שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של המערכת, כגון מנגנון הוויסות שמאחורי הרשת המיטוטית והמאפיינים והפונקציות הדינמיים של שעון מחזור התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא תיצור כמות גדולה של טיפות עם מחזורי תאים מרובים בכל אחד, מתן לנו מסגרת תפוקה גבוהה עבור מניפולציה כמותית וניתוח. ראשית, השליכו קבוצות ביצים שיש להן גבולות לא ברורים בין מוטות בעלי חיים וצמחייה או כתמים לבנים לא סדירים על גבי מוטות בעלי חיים.
לאחר מכן, בחר קבוצה מתאימה של ביצים מצפרדע אחת, והעבר את הביצים לסקייה של 600 מיליליטר. יוצקים עודף של חיץ MMR 0.2x, ומוסיפים בעדינות ציסטאין במאגר תמצית 1x לביצים. לאחר מכן, לנער את הסלק במרץ ביד כדי להסיר את מעילי ג'לי של הביצים.
חזור על שטיפה זו שלוש פעמים עם סך של 800 מיליליטר של חיץ ציסטאין או עד הביצים לצבור להתיישב בתחתית הפוף. לאחר הסרת מעיל הג'לי, לשטוף את הביצים ארבע פעמים בליטר אחד של 0.2x פתרון MMR. השתמש פיפטה זכוכית להרים ולהשליך את הביצים להפוך לבן.
יוצקים את מאגר MMR מתוך התוך המק, ומוסיפים 200 מיליליטר של תות תוסף סידן יונופור לתוך הביצים. השתמש פיפטה זכוכית כדי לערבב את הביצים בעדינות עד שהם מופעלים, ולהסיר את פתרון הסידן יונופור. השארת הביצים בתספור סידן יונופור במשך זמן רב מדי תיזום אפופטוזיס.
אנחנו מערבבים את הביצים במשך 1.5 דקות ולבדוק את יעילות ההפעלה. אם הם אינם מופעלים, חזור לערבב ובדוק בתדירות גבוהה יותר עד להשגת הפעלה של 90%.. לאחר שהביצים מתיישבות בתחתית הסקילר, בדוק את יעילות ההפעלה.
ביצים מופעלות היטב יש כ 25% של מוט החיה ו 75% של מוט הצמחייה. לאחר מכן, לשטוף את הביצים פעמיים עם נפח כולל של 50 מיליליטר של חיץ תמצית בתוספת מעכבי פרוטאז. לאחר מכן, מעבירים בזהירות את הביצים למיקרו-צינור Snap-cap של 0.4 מיליליטר.
צנטריפוגה microtube במשך 60 שניות ב 200 גרם ולאחר מכן ב 600 גרם במשך 30 שניות כדי לארוז את הביצים. לאחר מכן, השתמש פיפטה פסטר זכוכית כדי להסיר את המאגר עודף על גבי הביצים לאחר כל שלב. לאחר מכן, למחוץ את הביצים ב 15, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
השתמש סכין גילוח כדי לחתוך את הצינורות כדי להפריד את שלוש שכבות של ביצים כתוש ולשמור על ציטופלסמה גולמית בשכבה האמצעית. לאחר מכן, להעביר את הציטופלסמה הגולמית כדי לנקות צינורות אולטרהצנטריפוגה. להשלים את הציטופלסמה עם מעכבי פרוטאז ו cytochalasin B ב 10 מיקרוגרם למיליליטר כל אחד.
צנטריפוגה ציטופלסמה גולמית ב 15, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הצינור ולשמור את הציטופלסמה בשכבה האמצעית. מניחים את התמציות הטריות המוכנות על קרח.
ראשית, להוסיף securin-mCherry mRNA לתמציות מוכנות. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של 2%PFPE-PEG פלואורו-פרקטיקה לתערובת תמצית mRNA. השתמש מערבל מערבולת כדי ליצור טיפות, התאמת מהירות המערבולת ומשך לפי הצורך.
לאחר מכן, לבדוק חזותית את טיפות כדי להבטיח שהם אחידים בגודל. באמצעות פיפטה 200 מיקרוליטר, להעביר את טיפות צף על גבי נפח שווה של פעילי שטח לצינור PCR. טובלים צינור זכוכית בשכבת טיפה, ומחכים עד שהטפסות ימלאו כ-75% מהצינור.
לאחר מכן, לדחוף את הצינור לתוך השכבה פעילי שטח, ולמלא את הצינור לחלוטין. לאחר מכן, מלאו צלחת עם תחתית זכוכית בשמן מינרלי. לאחר מכן, השתמש פינצטה בסדר לטבול את הצינור מלא טיפה בשמן.
השתמש פיפטה זכוכית כדי להסיר את כל פסולת גלויה או טיפות דלף. כדי למנוע תנועה ודליפת טיפות, צינור הזכוכית מלא טיפות צריך להיות שקוע מתחת לשמן מינרלי בזהירות. אנחנו יכולים גם לדחוף את הצינור בשני הקצוות עם איזון או להוסיף כמה טיפות של שמן מינרלי על קצות הצינור בו זמנית הראשון.
לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ epifluorescence המצויד בשלב xy ממונע כדי לדמיין את טיפות. הקלט קטעי וידאו לשגות זמן בשדה הבהיר וערוצי פלואורסצנטיות מרובים כל שש עד תשע דקות עד טיפות לאבד את פעילותם. באמצעות פרוטוקול זה, תנודות מיוטיות בתאים פשוטים, ללא גרעין ותאים מסובכים עם גרעינים יוצרו.
טיפות ללא גרעינים יצרו תנודות מיתוטיות עד 30 מחזורים לא מבושלים במשך 92 שעות. כמו כן נבחנה היכולת של מתנד המיטוטי לנהוג במורד הזרם. המתנד המיטוטי המתמשך דחף את השינויים של המורפולוגיה הגרעינית שנצפתה באמצעות שינוי אוטונומי של שלבי מחזור תאים נפרדים.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את הזמן בעת ביצוע התמצית, כפי שהוא זמן רגיש, ותמיד לשמור את הביצים לחלץ על קרח. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה לחוקרים בתחום הביולוגיה של המערכת לחקור עקרונות בסיסיים של תכונות שעון מורכבות, כמוtunability ושטוצ'סטיות בקסנופוס לאבס.
