הייצוב הביולוגי של ננו-מבנים DNA חיוני עבור יישומים עתידיים in-vivo, כגון אספקת תרופות ממוקדות. עם זאת, DNA מקבל מושפל בגוף על ידי אנזימים שונים. כאן אנו מציגים טכניקת ציפוי המגנה על ננו-מבני דנ"א מפני השפלה אנזימטית.
היתרונות העיקריים הם כי הציפוי שלנו כולל תרכובות רעילות כי הם כבר משמשים אורגניזמים חיים, כי הפונקציונליזציה של פני השטח נשאר אפשרי. פונקציונליזציה זו חשובה לשילוב חיישנים מולקולריים לזיהוי מטרה ומתגים לשחרור מטען תרופתי. ציפויים Polycation מגדיל באופן משמעותי את ספיגת הסלולר של מבנים אוריגמי DNA אנקפסולציה, כך שיטה זו יכולה לפתוח את הדלת עבור יישומים של אוריגמיס DNA באבחון וטיפולים.
ספיגת התא נדרשת גם עבור יישומי אספקת גנים פוטנציאליים של ננוטכנולוגיה DNA. אני מחשיב את השיטה היא פשוטה למדי ניתן לשלוט בקלות. כדי להתחיל, למדוד את הריכוז של אוריגמי DNA מטוהרים.
השתמש בשני מיקרוליטרים של מאגר TB כריק כדי לכייל ספקטרופוטומטר אולטרה סגול. ואז למדוד ריכוז אוריגמי DNA ב 260 ננומטר. לאחר מכן לחשב את כמויות הפוספטים בתמיסת אוריגמי DNA מטוהרים, באמצעות פורמולה 2, כמתואר בכתב יד.
להכין 15 microliters של מבנה אוריגמי DNA על ידי הכללת ננו מול אחד של פוספט, באמצעות חיץ TB לדילול. הוסיפו 13.2 מיקרוליטר לשחפת ל-1.8 מיקרוליטר של צ'יטוסאן. ולהוסיף 15 microliters של פתרון chitosan ל 15 microliters של אוריגמי DNA לפתח פוליפלקס צ'יטוסאן אוריגמי DNA עם יחס N / P של שמונה.
המשך להכין פוליפים ביחסי N/P שונים, תוך שימוש בחישובים כמתואר בכתב היד. הכינו 80 מילימטרים של צינור לג'ל 2% אגרוז. מוסיפים 352 מיקרוליטרים של 2.5 מגנזיום כלוריד טוחן ולאחר מכן מכתימים אותו מראש עם 10 מיקרוליטרים של כתם ג'ל DNA.
יוצקים את תסכום הג'ל לקופסת ג'ל יבשה. הכנס מסרק אלקטרופורזה ג'ל ולתת לו להתגבש בטמפרטורת החדר במשך 15 עד 30 דקות. בינתיים להשלים את חיץ ריצה עם 11 מילימולר מגנזיום כלורי.
ערבבו 10 עד 20 מיקרוליטרים של כל דגימה עם מאגר טעינה של פי 20. לטעון את הדגימות לתוך בארות ג'ל agarose, כולל אוריגמי DNA עירום כשליטה. הפעל את הג'ל ב 70 וולט בטמפרטורת החדר במשך שעתיים וחצי עד שלוש שעות.
לאחר מכן השתמש בסורק UV כדי לדמיין את הג'ל. כדי לבצע בדיקת הגנה DNase I, להוסיף ארבעה microliters של כל polyplex לעומת ביחסי N / P שונים, 1.5 microliters של מאגר DNase I 10X, 8 microliters של TB, ו 1.5 microliters של DNase I לצינור PCR נפרד 2 מיליליטר. ואז דגירה זהה ב 37 מעלות צלזיוס בתרמוצ'יקלר במשך 24 שעות.
כדי לעכל DNase I, להוסיף שני microliters של 20 מיליגרם למיליליטר proteinase K ודגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתרמוציקלר. לאחר מכן, כדי לפענח את הליבה DNA nanostructures להוסיף 3.6 microliters של 50 מיליגרם למיליליטר 40 קילודלטונים dextran סולפט. לאחר מכן השתמש בדגימות אלה אוריגמי DNA טרי כבקרה לבצע אלקטרופורזה ג'ל אגרוז כפי שתואר קודם לכן.
Excise הלהקה המתאימה דגימות טעון מן הג'ל. כדי לחלץ את אוריגמי DNA, להשתמש בעמודת החילוץ להקפיא לסחוט ולעקוב אחר הוראות היצרן ולהמשיך עם הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים העברת כתם שלילי כמתואר בכתב היד. מערבבים 6.5 מיקרוליטרים של 36 ננומולרים מטוהרים HRP-NR עם 6.5 מיקרוליטרים של פוליציטציה בריכוזים משתנים.
כדי להכין פוליפלקס ביחסי N/P של אחד, שניים, ארבעה, 10 ו-20, הכינו קבוצה ריקה על ידי ערבוב של 6.5 מיקרוליטרים של מים מזוקקים עם 6.5 מיקרוליטרים של פוליקיונים בריכוזים שונים התואמים ליחסי N/P של אחד, שניים, ארבעה, 10 ו-20. לאחר מכן הוסיפו 12.5 מיקרוליטרים של כל אחד מהפתרונות המוכנים האלה ל באר נפרדת של צלחת של 96 בארות. לאחר מכן הוסיפו 72.5 מיקרוליטרים של מאגר HEPES לכל באר וערבבו.
מוסיפים 10 מיקרוליטרים של 15 מילימולרים ABTS ולאחר מכן 5 microliters של מי חמצן 12 מילימולרית לכל באר ומערבבים על ידי צינורות למעלה ולמטה. לבסוף, השתמש בקורא לוחות multimode כדי למדוד ספיגה ב 421 ננומטר על פני ארבע שעות. לאחר ניתוח פוליפלקסים באמצעות בדיקת פיגור ג'ל, חל שינוי במבנה העירום לכיוון הקתודה, ככל הנראה בשל איזון נגדי של המטען השלילי של קבוצות פוספט בעת קשירה לפוליקציות, וגידול גודל המתחם.
כאשר כמות נוספת של פוליאניונים, כגון דקסטרן סולפט, נוספה, היווצרות פוליפלקס התהפך. Dextran סולפט של משקל מולקולרי גבוה יותר הראה להיות יעיל יותר בהשוואה למשקל מולקולרי נמוך יותר. לאחר ניתוח הפוליפלקסים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת כתמים שליליים, מיקרוגרפים הראו ננו-מבנים עירומים של דנ"א אוריגמי, פוליפלקס פוליאתילנימיניום ליניארי לאחר עריפת ראשם, פוליפלקסים של צ'יטוסאן, תמונות של אוריגמי DNA עירום ומוגן החשוף לדלדול מגנזיום, השפלה אנזימטית ועיכול סרום.
בנוכחות DNase I, לאחר שעתיים, ננו-מבנים עירומים מתעכלים לחלוטין, ואילו הפוליפלקסים הפוליאתילנימינים הפוליאתילנימינים של אוריגמי DNA עטוף צ'יטוסאן נשארו שלמים בנוכחות 10 יחידות למיליליטר DNase I.ליניארי פוליאתילנימינים פוליפלקסים להגן על nanostructures DNA ביעילות רבה יותר בהשוואה chitosan. כאשר יחס ה- N/P של הפוליפלקס גדל, עיכול הדנ"א היה נמוך יותר. לאחר ציפוי אנזים, או לאחר אוריגמי DNA פונקציונלי יותר, עם פוליפלקס פוליאתילנימין ליניארי chitosan ביחסי N / P גרסה, לא נצפתה הפרעה יוצאת דופן עם פעילות אנזימטית.
מצד שני, הקינטי של אנזים HRP השתנה באופן דרמטי לאחר קשירה אוריגמי DNA. חשוב להתחיל עם מטוהרים היטב, DNA מבנים אוריגמי. קיים גדיל יציב יותר שיכול להיקשר גם לפוליציה.
קשה להפריד ביניהם את הפוליפלקסים של הדנ"א אוריגמי. מולקולות הציפוי שלנו משמשות גם יישומים ריפוי גנטי. משמעות הדבר היא כי ניתן להשתמש בננו-מבנים של הדנ"א בעתיד כדי לשנות את הגנום של אורגניזמים חיים.
עבור כתמי ג'ל אגרוז, בדרך כלל מולקולות משמשות כי intercalate ה-DNA והם mutagenic פוטנציאלי. אנא בצע את הוראות הבטיחות של המעבדה שלך בעת הכתמת DNA.
