מחקר זה מומן בחלקו על-ידי התוכנית מרכז פיתוח מחקר הכללית דרך נבחרת מחקר קרן של Korea(NRF) ממומן על ידי משרד המדע, ICT (MSIT) (2015K1A4A3047345) Nano· פיתוח חומרים טכנולוגיה תוכנית דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע ICT (MSIT) (2012M3A7A9671610). המכון למחקר הנדסי-אונ' סאול מסופקים מכוני מחקר לעבודה זו. מחברים להכיר תודתי לכיוון יון טה-יאנג (מדעי הביולוגיה, אונ' סאול) בנוגע ספקטרוסקופיה זריחה על הניתוח סריג.

1. עיצוב של 6 על ידי ארון תקשורת אקורדיון דנ א 6 עם caDNAno14
<ol><li>להוריד ולהתקין תוכנה caDNAno 2.014 לעצב ארון אקורדיון דנ א (caDNAno 2.5 זמינה גם ב- https://github.com/cadnano/cadnano2.5). פתח caDNAno14 ' ולחץ על ' כלי מרובע כדי להוסיף תפקיד חדש עם סריג מרובע '.</li>
	<li>מספר כל קרן של המדף אקורדיון ולצייר בלוח השמאלי סריג של caDNAno14 (איור 2).</li>
	<li>לחץ על הכלי עיפרון וצייר בכל הקורה בלוח העריכה נכון caDNAno14. הפסקה קורות בכל 32 bp, אשר עבור המפרקים בין קורות סמוכות. מקום סיכות ג'יי ג'יי אברהמס באותה העמדה המפרקים. להשתמש בכלי הוספת הכלי עיפרון caDNAno14 לתת את המפרקים יש נוספת ג'יי ג'יי אברהמס חד גדילי.</li>
	<li>לחץ על הכלי עיפרון וחבר המפרקים. לכל קרן יש שבעה בתי עסק.</li>
	<li>צור ג'יי ג'יי אברהמס לגרדום כדי למזג פיגומים לתוך הלולאה יחיד על-ידי שימוש בפיגומים שדווחה בעבר ניתוב אלגוריתם11. אל תתנו את התחום מחייב מינימום בין הגדילים לגרדום והידוק להיות פחות מ 8 bp (איור 3).</li>
	<li>למקם פיגומים שלא נעשה בהם שימוש באסיפה על הקודקודים ממוקם משני צדי המדף אקורדיון, כפי שמוצג באיור3.</li>
	<li>לחץ על לשבור את הכלי. לשבור את הגדילים איפה סיכות גדילי מעגלית או יותר מ 60 bp.</li>
	<li>לעצב את נעילת התאים.<ol>
<li>לחץ על לשבור את הכלי. הפסקה 8 bp של אזור ה-DNA סיכות כדי להפוך חלק דביק ולמחוק 8 bp של אזור ה-DNA סיכות. ישנם 18 חלקים דביק (איור 1) בארון 6 על ידי 6 אקורדיון.</li>
		<li>מקום רצפים לאחור משלים החלקים דביק בשני קצותיו של מנעול קווצות ולחבר אותם על ידי אזור הגישור, אשר מורכב של פולי T קווצות לאורך הרצוי (איור 1B).</li>
		<li>עבור תצורת, להוסיף 8 bp של רצפי מקום אחיזה לרגל בקצה של ה-DNA מנעולים סטרנד העקירה. הרצף מקום אחיזה לרגל בשימוש הוא בטבלה מס ' 2.</li>
		<li>להכין את הגדילים poly A אשר נמצאים הפוך משלימים לאזור גישור.</li>
		<li>גדילי עיצוב שמבטלות משלים המנעולים DNA לניסוי. שינוי תצורה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחץ על הכלי רצף ולחץ על DNA לגרדום. לבחור לגרדום כמו M13mp18 רגיל. לחץ על כלי ייצוא , שמירת רצף בתבנית csv (טבלה 1).</li>
</ol>2. לדמות את המבנה עם oxDNA
<ol><li>הורד והתקן את16,oxDNA17. קוד המקור האחרון זמין על https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.</li>
	<li>להפוך קבצי תצורה החל מקובץ14 caDNAno שימוש ב- script פייתון 'cadnano_interface.py', אשר מסופק באריזה17 16,oxDNA. השימוש הוא כדלקמן: 'פייתון cadnano_interface.py cadnano_file.json ר'. טופולוגיה הקובץ של קובץ התצורה נוצרים עכשיו. הערה: הקובץ טופולוגיה כולל כמה קווצות, נוקלאוטידים נמצאים המבנה ואת מידע לגבי עמוד שדרה-עמוד השדרה הקשרים בין נוקלאוטידים. קובץ התצורה כוללת מידע כללי כגון timestep, אנרגיה, גודל התיבה. התמצאות מידע כגון מיקום וקטורי בסיס עמוד השדרה וקטור, וקטור נורמלי, מהירות, מהירות זוויתית של נוקלאוטידים הוא גם כלולים (איור 4).</li>
	<li>לשנות את המידע בקובץ התצורה וטופולוגיה מ caDNAno14 כדי לגרום להם משקפים את המידע המבני אמיתי של ארון התקשורת אקורדיון. קורות כל מסודרים במקביל כאשר הם דמיינו את הטופולוגיה וקובצי תצורה מ caDNAno14 . עם זאת, המדף אקורדיון הוא מבנה סריג אז המרחק בין נוקלאוטידים בונדד רחוק עבור הסימולציה (איור 5).<ol>
<li>לסובב כל קרן ולעבור מבנה סריג הרצוי. 9 טורים משמאל בקובץ התצורה הם וקטור המיקום, עמוד שדרה-בסיס וקטור, וקטור נורמלי (איור 4). כדי לסובב את קרן, לסובב כל עמדה, וקטורים. בסיס עמוד השדרה, ואני רגילה באמצעות טרנספורמציה המסתובבת. לאחר מכן להזיז קרן על-ידי שינוי וקטור המיקום כדי לאתר אותו, כמוצג באיור5.</li>
		<li>להירגע למבנה באמצעות קובץ ה-script מסופק באריזה oxDNA (עיין בדוגמה $oxDNA/דוגמאות/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION למידע נוסף).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפעל את הסימולציה דינמיקה מולקולרית עבור 10 מיליון שלבים באמצעות קובץ התצורה רגועה. השימוש הוא כדלקמן: '. / oxDNA < input >' שמירת נתוני כל 5000 או 10000 צעדים.</li>
	<li>ויזואליזציה הערה: המבנים היו visualized באמצעות כמו.<ol>
<li>הורד והתקן את הגירסה העדכנית ביותר של כמו (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).</li>
		<li>להפעיל את כמו עם קבצי תצורה וטופולוגיה סימולציה oxDNA. השימוש הוא כדלקמן: '. / cogli1 -t < טופולוגיה קובץ >< קובץ תצורה >'.</li>
		<li>להסתיר את תיבת על-ידי הקשה על b.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. סינתזה של המבנה
הערה: שיטת סינתזה מותאמת מן הקודם פרוטוקול15,18.
<ol><li>לרכוש במקום DNA מעוצב מ ספק oligonucleotide.</li>
	<li>התאם את הריכוז של אלה סיכות דנ א כדי 100 μM בעזרת נוקלאז ללא מים.<ol>
<li>בריכה כל צירוף ד. נ המהווה את מבנה 'שחררו את המדינה' לתוך שפופרת אחת ולהתאים את ריכוז μM 2 על גדיל אחד.</li>
		<li>מאגר ה-DNA נעל קווצות לפי אורך ומספר אתרי נעל לתוך צינורות ולהתאים את ריכוז μM 2 על גדיל אחד. אתרי נעל 18, 9 ו- 4 משמשים. הוסף פולי A גדילי אשר משלימים לאזור גישור-ריכוז זהה.</li>
		<li>גדילי בריכה שמבטלות משלימים ל- DNA לנעול חוטים האורך לתוך צינורות ולהתאים את ריכוז μM 2 על גדיל אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין תמיסת MgCl-2 , 300 ננומטר על ידי ערבוב 70 μL של מים נטולי נוקלאז ו 30 μL של הפתרון2 1 μM MgCl. הכן 5 x טריס EDTA פתרון על ידי ערבוב μL 95 נטול נוקלאז מים ו 5 μL של הפתרון טריס EDTA 100 x.</li>
	<li>להוסיף 2 μL של הידוק ה-DNA, μL 1.1 בפתרון2 MgCl, 2 μL של פתרון טריס EDTA, 7.6 μL של מים נטולי נוקלאז ו- 7.3 μL של ה-DNA לגרדום אשר הריכוז הוא 110 nM כדי להפוך μL 20 מניות מעורבת. להגדיר את הריכוז הסופי של לגרדום דנ א ל-40 ננומטר, להדק את הדנ א 200 ננומטר, MgCl2 16 מ"מ ו- EDTA טריס לפתרון 0.5 x.</li>
	<li>במהירות חום הפתרון מלאי מעורבות של הצנטרפוגה תרמי עד 80 ° C וקריר עד 60 ° צלזיוס בקצב של 4 דקות לכל ° C וקריר מ- 60 ° C עד 4 ° C בקצב של 40 דקות לכל מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. טיהור של המבנה
הערה: דוגמאות של כל המבנים היו טהור לפני ניתוח. בסעיף זה, נתאר הפרוטוקול של פג-טיהור, אשר מותאם בין ספרות הקודם19. המדגם יכול גם להיטהר על ידי אלקטרופורזה בג'ל כפי שמתואר בספרות הקודם15,18.
<ol><li>להכין 5 מ' של NaCl, טריס x 100-EDTA.</li>
	<li>הכן משקעים-מאגר על ידי ערבוב μL 150 של 8000 פג, 500 μL של 100 x טריס EDTA, μL 101 של 5 M NaCl 249 μL של נוקלאז ללא מים.</li>
	<li>הכן היעד-מאגר על ידי ערבוב μL 5.5 בפתרון nM MgCl2 300 מ סעיף 3.3, μL 10 בפתרון טריס EDTA x 5 של סעיף 3.3 ו μL 84.5 נוקלאז ללא מים.</li>
	<li>מיקס 20 μL של המבנה מסונתז בסעיף 3, μL 20 משקעים-מאגר של סעיף 4.2. ואז לסובב המניה מעורב ב g x 16000-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע, להמיס צניפה במאגר-המטרה של סעיף 4.3.</li>
</ol>5. שינוי תצורה של ארון התקשורת אקורדיון ממצב' חינם' כדי 'נעול המדינה'
<ol><li>לסנתז את המבנה ללא DNA מנעולים לניסוי תצורה.</li>
	<li>להכין את נעילת התאים של סעיף 3.</li>
	<li>להוסיף 2 μL של DNA נעל קווצות לאורך הרצוי לתוך 20 μL של המבנה מסונתז. הריכוז של גדילי נעל ה-DNA הוא גבוה פי חמישה מאשר המבנה.</li>
	<li>דגירה המדגם על 0, 10, 25, 50 או 100 דקות כדי לראות כמה מהר שינוי תצורה מתרחשת.<ol>
<li>הדגירה 100 דקות, דגירה המדגם ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מגניב לאט עד 25 ° C בקצב של 0.33 ° C/דקה.</li>
		<li>הדגירה 50 דקות, דגירה המדגם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, מגניב לאט עד 25 ° C בקצב של 0.66 מעלות/דקות.</li>
		<li>הדגירה 25 דקות, דגירה המדגם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 7.5 דקות, מגניב לאט עד 25 ° C בקצב של 1.32 ° C/דקה.</li>
		<li>הדגירה 10 דקות, דגירה המדגם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, מגניב לאט עד 25 ° C בקצב של 3.3 ° C/דקה.</li>
		<li>עבור הדגירה 0 דקות, לאחסן לדוגמה 4 ° C מימין לאחר הוספת מנעולי התאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מיד לאחר השלב attaching, במהירות לקרר את הדגימה עד 4 ° C כדי למנוע דנטורציה בלתי רצויים.</li>
</ol>6. שינוי תצורה של ארון התקשורת אקורדיון מ 'נעול במצב' למצב' חינם'
<ol><li>לסנתז את המבנה עם מנעולים הדנ א לאורך הרצוי עבור הניסוי תצורה.</li>
	<li>להכין את הגדילים משלימים הפוכה של סעיף 3.</li>
	<li>להוסיף 2 μL של קווצות הם להפוך משלים המנעול גדילי לאורך הרצוי לתוך 20 μL של המבנה מסונתז. הריכוז של גדילי נעל ה-DNA הוא גבוה פי חמישה מאשר המבנה.</li>
	<li>דגירה המדגם על 0 12, 60, 120, 240 דקות לראות באיזו מהירות שינוי תצורה מתרחשת.<ol>
<li>ה-12, 60, 120, דגירה 240 דקות, במהירות לחמם את הדגימה עד 40 ° צלזיוס, לאט להתקרר עד 20 מעלות צלזיוס למשך הזמן המתאים לכל. מיד לאחר השלב התולש, במהירות לקרר את הדגימה עד 4 ° C כדי למנוע דנטורציה בלתי רצויים.</li>
		<li>עבור הדגירה 0 דקות, לאחסן לדוגמה 4 ° C מימין לאחר הפוכה גדילים משלימים נוספים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. TEM הדמיה
הערה: פרוטוקול הדמיה TEM הותאמה ספרות קודמת18,20.
<ol><li>הכן 1.25 מ' NaOH פתרון על ידי ערבוב 87.5 μL של מים נטולי נוקלאז μL 12.5 בפתרון NaOH 10 מ'.</li>
	<li>להוסיף 1 μL של 1.25 מ' NaOH פתרון μL 50 של הפתרון formate uranyl 2%.</li>
	<li>מערבולת הפתרון במשך 3 דקות, צנטריפוגה-מהירות מקסימלית במשך 3 דקות. להפקיד μL 3 המדגם מטוהרת על הרשת TEM משוחררים-זוהר במשך 3 דקות, במהירות לשטוף עם נייר סינון.</li>
	<li>להפקיד 7 μL של uranyl מוכן formate פתרון למשך 30 שניות, במהירות לשטוף עם נייר סינון.</li>
	<li>למדוד את האורך והזווית של המבנה אקורדיון עם תמונה מאת TEM.</li>
</ol>8. סריג ניתוח
<ol><li>השתמש אטו 550 וצבע אטו 647N, אשר המרחק פורסטר הוא 6.5 ננומטר. החלף גדילי fluorescently שכותרתה הידוק 58 ו- 117 הידוק בטבלה 1. ואז לסנתז את המבנה עם גדילים fluorescently עם תוויות ברורות על ידי השיטה המתוארת בסעיף 3.</li>
	<li>למדוד את הריכוז של המדגם מטוהרים.</li>
	<li>לנרמל את הדגימה כדי 10 ננומטר, טען 50 μL כדי microplates 384 טוב.</li>
	<li>לרגש את הדגימה עם צבעי התורם ואת מקבל ב 550 ננומטר ולמדוד ספקטרום קרינה פלואורסצנטית מ- 570 nm 800 nm עם fluorometer.</li>
	<li>למדוד את ספקטרום קרינה פלואורסצנטית המדגם התורם בלבד באותה דרך.</li>
	<li>לרגש את צבעי המדגם-650 nm ואת ספקטרום פלורסצנטיות מדידה של 670 nm 800 ננומטר. . זה כדי למדוד את ריכוז מקבל...</li>
	<li>להשיג את סטיות תקן באמצעות חזרה על אותו ניסוי עם שלוש דוגמאות, מסונתז ומותאמים מטוהרים בנפרד.</li>
	<li>לחשב את היעילות סריג עם יחס שיטה כפי שתואר על ידי המשוואה להלן21. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58364/58364eq1.jpg"> DA550: מקבל שיא עוצמת קרינה פלואורסצנטית המדגם ועם התורם מקבל ב 550 ננומטר עירור. D550: עוצמת קרינה פלואורסצנטית פליטה מקבל טווח המדגם התורם בלבד-550 ננומטר עירור. DA650: מקבל שיא עוצמת קרינה פלואורסצנטית המדגם ועם התורם מקבל ב 650 nm עירור.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Cha, T. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+DNA+enzyme+based+walkers:+Translocation+kinetics+and+photo-regulation.">Design principles of DNA enzyme based walkers: Translocation kinetics and photo-regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (29), 9429-9437 (2015).</li><li>Gerling, T., Wagenbauer, K. F., Neuner, A. M., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+DNA+devices+and+assemblies+formed+by+shape-complementary,+non-base+pairing+3D+components.">Dynamic DNA devices and assemblies formed by shape-complementary, non-base pairing 3D components.</a> Science. 347 (6229), 1446-1452 (2015).</li><li>Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+structural+DNA+nanotechnology.">Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology.</a> Nature nanotechnology. 6 (12), 763-772 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+speed+limit+of+toehold+exchange+with+a+cartwheeling+DNA+acrobat.">Exploring the speed limit of toehold exchange with a cartwheeling DNA acrobat.</a> Nature Nanotechnology. 1, (2018).</li><li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+based+molecular+devices.">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (14), 3124-3156 (2011).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+tweezer-actuated+enzyme+nanoreactor.">A DNA tweezer-actuated enzyme nanoreactor.</a> Nature communications. 4, 2127 (2013).</li><li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads.">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), 831-834 (2012).</li><li>Kuzyk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+3D+plasmonic+metamolecules.">Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules.</a> Nature Materials. 13 (9), 862-866 (2014).</li><li>Zhou, C., Duan, X., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasmonic+nanorod+that+walks+on+DNA+origami.">A plasmonic nanorod that walks on DNA origami.</a> Nature communications. 6, 8102 (2015).</li><li>Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reconfigurable+DNA+Accordion+Rack.">A Reconfigurable DNA Accordion Rack.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Mechanical+Properties+of+DNA+Origami+Tiles+and+Controlling+the+Kinetics+of+their+Folding+and+Unfolding+Reconfiguration.">Understanding the Mechanical Properties of DNA Origami Tiles and Controlling the Kinetics of their Folding and Unfolding Reconfiguration.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6995-7005 (2014).</li><li>Han, D., Pal, S., Liu, Y., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+and+cutting+DNA+into+reconfigurable+topological+nanostructures.">Folding and cutting DNA into reconfigurable topological nanostructures.</a> Nature Nanotechnology. 5 (10), 712-717 (2010).</li><li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno.">Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li><li>Castro, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+to+scaffolded+DNA+origami.">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature methods. 8 (3), 221-229 (2011).</li><li>Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Nanotweezers+Studied+with+a+Coarse-Grained+Model+of+DNA.">DNA Nanotweezers Studied with a Coarse-Grained Model of DNA.</a> Physical Review Letters. 104 (17), 178101 (2010).</li><li>Snodin, B. E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Simulation+of+the+Self-Assembly+of+a+Small+DNA+Origami.">Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami.</a> ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).</li><li>Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+and+Characterization+of+a+Bio-responsive+Robot+from+DNA+Origami.">Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e51272 (2015).</li><li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+Scalable+Preparation+of+Pure+and+Dense+DNA+Origami+Solutions.">Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li><li>Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+Complex+Two-dimensional+Shapes+from+Single-stranded+DNA+Tiles.">Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52486 (2015).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids.">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods in enzymology. 211, 353-388 (1992).</li><li>Kopperger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-assembled+nanoscale+robotic+arm+controlled+by+electric+fields.">A self-assembled nanoscale robotic arm controlled by electric fields.</a> Science. 359 (6373), 296-301 (2018).</li><li>Lauback, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+magnetic+actuation+of+DNA+nanodevices+via+modular+integration+with+stiff+micro-levers.">Real-time magnetic actuation of DNA nanodevices via modular integration with stiff micro-levers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1446 (2018).</li></ol>

המחברים אין לחשוף

פרוטוקול זה מציג את כל התהליך של עיצוב, הדמיה, סינתזה, וניתוח של בסיסי 2D DNA אקורדיון ארון התקשורת. עיצוב ששונה והכללים סימולציה תוארו כי החוק עיצוב שונה מזו של אוריגמי DNA רגיל, בכך המדף אקורדיון DNA יש נוקלאוטידים נוספים ג'יי ג'יי אברהמס גמישות14,15. מכאן, אנו מצפי?...

מערכות מכאניות המבוסס על ה-DNA nanostructures או DNA ננו משינס1,2,3,4,5 הם ייחודיים משום שהם מייצרים תנועה הננומטרי מורכבות ב- 2D and 3D ננומטר ל רזולוציה ångström, על-פי3,2,גירויים למערכות ביולוגיות שונות6. על ידי הצמדת חומרי פונקציונלי על מבנים אלה ושליטה על עמדותיהם, מבנים אלה ניתן ליישם בתחומים שונים. לדוגמה, ה-DNA ננו משינס הוצעו עבור הכור מולקולרית7, משלוח סמים8ו-9,מערכות nanoplasmonic10.
בעבר, הצגנו reconfigurable DNA אקורדיון המדף, אשר יכול לתפעל רשת הננומטרי 2D או 3D של אלמנטים11 (איור 1 א'). שלא כמו אחרים ננו משינס DNA רק לשלוט כמה אלמנטים, פלטפורמת יכולים באופן קולקטיבי לתמרן אלמנטים 2D או 3D מעת לעת ערוכים לשלבים שונים. אנו צופים כי רשת תגובה כימית וביולוגית לתכנות או מערכת מחשוב מולקולרי יכול להיבנות מהמערכת שלנו, על ידי הגדלת מספר הרכיבים לשליטה. המתלה אקורדיון הדנ א הוא מבנה, שבו הרשת של קורות DNA מרובים מחובר המפרקים המורכב חד גדילי הדנ א (איור 1B). המתלה אקורדיון שנוצר על ידי הקורות דנ א למנוחת מאת המנעולים הדנ א, אשר hybridize לחלק דביק של קורות, לשנות את הזווית בין הקורות על פי אורך החלק גישור של המנעולים (מצב סגור). בנוסף, שינוי תצורה צעד מרובת מומחש הוספת מנעולים חדשים לאחר היווצרות המדינה בחינם על ידי ניתוק DNA מנעולים עד12,הזחה סטרנד מבוססי מקום אחיזה לרגל13.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את התהליך כולו של סינתזה ועיצוב של ארון התקשורת אקורדיון דנ א reconfigurable. הפרוטוקול כולל עיצוב, הדמיה, רטוב-מעבדת ניסויים וניתוח לסינתזה של המדף אקורדיון הדנ א של 6 על ידי 6 רשתות שינוי, שינוי של תצורה אלה. המבנה מכוסה הפרוטוקול הוא הדגם הבסיסי של ה מחקר קודמות11 והוא 65 ננומטר על ידי 65 ננומטר בגודלם, בהיקף של 14 קורות. מבחינת עיצוב, הדמיה, העיצוב מבנית של המדף אקורדיון שונה קונבנציונאלי DNA אוריגמי14,15 (קרי, בצפיפות). לכן, כלל עיצוב, הדמיה מולקולרית שונו שיטות מסורתיות. כדי להדגים, אנו מראים את טכניקת עיצוב באמצעות הגישה ששונה caDNAno14 והסימולציה של המדף אקורדיון באמצעות16,oxDNA17 עם תסריטים נוספים. לבסוף, מתוארים שני הפרוטוקולים של TEM, סריג לצורך ניתוח של מבנים מתלה אקורדיון שתצורתו נקבעה.

<table><tbody><tr><td>M13mp18 Single-stranded DNA</td><td>NEB</td><td>N4040s</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Solution</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA buffer</td><td>Biosesang</td><td>T2142</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>5M Sodium Chloride solution</td><td>Biosesang</td><td>s2007</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>10N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2038</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl formate</td><td>Thomas Science</td><td>C993L42</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodropic 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM (LIBRA 120)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer Enspire 2300</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Labogene</td><td>LZ-1580</td><td></td></tr></tbody></table>

design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack

במערכות מבוססות-ננו-מבנה ה-DNA מכני או ננו משינס הדנ א, אשר מייצרים תנועה הננומטרי מורכבות ב- 2D and 3D ננומטר לרזולוציה ångström, הראה פוטנציאל גדול בתחומים שונים של ננו-טכנולוגיה כגון הכורים מולקולרית, משלוח סמים, ומערכות nanoplasmonic. Reconfigurable DNA אקורדיון המדף, אשר באופן קולקטיבי שבאפשרותך לתפעל רשת הננומטרי 2D או 3D של אלמנטים, בשלבים מרובים בתגובה הקלט דנ א, מתואר. פלטפורמת יש פוטנציאל להגדיל את מספר רכיבים ננו משינס DNA ניתן לשלוט של מספר רכיבים כדי מידה רשת בשלבים רבים של שינוי תצורה.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את התהליך ניסיוני של reconfigurable ה-DNA אקורדיון ארון התקשורת של 6 על ידי 6 רשתות שינוי. הפרוטוקול כולל עיצוב כלל וסימולציות הליך של המבנים ושל ניסוי רטוב-lab סינתזה, שינוי תצורה. בנוסף, ניתוח המבנה באמצעות TEM (במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים) וקשת/קשתית (העברת אנרגיה של קרינה פלואורסצנטית תהודה) נכלל בפרוטוקול. שיטות הדמיה ועיצוב חדשניים מכוסה פרוטוקול זה יסייע לחוקרים להשתמש המדף אקורדיון DNA עבור יישומים נוספים.

המתלה אקורדיון של הדנ א 6 תוכנן על ידי 6 מדומה של ה16,oxDNA17 , התוצאות מוצגות באיור6. מן התוצאה סימולציה, הוא אישר כי המבנה המיועד נוצר ללא עיוותים של המבנה.
הדימויים TEM איור 7 הם תמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack at JoVE.com

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור עיצוב, הדמיה, רטוב-מעבדת ניסויים וניתוח עבור מתלה reconfigurable של אקורדיון הדנ א של 6 על ידי 6 רשתות.

עיצוב, סינתזה של ארון אקורדיון דנ א Reconfigurable

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

design-and-synthesis-of-a-reconfigurable-dna-accordion-rack

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K Views.  Seoul National University. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור עיצוב, הדמיה, רטוב-מעבדת ניסויים וניתוח עבור מתלה reconfigurable של אקורדיון הדנ א של 6 על ידי 6 רשתות.

Video: Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Chemistry

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

עצמי הרכבה של צורות דו-ממדיות מורכבות מחד-גדילי דנ&quot;א אריחים

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

עיצוב רובוט ביו תגובה מ-DNA אוריגמי

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genetics

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

המוטיבים אן יציב, 1 י ו- 2D Nanostructures בנוי מולקולות DNA מעגלי קטן

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

DNA אוריגמי-תיווך המצע Nanopatterning של מבנים אורגניים עבור יישומים חישה

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

דפוס פשוט, זול ומודולרי של תאים המשתמשים ב- DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

RNA פולימראז קשור DNA לתכנות תמלול במבחנה וחישוב מולקולרי

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

גדיל DNA עקירת עיר רשתות תגובת השרשת כימית המופק מפלסמיד

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...