Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia do sistema, como o mecanismo de regulação por trás da rede mitótica e as propriedades e funções dinâmicas do relógio de ciclo celular. A principal vantagem dessa técnica é que ela irá gerar uma grande quantidade de gotículas com múltiplos ciclos celulares em cada um, fornecendo-nos uma estrutura de alto rendimento para manipulação e análise quantitativa. Para começar, descarte lotes de ovos que não tenham limites claros entre postes animais e vegetais ou manchas brancas irregulares em cima de postes de animais.
Em seguida, selecione um lote apropriado de ovos de uma sapo fêmea, e transfira os ovos para um béquer de 600 mililitros. Despeje um excesso de 0,2x de tampão MMR e adicione suavemente cisteína em 1x de tampão de extrato aos ovos. Depois disso, aperte o béquer vigorosamente à mão para remover as camadas de geleia dos ovos.
Repita esta lavagem três vezes com um total de 800 mililitros de tampão de cisteína ou até que os ovos se agreguem e se acomodem no fundo do béquer. Depois que a camada de geleia for removida, lave os ovos quatro vezes em um litro de solução mmr de 0,2x. Use uma pipeta de vidro para pegar e descartar os ovos que ficam brancos.
Despeje o tampão MMR do béquer e adicione 200 mililitros de solução de ionóforo de cálcio nos ovos. Use uma pipeta de vidro para agitar os ovos suavemente até que eles sejam ativados, e remova a solução de ionóforo de cálcio. Deixar os ovos na solução de ionóforo de cálcio por muito tempo iniciará apoptose.
Agitamos os ovos por 1,5 minutos e verificamos a eficiência de ativação. Se eles não forem ativados, retome a agitação e verifique com mais frequência até que a ativação de 90% seja alcançada. Depois que os ovos se instalarem no fundo do béquer, verifique a eficiência de ativação.
Ovos bem ativados têm aproximadamente 25% do polo animal e 75% do polo vegetal. Em seguida, lave os ovos duas vezes com um volume total de 50 mililitros de extrato tampão complementado com inibidores de protease. Em seguida, transfira cuidadosamente os ovos para um microtubo de 0,4 mililitros snap-cap.
Centrifugar o microtubo por 60 segundos a 200 g e depois a 600 g por 30 segundos para embalar os ovos. Em seguida, use uma pipeta pasteur de vidro para remover o excesso de tampão em cima dos ovos após cada passo. Depois disso, esmague os ovos a 15.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Use uma lâmina de barbear para cortar os tubos para separar as três camadas de ovos esmagados e manter o citoplasma bruto na camada média. Em seguida, transfira o citoplasma bruto para limpar tubos ultracentrífugas. Suplemente o citoplasma com inibidores de protease e citochalasina B a 10 microgramas por mililitro cada.
Centrifugar o citoplasma bruto a 15.000 g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, use uma lâmina de barbear para cortar o tubo e manter o citoplasma na camada média. Coloque os extratos recém-preparados no gelo.
Primeiro, adicione securin-mCherry mRNA aos extratos preparados. Em seguida, adicione 200 microliters de fluorosurfactant 2%PFPE-PEG à mistura de extrato mRNA. Use um misturador de vórtice para gerar gotículas, ajustando a velocidade e duração do vórtice conforme necessário.
Em seguida, inspecione visualmente as gotículas para garantir que elas estejam uniformes em tamanho. Usando uma pipeta de 200 microliter, transfira as gotículas flutuando em cima e um volume igual de surfactante para um tubo PCR. Mergulhe um tubo de vidro na camada de gotícula e espere até que as gotículas encham aproximadamente 75% do tubo.
Em seguida, empurre o tubo para dentro da camada surfactante, e encha o tubo completamente. Em seguida, encha um prato com fundo de vidro com óleo mineral. Em seguida, use pinças finas para imergir o tubo cheio de gotas no óleo.
Use uma pipeta de vidro para remover detritos visíveis ou gotículas vazadas. Para evitar o movimento e o vazamento de gotículas, o tubo de vidro cheio de gotículas deve ser imerso sob o óleo mineral cuidadosamente. Podemos empurrar o tubo em ambas as extremidades com equilíbrio ou adicionar algumas gotas de óleo mineral nas extremidades do tubo simultaneamente primeiro.
Depois disso, use um microscópio de epifluorescência equipado com um estágio xiy motorizado para visualizar as gotículas. Grave vídeos de lapso de tempo no campo brilhante e vários canais de fluorescência a cada seis a nove minutos até que as gotículas percam sua atividade. Usando este protocolo, foram produzidas oscilações mitóticas em células simples e livres de nucleares e células complicadas com núcleos.
As gotículas sem núcleos geraram oscilação mitótica de até 30 ciclos não amostrados ao longo de 92 horas. A capacidade do oscilador mitótico de conduzir eventos mitóticos a jusante também foi examinada. O oscilador mitotístico autossustentado impulsionou as mudanças da morfologia nuclear observadas através da alteração autônoma de fases distintas do ciclo celular.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar da hora de fazer o extrato, pois é sensível ao tempo, e sempre manter os ovos e extrair no gelo. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia do sistema explorarem princípios fundamentais de propriedades complexas do relógio, como a sintonia e a estocástica em Xenopus laevis.
