שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הריפוי הגנטי, אונקוליזה וחיסון גנטי. זה מקל על הבנה ותווסת של וקטור מארח אינטראקציות של וקטורים העברת גנים אדנווירוס, הסוג הווקטור הנפוץ ביותר בניסויים קליניים מעודכן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי adenovirus מתהפך ניתן לשנות באופן ספציפי באופן מוגדר מאוד בעמדות נבחרות במידה משתנה באמצעות כימיה פשוטה.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעת לכיוון הטיפול מכיוון שלא ניתן לנתח רק את השינוי המארח הווקטורי אלא גם לווסת אותו בצורה מכוונת מטופל. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי אינטראקציות מארח וקטוריות ספציפיות, היא עשויה לשמש גם לתיוג ומעקב אחר חלקיקי וירוסים באורגניזמים חיים, כגון עכברים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו בשילוב הייחודי של וירולוגיה וכימיה אורגנית הדורשת ידע מעשי משני תחומים.
הדגמה מיוחדת של טכניקה זו היא קריטית משום שכאן שיטות מכימיה אורגנית פוגשות שיטות של ביולוגיה של התא וווירולוגיה, כולל טריקי טיפול ספציפיים לתחום. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את כל המאגרים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. שקל מיליליטר אחד מכל מאגר הדרגתי כדי לבדוק את צפיפותו.
לאחר עיקור כל המאגרים, לפצל את המאגרים המכילים TCEP עם גז ארגון במשך כ 30 שניות כדי למנוע חמצון של TCEP. אחסן את הבקבוקונים המכילים את מויטי הצימוד המוצק בצינורות גדולים יותר, כל אחד מלא כרית של בחנורי ג'ל סיליקה, כדי למנוע הצטברות של מים מרוכזים בעת הפשרת הבקבוקונים. שים את הצינורות האלה לתוך מעביד.
מוציאים את האוויר בדשן ומחליפים אותו בגז ארגון. ואז לסגור כל צינור בחוזקה ולהעביר אותו לתוך מיכל גדול יותר עם בחנוזי ג'ל סיליקה. ברגע שכל הצינורות הועברו, סגור את המיכל.
לאחסן את המיכל ב 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. כאשר מוכנים להפשיר, מניחים את המיכל לתוך שכבה של חסידות סיליקה ב desiccator. אפשר למיכל להתחמם לאט לטמפרטורת החדר ולאחר מכן לפתוח את המיכל.
כאשר התאים מגיעים להשפעה הציטופתית האופטימלית, אוספים אותם על ידי גירוד הצלחות והעברת העל-טבעי לצינורות צנטריפוגה. לסובב את ההשעיה התא ב 400 פעמים G במשך 10 דקות. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא בארבעה מיליליטר של מאגר Ad המכיל 10 מילימולר TCEP ולהעביר את הפתרון וכתוצאה מכך צינור סטרילי 50 מיליליטר.
להקפיא את הפתרון בחנקן נוזלי, ולאחר מכן להפשיר אותו באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. חזור על מחזור הפשרת ההקפאה הזה שלוש פעמים כדי להציל את הווקטור. צנטריפוגה ב 5000 G וארבע מעלות צלזיוס במשך עשר דקות.
בעוד צנטריפוגה להגדיר שני צינורות אולטרה צנטריפוגה להתחיל להכין שני שיפוע צעד שווה צסיום כלוריד. הוסף שלושה מיליליטר של השלב התחתון לכל אחד מהצינורות האלה. סמן את רמת השלב התחתון על הצינור לפני טעינת השלב העליון.
ואז בזהירות לערום חמישה מיליליטר של השלב העליון אל השלב התחתון, צינורות אותו לאט מאוד לאורך קירות הצינור. כאשר מעברי הצבע מוכנים וצנטריפוגה הושלמה לטעון את העל-טבעי מהדגימה באופן שווה על פני שני מעברי צבע. מלא את השטח הנותר בכל צינור הדרגתי עם מאגר מודעות המכיל TCEP עשרה מילימולרים הקפד למלא את הצינורות כל הדרך לפסגה.
התאימו את המשקל של הצינורות הנגדיים להפרש משקל אפסי. ולשנות צנטריפוגה עבור 176000 פעמים G ו 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן, השתמש מהדק כדי לתקן צינורות צנטריפוגה אולטרה אחד לעמוד.
הקפד להשאיר את האזור סביב רמת הפאזה התחתונה מסומן כנגיש. מניחים את מנורת צוואר האווז מעל הצינור. סביב הסימן, בגבול שבין השלבים התחתונים והתחתונים, צריכה להיות רצועה נפרדת גלויה.
לנקב את הצינור עם מחט, ולזמוף את הרצועה הווקטורית לתוך מזרק כדי לאסוף את הווקטור. העבר virons וקטור שנאספו לצינור 15 מיליליטר ולחשב את כמות מצע צימוד הדרוש כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר את הפתרון הווקטורי לצינור בגודל המתאים.
ואת הכמות המחושבת של פתרון מלאי תרכובות צימוד. מערבבים בעדינות לפי סיבוב תקורה במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, התאם את הנפח הכולל של הפתרון הווקטורי לשישה מיליליטר על-ידי הוספת מאגר מודעות.
לטהר את הווקטור מן moiety צימוד לא מושתק באמצעות שלב איגוד צסיום כלוריד השני כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לנקב את הצינור עם מחט ולזמוף את הרצועה הווקטורית לתוך מזרק. העבר את הווקטורים שנאספו לצינור 15 מיליליטר.
אם השילוב בין שני צינורות ההדרגתיים קטן מ- 2.5 מיליליטר, כוונן את עוצמת הקול ל- 2.5 מיליליטר על-ידי הוספת מאגר מודעות. טען את הווירון המשולב לעמודת Pd משודרגת שווה ומחק את הזרימה. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של מאגר מודעות לעמודה ואסוף את הזרימה.
הוסף 333 microliters של גליצרול לזרימה שנאסף דרך כדי לקבל את הריכוז הסופי של עשרה אחוזים. מחלקים אותם לאליקוטים מתאימים. הקפד לכלול aliquot של 20 microliters לנחישות הדוקה יותר על ידי מדידת OD 260.
יש לאחסן את הפתרון הווקטורי ב-80 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש. תוצאות מייצגות של ההשפעות על 293 תאים מצביעות על כך שהייצור הווקטורי הצליח. תאים צריכים להראות מורפולוגיה 40-48 שעות לאחר שחוסנו עם וקטור הנגיף.
כסף מוכתם SDS פאג משמש לאחר מכן כדי להעריך יעילות צימוד. וקטורים עם ציסטאינס שהוכנסו לבסיס הפנטון capsomere הן עם משון שונה ללא שינוי מנוהלים. להקות Hexon מציגות שינוי המציין שינוי מוצלח של מעל 90 אחוז מהמונומרים לכל קפסיד.
בעת ניסיון הליך זה חשוב להבטיח סביבה מצמצמת עבור חלקיקים וקטוריים לא מודרניים. לאחר השינוי, אווירה רגילה מתאימה. חישובים תיעודיים מדויקים צריכים להבטיח שינוי כמותי של כל החלקיקים הווקטוריים.
הפיתוח של טכניקה זו מסייע במחקר בתחום הריפוי הגנטי כדי לחקור עוד יותר אסטרטגיות בטוחות ו לקויות לאספקה וקטורית. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צימוד ליגנדים לפילוח או צבעים פלואורסצנטיים לתיוג על מנת לענות על שאלות נוספות כמו שימוש לקולטן והפצה ביולוגית. אנא הקפד לציית לתקנות המקומיות של GMO ובטיחות בעבודה.
