Bir mikroglial fenotipi tam olarak karakterize etmek için hem bazal hem de yönlü hareketliliği ele almak önemlidir. Bu protokol, özelleştirilmiş 3D baskı arayüzü ve perfüzyon odaları kullanarak, farelerin beyin dilimlerinde iki foton görüntüleme ile mikroglia yön hareketliliğini test etmek için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Fanny Etienne, bir doktora öğrencisi, ve Vincenzo Mastriolia, bir doktora sonrası araştırmacı, her ikisi de laboratuvarlarından olacaktır.
Diseksiyon dan en az 30 dakika önce, 70 mililitre kolin yapay beyin omurilik sıvısı veya kolin aCSF'yi buz üzerinde köpürmeye başlayın. 32 santigrat derecede 150 mililitre kolin aCSF ekleyin, karbogen ile. Kapalı bir gıda kutusuna bir bar mıknatısı ile 200 mililitrelik kristalize çanak yerleştirin ve çanak için aCSF 200 mililitre ekleyin.
Kabın üzerine 3B baskılı bir arayüz dilimi tutucusu yerleştirin ve arayüz kaydırağı tutucunun örgüsünün üzerini kaplayan ince bir çözüm filmi kalana kadar, kristalize çanaktan fazla sıvıyı çıkarın. Gıda kutusunun altına birkaç milimetre aCSF ekleyin ve karbogen ile sıvı köpürmeye başlayın. Daha sonra, nemlendirilmiş, %95 oksijen, %5 karbondioksit açısından zengin arayüz odası oluşturmak için sürekli karbogenasyon sağlarken mühürlü kutuyu kapatın.
Hasattan sonra, beyni aCSF'ye batırılmış filtre kağıdının üzerine yerleştirin ve tercih edilen dilimleme açısına göre ilgi bölgesini inceleyin. Koronal dilimler için, pozisyon ve tutkal beynin kaudal yüz 10 santimetre Petri çanak üzerine bir titreşimli dilimleyici kesme bloğu bağlı ve buz dolu büyük bir oda içinde titreşimli dilimleyici rezervuar odasında blok konumlandırmak. Buz gibi kolin aCSF ile çanak doldurun ve her dilim toplamak için bıçak her geçişsonra dört milimetre çapında tek kullanımlık transfer pipet kullanarak, 300 mikrometre kalınlığında beyin dilimleri elde etmek için dilimleyici kullanın.
Her dilim elde edildikten sonra yaklaşık 10 dakika boyunca 32 derece santigrat kolin aCSF kurtarmak izin, lens temizleme kağıdı parçaları üzerine dilimleri aktarmadan önce, kolin aCSF bir damla ile tepesinde. Sonra aşırı kolin aCSF aspirate ve dilimler arayüz odasının örgü üzerine aktarmak için bir spatula kullanın, dilimleri en az 30 dakika boyunca bu ortamda kurtarmak için izin. Kaydı başlatmadan 30 dakika önce, doku dilimlerinin oksijenasyon unu ve canlılığını optimize etmek için peristaltik pompayı üst ve alt perfüzyonlu özelleştirilmiş bir kayıt odasına bağlayın ve tüm perfüzyon sistemini 50 mililitre ultrasaf su ile temizleyin.
Temizleme döngüsünün sonunda, sürekli karbogenasyon altında bir cam kabın içinde 50 mililitre aCSF ile kayıt odasıperfüzyon u başlatın ve lens kağıdını çıkarmak için görüntülenecek ilk dilimi beher'e aktarmak için tek kullanımlık, geniş ağızlı transfer pipeti kullanın. Bölüm kabın dibine battığında, bölümü kayıt odasına aktarın ve perfüzyon akışının neden olduğu hareketi en aza indirmek için dilim tutucuyu dilime yerleştirin. Beş ila 10 x büyütme altında ilgi beyin bölgesihedef parlak alan aydınlatma kullanın.
Ardından, görüntüleme alanının konumunu ayarlamak için 0,35x su daldırma lensi ile 25x'lik bir hedef kullanın. Floresan mikroglial hücreleri bulmak ve son konsantrasyonda ilgi bileşiği içeren 10 mikrolitre aCSF ile pipet dolum floresan aydınlatma kullanın. Uçta sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe sallayarak ucu aşağı doğru çevirin ve doldurulmuş pipeti beş mililitrelik pozisyonda konumlandırılmış ve üç eksenli bir mikromanipülatöre monte edilmiş pistonlu beş mililitrelik şırıngaya bağlı bir pipet tutucuya monte edin.
Pipet ucu dilimin yüzeyine hafifçe dokunana kadar, pipeti dilime doğru hafifçe indirin, hedefi aynı anda kontrol edin ve ayarlayın. Şimdi lazeri ayarlayın ve mikroskobu multifoton moduna geçirin. Odanın herhangi bir ışık kaynağından tarandığından emin olun ve descanned olmayan dedektörleri açın.
Kazancı ayarlayın ve görüntüdeki pikselleri doymak için renk kodlu bir üst sınıra sahip bir arama tablosu kullanın. Daha sonra, en az 30 dakika toplam süre için kayıt başlayın, yavaş yavaş beş ila bir mililitre pozisyonda şırınga piston depresif, beş dakika sonra, beş saniye lik bir süre içinde, bölüme bileşik uygulamak için. Görüntü analizi için, ilk ilgi dosyasında ImageJ ile z-projeksiyon ve sürüklenme düzeltme gerçekleştirin.
Daha sonra, buzlu modifiye dosyayı açın ve enjeksiyon sitesi üzerinde merkezli bir dairesel, 35 mikrometre çapında ilgi bölgesi çizin. İyi konumlandırılmış olduğundan emin olmak için filmi Yatırım Getirisi ile yeniden çalıştırın. Daha sonra, ilgi alanının zaman içinde ortalama yoğunluğunu ölçmek ve sonuçları xls dosyası olarak kaydetmek için ilgi yoğunluğu evrim eklentisi bölgesini kullanın.
Bu protokol farklı bileşikler tarafından indüklenen tepkileri sağlar, ATP veya serotonin gibi, ölçülecek. ATP enjeksiyonu floresan bir artış ortaya çıkar rağmen, en ATP enjeksiyonları sonra, birkaç dakika sonra geri gelen doku bozulması nedeniyle floresan hemen, hafif bir azalma vardır. İlgi alanının büyüklüğü, çapın artırılması deneyler arasındaki değişkenliği azalttığından, algılanan yanıtın doğruluğunu ve büyüklüğünü azalttığı için niceliği de etkiler.
Mikroglial yanıtın belirli bir zaman noktasında değerlendirilmesi, farklı bileşiklerin istatistiksel karşılaştırması veya perfüzyon çözeltisine eklenen spesifik antagonistlerin etkilerini test etmek için yararlı olabilir. Hareketliliği üç boyutlu olarak ölçmek için, analiz gereksinimlerine uyacak şekilde z adım aralığını ve edinmenin örnekleme oranını değiştirmeniz gerekebileceğini bilin.
