Ce mystère peut aider à répondre à quelques questions dans le domaine de la biologie cellulaire comme l’entrée de protéines dans les chloroplastes. Le principal avantage de cette technologie est que l’entrée de protéines dans les chloroplastes peut être étudiée dans des conditions en vivo. Junho Lee et Hyangju Kang, deux post-outs de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer, récoltez les tissus intacts des feuilles des plantes de deux semaines d’une à deux plaques B5. Utilisez un couteau chirurgical pour récolter les feuilles et les placer dans un tube conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres de solution enzymatique. Placez le tube horizontalement sur un shaker rotatif et incubez avec une légère agitation à 22 degrés Celsius dans l’obscurité pendant huit à 12 heures jusqu’à ce que seuls les pétioles et les tiges restent dans la solution.
Après avoir terminé l’incubation, filtrer la solution enzymatique contenant des protoplastes libérés à travers un maillage de taille pore de 140 micromètres dans une boîte de Pétri fraîche. Couchez ensuite soigneusement la solution sur 15 millilitres de solution saccharose à 21% dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger le tube dans un rotor balançant seau à 98 gs pendant 10 minutes avec les réglages d’accélération et de décélération les plus faibles.
Après cela, utilisez la pipette patura pour enlever soigneusement les protoplastes de la couche supérieure contenant une solution enzymatique et de l’interface entre la solution enzymes et la solution de saccharose. Transférez cette solution dans un tube conique de 50 millilitres contenant 30 millilitres de solution W5 et inversez le tube pour le mélanger. Centrifuger le tube à 51 gs pendant six minutes.
Utilisez une pipette pour jeter soigneusement ce supernatant sans déranger les protoplastes dans la pastille. Ajouter 25 millilitres de solution W5 et suspendre doucement les protoplastes. Pour la stabilisation, incuber dans un réfrigérateur de quatre Degrés Celsius pendant au moins une heure.
Après quatre degrés Celsius d’incubation, pelleter complètement les protoplastes en les centrifugant à 46 gs pendant deux minutes. Retirez soigneusement le supernatent complètement et ajoutez la solution MANG à la pastille de protoplaste pour atteindre cinq fois dix à six par millilitre. Utilisez une pipette pour ajouter 10 microgrammes de l’ADN plasmatique et 300 microlitres de solution protoplastique à un nouveau tube à fond rond de 13 millilitres.
Mélanger en tournant doucement les tubes à la main, puis ajouter immédiatement 300 microlitres de solution PEG fraîchement préparée à 40%. Mélanger complètement en inclinant le tube presque horizontalement et en le tournant doucement plusieurs fois à la main. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.
Ajoutez ensuite un millilitre de solution W5 et mélangez complètement en tournant doucement le tube à la main comme auparavant. Incuber l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante. Répétez deux fois de plus avec l’ajout d’abord 1,5 millilitre, puis deux millilitres de W5 et après l’ajout final et le mélange, incuber pendant 30 minutes.
Centrifuger le tube à 46 gs pendant quatre minutes, puis jeter le supernatant. Ajouter deux millilitres de solution W5 à la pastille et mélanger délicatement, mais complètement, de la même manière qu’auparavant. Incuber à 22 degrés Celsius dans une chambre sombre pendant 18 heures.
Pour analyser l’importation de protéines à l’aide de la microscopie de florescence, utilisez une pipette avec une pointe taillée pour placer 10 microlitres de la solution protoplaste sur une glissière en verre. Utilisez un bordereau de couvercle pour couvrir soigneusement la solution afin d’éviter d’endommager les protoplastes. Placez la diapositive sur la scène d’un microscope à fluorescence avec un filtre d’admission excitation qui est prêt à observer la protéine fluorescente verte et l’autofluorescence chlorophylle.
Utilisez une caméra de couple de charge refroidie pour capturer des images et les traiter à l’aide d’un logiciel d’édition imagine pour produire des images pseudo-couleur. Pour l’extraction totale des protéines et l’immunoblotting, retirez un millilitre de la solution protoplastique et mélangez le reste d’un millilitre. Transférer cette solution protoplaste dans un tube de centrifugeuse et une centrifugeuse à 46 gs pendant quatre minutes.
Retirer le supernatant après avoir terminé la centrifugation et ajouter 80 microlitres de tampon de dénaturation. Vortex vigoureusement pendant cinq secondes. Ajouter cinq tampons d’échantillon XDS, bien mélanger et faire bouillir pendant 10 minutes pour dénoaturer.
Procéder à la page STS standard et immunoblotting avec anticorps anti-GFP. RbcS et TGFT, une construction de fusion codant les 79 résidus d’acides aminés terminaux finaux de RBCS contenant le peptide de transit fusionné au GFP, ont été utilisés pour étudier l’importation de protéines dans les chloroplastes par microscopie de florescence et immunoblotting. Lorsqu’ils sont examinés par microscopie par florescence, les signaux fluorescents verts de la protéine cible fusionnent avec les signaux fluorescents rouges de l’autoflorescence chlorophylle indiquant l’importation de protéines dans les chloroplastes.
Après avoir isolé la protéine totale, deux bandes protéiques sont observées dans l’immunoblot, montrant qu’une protéine a été correctement importée dans les chloroplastes. La bande supérieure correspond au précurseur de pleine longueur et à la bande inférieure à la forme traitée après importation dans les chloroplastes. La quantité de la forme traitée de la protéine a augmenté d’une manière dépendante du temps, ce qui suggère que la protéine est importée dans les chloroplastes.
Lors de ce développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire pour explorer la fatigue des protéines ou la cueillette des fils membranaires dans arabidopsis.
