כדי לאפיין באופן מלא פנוטיפ מיקרוגליאלי, חשוב להתייחס הן לתנימוס הבסיסי והן לתוחמיות כיוונית. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבדוק את תנועתיות כיוונית של microglia על ידי הדמיה דו פוטון בפרוסות המוח עכברים, באמצעות ממשק הדפסה 3D מותאם אישית ותאי זלוב. הדגמת ההליך תהיה פאני אטיין, דוקטורנטית, ווינצ'נזו מסטריוליה, חוקר פוסט-דוקטורט, שניהם מהמעבדות שלנו.
לפחות 30 דקות לפני הניתוח, להתחיל מבעבע 70 מיליליטר של נוזל השדרתי המלאכותי כולין, או aCSF כולין, על קרח. הוסף 150 מיליליטר של כולין aCSF ב 32 מעלות צלזיוס, עם קרבוגן. מניחים צלחת התגבשות 200 מיליליטר עם מגנט בר לתוך קופסת מזון אטומה ומוסיפים 200 מיליליטר של aCSF לצלחת.
מניחים מחזיק פרוסת ממשק מודפס בתלת-ממד על גבי המנה ומסירים נוזל עודף מהצלחת המגבשת, עד שנותר רק סרט דק של פתרון המכסה את רשת הרשת של מחזיק השקופיות של הממשק. מוסיפים כמה מילימטרים של aCSF בתחתית קופסת המזון ומתחילים לבעבע את הנוזל עם פחמימן. לאחר מכן, סגור את התיבה האטומה תוך שמירה על פחמימות קבועות כדי ליצור תא ממשק לח, 95%, 5%פחמן דו חמצני עשיר.
לאחר הקציר, מניחים את המוח על פיסת נייר סינון ספוג aCSF ול לנתח את האזור של עניין, על פי הזווית המועדפת של חיתוך. לפרוסות קורונטל, מקם והדבק את הפנים הקאודאליות של המוח על צלחת פטרי באורך 10 ס"מ המחוברת לגוש החיתוך של כלי פריסה רוטט, וממקם את הבלוק בתא המאגר של כלי הפריסה הרוטט בתוך תא גדול מלא בקרח. ממלאים את המנה עם aCSF כולין קר כקרח ולהשתמש בכלי הפריסה כדי להשיג פרוסות מוח עבות 300 מיקרומטר, באמצעות פיפטה העברה חד פעמית בקוטר ארבעה מילימטר לאחר כל מעבר של הלהב כדי לאסוף כל פרוסה.
תן לכל פרוסה להתאושש 32 מעלות צלזיוס כולין aCSF במשך כ 10 דקות לאחר שהוא מתקבל, לפני העברת הפרוסות על חתיכות של נייר ניקוי עדשה, עם טיפה של כולין aCSF. לאחר מכן שאפו את עודף כולין aCSF ולהשתמש מרית להעביר את הפרוסות על הרשת של תא הממשק, המאפשר את הפרוסות להתאושש בסביבה זו לפחות 30 דקות. 30 דקות לפני תחילת ההקלטה, חבר את המשאבה הפריסטולית לתא הקלטה מותאם אישית עם זלוב עליון ותחתון לאופטימיזציה של החמצון והכדאיות של פרוסות הרקמה, ונקה את כל מערכת הזלבה עם 50 מיליליטר של מים אולטרה-חמים.
בסוף מחזור הניקוי, להתחיל את תדלוק של תא ההקלטה עם 50 מיליליטר של aCSF ב זכוכית תחת קרבוגניים קבועים, ולהשתמש חד פעמי, פיפית העברה רחבת פה כדי להעביר את הפרוסה הראשונה להיות בתמונה לתוך כדי להסיר את נייר העדשה. כאשר החלק שקע לתחתית המזימה, מעבירים את החלק לתא ההקלטה וממקמים את מחזיק הפרוסה על הפרוסה כדי למזער את התנועה הנגרמת על ידי זרימת התדלוק. השתמש בתאורה של שדה בהיר כדי למקד את אזור העניין במוח תחת הגדלה של פי 5 עד 10.
לאחר מכן, השתמש במטרה 25x עם עדשת טבילה במים 0.35x כדי להתאים את המיקום של שדה הצפייה. השתמש תאורת פלואורסצנטיות כדי לאתר את התאים המיקרוגליאליים פלואורסצנטיים ול מילוי אחורי פיפטה עם 10 microliters של aCSF המכיל את המתחם של עניין בריכוז הסופי שלה. כוון את הקצה כלפי מטה עם רעידות עדינות כדי להסיר את כל בועות האוויר לכודים בקצה ולהוות את פיפטה מלא לתוך מחזיק פיפטה מחובר מזרק חמישה מיליליטר עם הבוכנה ממוקם בעמדה חמישה מיליליטר מותקן על מיקרו מניפולטור שלושה צירים.
מנמיכים את הפיפיטה בעדינות לכיוון הפרוסה, שולטים ומתאימת את המטרה בו זמנית, עד שטיפ הפיפיגט נוגע קלות במשטח הפרוסה. עכשיו לכוון את הלייזר ולעבור את המיקרוסקופ למצב multiphoton. ודא כי התא מוקרן מכל מקור אור ולהדליק את הגלאים שאינם descanned.
הגדר את הרווח ולהשתמש בטבלת בדיקת מידע עם גבול עליון מקודד בצבע כדי למנוע רוויה של הפיקסלים בתמונה. לאחר מכן, להתחיל להקליט במשך משך כולל של לפחות 30 דקות, לאט מדכא את הבוכנה מזרק מן המיקום חמישה למיליליטר אחד, לאחר חמש דקות, על פני תקופה של חמש שניות, כדי להחיל את המתחם על החלק. לניתוח תמונה, בצע תחילה תיקון z-הקרנה ו להיסחף עם ImageJ בקובץ העניין.
לאחר מכן, פתח את הקובץ שהשתנה ב- Icy וצייר אזור עניין מעגלי בקוטר 35 מיקרומטר, שבמרכזו אתר ההזרקה. הפעל את הסרט שוב עם ROI, כדי להבטיח שהוא ממוקם היטב. לאחר מכן, השתמש באזור של תוסף אבולוציה בעוצמת עניין כדי למדוד את העוצמה הממוצעת לאורך זמן באזור העניין, ולשמור את התוצאות כקובץ xls.
פרוטוקול זה מאפשר למדוד את התגובות הנגרמות על ידי תרכובות שונות, כמו ATP או סרוטונין. למרות הזרקת ATP מעוררת עלייה של פלואורסצנטיות, לאחר רוב זריקות ATP, יש ירידה מיידית, קלה פלואורסצנטיות עקב עיוות רקמות חוזר לאחר כמה דקות. גודלו של אזור העניין משפיע גם על הכימות, גם הגדלת הקוטר מפחיתה את השונות בין הניסויים, אך מקטינה את הדיוק והעוצמה של התגובה שזוהתה.
הערכה של התגובה microglial בנקודת זמן מסוימת יכול להיות שימושי עבור השוואה סטטיסטית של תרכובות שונות, או כדי לבדוק את ההשפעות של אנטגוניסטים ספציפיים הוסיף פתרון זלורים. כדי לכמת את תנועתיות בשלושה ממדים, דע כי ייתכן שיהיה עליך לשנות את מרווח z-step ואת קצב הדגימה של הרכישה כדי להתאים לדרישות הניתוח.
