiPSC בהיטב על ידי pipetting מעלה ומטה וריסוס את מושבות עם טפטפת P1000. מושבות לא צריכים להיות מחולקות קטן יותר מ -100 גושי תא. להעביר את התאים מושעים לצינור חרוטי מוכן המכיל E8. צנטריפוגה בRT למשך 4 דקות ב 200 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולהוסיף 500 μl של מדיום הקפאה קר לגלולה. Resuspend גלולה ידי pipetting 01:59 פעמים. הישרדות תא משתפרת על ידי שמירה על תאים בגושים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי resuspended לתוך צינור קירור שכותרת. במהירות להזיז את הבקבוקונים לisopropanol הקפאת מיכל המכילה, אשר תאפשר לקירור הדרגתי. שמור את המכל עם תאים ב -80 ° C למשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר את תאי חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. </li></ol> 6. לב התמיינות של iPSC האדם הערה: כל התקשורת צריכה להיות לפחות ב RT כאשר הוסיפו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניתוק עם פתרון ניתוק תא EDTA או 1x, זרע כ -100,000 iPSCs האנושי על ECMS מצופה תרבות צלחות 6-גם לבידול (אותם צעדים כמו נהלי passaging תא). כאשר התאים מגיעים 85% confluency, לשנות את המדיום לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין עם 6CHIR99021 מיקרומטר מעכב GSK3-ביתא (CHIR) ולשמור במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות, להחליף את מדיום התרבות CHIR המכיל עם RPMI / B27 ללא בינוני אינסולין ולהשאיר לבד למשך 24 שעות (עד יום 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, לשנות את התקשורת לRPMI / B27 ללא אינסולין עם 5 מיקרומטר Wnt מעכב IWR1 ולשמור במשך 48 שעות (עד יום 5). הערה: עיכוב Wnt יכול להיות גם ניסה באמצעות תרכובות מולקולה קטנות אחרות, כפי שתואר במחקרים קודמים 11. IWR1 נבחר על מעכבי Wnt מולקולה קטנה אחרים בשל הטווח המוגדל שבה הוכח כיעילים בעיכוב Wnt איתות 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 5, לשנות את המדיום חזרה לRPMI / B27 ללא בינוני אינסולין ולהשאיר למשך 48 שעות (עד יום 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 7, להחליף בינוני עם בינוני RPMI / B27 (עם אינסולין) ולהחליף בינוניים כל 3 ימים לאחר מכן עם אותו בינוני. מכות ספונטניות של שריר לב צריכה להיות גלויות ראשונה בכ היום 8 ליום10. </li></ol> 7. טיהור של cardiomyocytes האדם באמצעות הרעבת גלוקוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום שלאחר 10 בידול, לשנות את המדיום בכל טוב של 6-גם הצלחת 2 מיליליטר הבינוני גלוקוז הנמוך ולשמור על התאים במדיום הזה במשך 3 ימים (עד יום 13). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 13, לחזור תאים למדיום RPMI / B27 (עם אינסולין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, replate cardiomyocytes לפני הסיבוב של רעב גלוקוז השני כדי לעזור לשחרר הלא cardiomyocytes מצלחת התרבות, המאפשר לניתוק קל של אי-cardiomyocytes במהלך רעב גלוקוז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 13, בינוני לשאוב, לשטוף פעם אחת עם PBS, ולנתק את התאים לתאים בודדים באמצעות 500 μl של אנזים התנערות תא במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. באופן ספציפי, לאחר 5 דקות של טיפול אנזים, להשתמש פיפטה 1000 μl לנתק ידני cardiomyocytes מהצלחת 6-היטב על ידי משיכת שוב ושוב את אנזים התנערות תא וריסוס נגדו cardiomyomonolayer cyte. עד 30 חזרות pipetting ייתכן שיהיה צורך לנתק את cardiomyocytes לתוך תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים הם ניתקו והם בצורה חדה-תאית, לאסוף את כל התאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מלא 5 מיליליטר של מדיום RPMI / B27 עם אינסולין כדי לדלל את אנזים התנערות תא צנטריפוגות למשך 4 דקות ב 200 x g. לשאוב ולזרוק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש את התאים עם מדיום 2 מיליליטר RPMI / B27 וצלחת על צלחת 6-גם מצופה ECMS חדשה. בדרך כלל, confluency גבוה יותר של שריר לב מסייע בהישרדות תא במהלך replating. מטרת replate 2 מיליון תאים לכל צלחת 6-גם חדשה להישרדות אופטימלית במהלך replating. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 14, לשנות את המדיום חזרה ל -2 מיליליטר של מדיום גלוקוז הנמוך למעגל קיפוח גלוקוז שני. תרבות התאים במדינת גלוקוז נמוכה זה במשך 3 ימים נוספים. רוב הלא-cardiomyocytes ימותו במצב התרבות הנמוך של גלוקוז זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 17 ב, לשנות הבינוני עד 2 מיליליטר של Rבינוני PMI / B27 עם אינסולין. התאים הנותרים יהיו cardiomyocytes הנקי במיוחד. cardiomyocytes אלה יכול לשמש לניתוח ביטוי גנים, הקרנת סמים, ניתוח חילוף חומרים, ומבחנים במורד הזרם שונים אחרים. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (6), 150 (2013).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+for+coxsackievirus+B3-induced+myocarditis+and+antiviral+drug+screening+platform.">Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as an in vitro model for coxsackievirus B3-induced myocarditis and antiviral drug screening platform.</a> Circulation Research. 115 (6), 556-566 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/beta-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (12), 127-137 (2013).</li><li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511.">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 611-615 (2010).</li><li>Li, X., Meng, G., Krawetz, R., Liu, S., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation.">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells:+the+matrix+sandwich+method.">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li></ol>

The authors do not declare competing interests.

קבלת כמות גדולה של שריר לב הנגזר hiPSC נקי במיוחד היא קריטית למחקר לב בסיסי, כמו גם יישומים קליניים וtranslational. פרוטוקולי בידול לב עברו שיפורים עצומים בשנים האחרונות, מעבר משיטות המבוסס על גוף embryoid ניצול צמיחת קרדיוגני גורמים 2, למטריצת שיטות כריך 12, ולבסוף לשי?...

cardiomyocytes אדם מן המעלה הראשון הם קשה להשגה בגלל הדרישה לביופסיות לב פולשנית, קושי במתנער לתאים בודדים, ובגלל הישרדות תא לטווח ארוך עניה בתרבות. בהתחשב בזה חוסר cardiomyocytes האנושי הראשוני, cardiomyocyte מקורן בתאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מטופל ספציפי טכנולוגיה (hiPSC-CM) כבר נחשבה כמקור עוצמה חלופי cardiomyocyte למחקר בסיסי, כמו גם יישומים קליניים וtranslational כגון דוגמנות מחלה ותרופה תגלית 1. מאמצים מוקדמים בתאי גזע pluripotent לcardiomyocytes מועסקים פרוטוקולי בידול באמצעות גופי embryoid (EBS), אך שיטה זו אינה יעילה בשריר לב בהפקת כי לעתים קרובות פחות מ -25% מתאים בEB מכים cardiomyocytes 2,3. יחסית, פרוטוקול בידול המבוסס על monolayer באמצעות ציטוקינים Activin וBMP4 מוצג יעילות גבוהה יותר מאשר EBS, אבלפרוטוקול זה הוא עדיין יחסית לא יעיל, דורש גורמים יקרים צמיחה, ופועל רק במספר מצומצם של שורות תאי גזע האנושי pluripotent 4. לאחרונה, פרוטוקול יעיל ביותר, המבוסס על monolayer hiPSC בידול cardiomyocyte פותח על ידי ויסות Wnt / β-קטנין איתות 5. אלה hiPSC-CMS להביע T לב טרופונין וactinin אלפא, שני חלבונים sarcomeric שהם סמנים סטנדרטיים של cardiomyocytes 6. הפרוטוקול מתאר כאן הוא עיבוד של,, 5,7 זה קטן על בסיס מולקולות תא מזין ללא הבחנה monolayer שיטה. אנו מסוגלים להשיג להכות cardiomyocytes מhiPSCs לאחר 7-10 ימים (איור 1). עם זאת, בעקבות בידול cardiomyocyte וכתוצאה מכך 50% הכו את התאים, immunostaining באופן עקבי מראה את קיומה של אוכלוסייה הלא-cardiomyocytes כי הם שליליים לסמני cardiomyocyte הספציפי כגון T טרופונין הלבבי ספציפי ואלפא-actinin. לפוrther לטהר cardiomyocytes ולחסל הלא cardiomyocytes, אוכלוסיות תאים מובחנות הטרוגנית היו נתונים לגלוקוז רעב תוך התייחסות אליהם עם מדיום תרבות גלוקוז נמוך מאוד במשך ימים רבים (איור 2). טיפול זה באופן סלקטיבי מבטל הלא cardiomyocytes בשל היכולת של שריר לב, אך לא בלתי-cardiomyocytes, לחילוף חומרים לקטט כמקור האנרגיה העיקרי על מנת לשרוד בסביבת גלוקוז נמוכה 8. לאחר שלב טיהור זה, עלייה של 40% בשיעור cardiomyocytes אי cardiomyocytes הוא ציין, (איור 3, איור 4) ותאים אלה יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם ביטוי גנים, דוגמנות מחלה, ומבחני הקרנת סמים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="550">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:207px;">Name</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Matrigel (9-12 mg/mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glucose free RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11879-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Minus Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1895601</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Supplement (w/ insulin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>BenchMark</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>688000</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">CHIR99021</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>508306</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">IWR1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0161</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cell lifter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-100-240</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cryovial</td>
			<td>Fisher (NUNC tubes)</td>
			<td>375418</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12563-011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation

cardiomyocytes מקורן בתאי גזע pluripotent אדם מושרה (hiPSC-CMS) הפך מקור תא חשוב להתייחס לחוסר cardiomyocytes העיקרי זמין עבור יישומי מחקר וtranslational בסיסיים. להבדיל hiPSCs לשריר לב, פרוטוקולים שונים, כוללים גוף embryoid (EB) בידול מבוסס ואינדוקצית גורם הגדילה פותחו. עם זאת, פרוטוקולים אלה אינם יעילים ומשתנים מאוד ביכולתם ליצור cardiomyocytes המטוהר. לאחרונה, אפנון פרוטוקול ניצול קטן על בסיס מולקולות איתות Wnt / β-קטנין הוצג לקידום בידול לב עם יעילות גבוהה. עם פרוטוקול זה, יותר מ -50% -60% מתאים מובחנים היו cardiomyocytes טרופונין חיובי לב נצפו באופן עקבי. כדי להגדיל את טוהר cardiomyocyte נוסף, התאים המובחנים היו נתונים לגלוקוז רעב לחסל במיוחד שאינו cardiomyocytes המבוסס על ההבדל מטבוליםים בין cardiomyocytes ולא cardiomyocytes. באמצעות אסטרטגית בחירה זו אנו באופן עקבי השגנו עלייה גדולה יותר מ -30% בשיעור cardiomyocytes אי cardiomyocytes באוכלוסייה של תאים מובחנים. cardiomyocytes הנקי במיוחד אלה צריכים לשפר את האמינות של תוצאות מאדם מבוסס iPSC בלימודי דוגמנות המחלה מבחנה ומבחני הקרנת סמים.

השינויים מורפולוגיים במהלך התמיינות hiPSC. HiPSC התרבותי בצלחות מזין ללא גדל מושבות שטוחות כמו, דו-ממדיות. לאחר שהגיע סביב 85% confluency, טופלו hiPSCs עם 6 מיקרומטר CHIR לבידול (איור 1 א). כמויות ניכרות של מוות של תאים, תופעה נורמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose S

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

גזירה של שריר לב נקי במיוחד מתאי גזע האנושי המושרה pluripotent באמצעות בידול מאופנן מולקולה קטן ולאחר גלוקוז רעב

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

derivation-highly-purified-cardiomyocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

18.5K Views.  Stanford University School of Medicine. Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening. 

Video: Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

דיפרנציאציה של פרפור cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים שימוש Grem2 אנטגוניסט BMP

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

הבדל Chondrocytes מ היקפי דם הנגזרות האדם תאים Pluripotent Pluripotent Induced

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.