תעלומה זו יכולה לעזור לענות על כמה שאלות בתחום הביולוגיה של התא כגון קלט חלבון לתוך chloroplasts. היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא כי קלט חלבון לתוך chloroplasts ניתן ללמוד בתנאים en vivo. הדגמת ההליך תהיה ג'והו לי והיאנגג'ו קאנג, שני פוסטים מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, לקצור רקמות עלים שלמות מצמחים בני שבועיים מאחד עד שתי צלחות B5. השתמש בסכין כירורגית כדי לקצור את העלים ול למקם אותם לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של תותבת אנזים. מניחים את הצינור אופקית על שייקר סיבובי ודגירה עם תסיסה עדינה ב 22 מעלות צלזיוס בחושך במשך שמונה עד 12 שעות עד רק petioles וגבעולים להישאר בתסיסה.
לאחר השלמת הדגירה, מסננים את תטגם האנזים המכיל פרוטופלסטים משוחררים באמצעות רשת בגודל נקבובית של 140 מיקרומטר לתוך צלחת פטרי טרייה. ואז בזהירות שכבת הפתרון על גבי 15 מיליליטר של 21% פתרון סוכרוז בצינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור רוטור דלי מתנדנד ב 98 gs במשך 10 דקות עם ההאצה הנמוכה ביותר ואת הגדרות ההאטה.
לאחר מכן, השתמשו בפטורה פיפט כדי להסיר בזהירות את הפרוטופלסטים מהשכבה העליונה המכילה תותב אנזימים ומהממשק בין פתרון האנזימים ותתפורת סוכרוז. העבר פתרון זה לצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר של פתרון W5 ולהפוך את הצינור לערבב. צנטריפוגה הצינור ב 51 gs במשך שש דקות.
השתמש פיפטה כדי להשליך את זה על טבעי בזהירות מבלי להפריע protoplasts גלולה. הוסף 25 מיליליטר של פתרון W5 בעדינות להשעות את protoplasts. לייצוב, דגירה במקרר ארבע צלזיוס למשך שעה לפחות.
לאחר דגירה של ארבע מעלות צלזיוס, גלולה protoplasts לחלוטין על ידי צנטריפוגה אותם ב 46 gs במשך שתי דקות. בזהירות להסיר את העל טבעי לחלוטין ולהוסיף פתרון MANG לכדור protoplast כדי להשיג חמש פעמים עשר עד שישה למיליליטר. השתמש פיפטה להוסיף 10 מיקרוגרם של DNA פלזמה ו 300 microliters של פתרון protoplast לצינור 13 מיליליטר עגול תחתית טרי.
מערבבים על ידי סיבוב עדין של הצינורות ביד ולאחר מכן מיד להוסיף 300 microliters של 40% פתרון PEG מוכן טרי. מערבבים לחלוטין על ידי הטיית הצינור כמעט אופקית וסיבובו בעדינות מספר פעמים ביד. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון W5 ומערבבים לחלוטין על ידי סיבוב עדין של הצינור ביד כבעבר. הדגירה את המדגם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור פעמיים נוספות עם הוספת הראשון 1.5 מיליליטר ולאחר מכן שני מיליליטר של W5 ואחרי התוספת הסופית ערבוב, דגירה במשך 30 דקות.
צנטריפוגה הצינור ב 46 gs במשך ארבע דקות ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. מוסיפים שני מיליליטר של פתרון W5 לכדור ומערבבים בעדינות, אבל לגמרי, באותו אופן כמו בעבר. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס בתא חשוך במשך 18 שעות.
כדי לנתח את יבוא החלבון באמצעות מיקרוסקופיה של florescence, השתמשו בפיגט עם קצה גזוז כדי למקם 10 מיקרוליטרים של תותבת הפרוטופלסט על מגלשת זכוכית. השתמש להחליק כיסוי כדי לכסות בזהירות את הפתרון, כדי למנוע פגיעה protoplasts. מניחים את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן כניסה העירור כי הוא מוגדר להתבוננות חלבון פלואורסצנטי ירוק ושפעת אוטומטית כלורופיל.
השתמש במצלמת מכשירים זוגיים של טעינה מקוררת כדי ללכוד תמונות ולעבד אותן באמצעות תוכנת עריכה מדומה כדי להפיק תמונות בצבע מדומה. עבור מיצוי חלבון הכולל immunoblotting, להסיר מיליליטר אחד מתסמת protoplast ומערבבים את מיליליטר הנותרים. העבר פתרון protoplast זה לתוך צינור צנטריפוגה צנטריפוגה ב 46 gs במשך ארבע דקות.
הסר את supernatant לאחר השלמת צנטריפוגה ולהוסיף 80 microliters של מאגר denaturation. וורטקס במרץ למשך חמש שניות. מוסיפים חמישה מאגר מדגם XDS, מערבבים היטב ומרתיחים במשך 10 דקות כדי denature.
המשך עם דף STS סטנדרטי ו immunoblotting עם נוגדן נגד GFP. RbcS ו- TGFT, מבנה היתוך המאדים את שאריות חומצות האמינו של מסוף 79 של RBCS המכילות את פפטיד המעבר התמזגו ל- GFP, שימשו לחקר ייבוא חלבונים לכלורופלסטים על ידי מיקרוסקופיה של פלורנס ואימונובלוט. כאשר נבדק על ידי מיקרוסקופיה florescence, אותות פלואורסצנטיים ירוקים מחלבון היעד התמזגו עם אותות פלואורסצנטיים אדומים מתפרחת כלורופיל אוטומטית המציינת יבוא חלבון לכלורופלסטים.
לאחר בידוד החלבון הכולל, שתי רצועות חלבון נצפו immunoblot, מראה כי חלבון יובא כראוי לתוך chloroplasts. הרצועה העליונה תואמת למבשר באורך מלא ולרצועה התחתונה לטופס המעובד לאחר הייבוא לכלורופלסטים. כמות הצורה המעובדת של החלבון גדלה באופן תלוי זמן, מה שמרמז על כך שהחלבון מיובא לכלורופלסטים.
בהתפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור חלבון מעייף או קטיף חוט קרום ב Arabidopsis.
