במוח, זוג נוירונים יוצרים לעתים קרובות מגעים סינפטיים מרובים, הנקראים ריבוי סינפטי. עם זאת, בדיקה מדויקת של ריבוי סינפטי דורשת ניסויים מאתגרים מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה להערכה ברוטו של ריבוי סינפטי באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מין ואזור המוח כדי לחקור ריבוי סינפטי. שיטה זו דורשת מיומנויות בסיסיות באלקטרופיזיולוגיה של מהדק-טלאי שלם. השגת הקלטות באיכות גבוהה עם עמידות נמוכה ויציבה לגישה היא קריטית לפרשנות המדויקת של הנתונים.
כדי להשיג תצורה של תא שלם, מקם את פיפיט ההקלטה ממש מעל הפרוסה והיסט זרם פיפטה במצב מהדק המתח. החל לחץ חיובי קל על פיפטה, ולנעול את stopcock. לאחר מכן, בחר תא בריא עם קרום שלם, והתקרב לרקמה עם פיפטה.
הלחץ החיובי אמור לגרום להפרעה קלה ברקמה. לאט לאט לקרב את פיפטה לתא בתנועה אלכסונית עד גומה קטנה נוצרת על פני התא. לאחר מכן, שחרר את נעילת הלחץ החיובית.
התא יתחיל ליצור חותם, וההתנגדות תגדל מעל ג'יגה-אוהם אחד. במלקחיים במתח, החזק את התא במינוס 68 מילי-וולט. לאחר מכן, מעט למשוך את פיפטה מן התא באלכסון כדי להסיר לחץ עודף.
לפצות על קיבוליות פיפטה מהירה ואיטית. החל יניקה קצרה דרך הצינור המחובר למחזיק פיפטה כדי לפרוץ את התא ולקבל תצורה של תא שלם. לאחר מכן, עבור למצב תא בחלון בדיקת הממברנה בתוכנה לאילופיזיולוגיה של איסוף וניתוח נתונים.
שמור על הטמפרטורה של אמבט ההקלטה ב 27 עד 30 מעלות צלזיוס ואת קצב הזרימה ב 1.5 עד שני מיליליטר לדקה לניסויים הבאים. בסינפסה ריבוי, פוטנציאל פעולה מסנכרן שחרור נוירוטרנסמיטר ומייצר זרם פוסט-סינפטי גדול יותר. חסימת פוטנציאל פעולה ושחרור כלי רכב תלוי סידן עם TTX ו קדמיום מונע את הסיכום הנוכחי postsynaptic ומפחית את משרעת.
כאשר אין ריבוי, חסימת פוטנציאל הפעולה לא תשנה את משרעת. בניסוי אחד, כדי להעריך ריבוי, להחזיק את התא במינוס 68 מיליבולטים תוך זלוף זה עם aCSF סידן נמוך. הקלט את ה- EPSCs הספונטניים למשך חמש דקות לפחות כדי להבטיח תוכנית בסיסית יציבה.
לאחר מכן, להוסיף 30 micromolars 4-AP ל- aCSF כדי להגדיל את הפעולה אירועים תלויים פוטנציאליים, ולהקליט EPSCs ספונטניים לפחות 10 דקות כדי להשיג את אפקט התרופה המלאה. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיקרומולרים TTX ו-10 מיקרומולרים קדמיום ל-aCSF עם 4-AP, והקליטו את ה-EPSCs הזעירים למשך 10 דקות לפחות. לניתוח לא מקוון, השתמש בדקה האחרונה של תוכנית הבסיס מיד לפני היישום של 4-AP, בדקה העשירית של יישום 4-AP ובדקה העשירית של יישום TTX.
בניסוי זה, סידן חוץ-תאי מוחלף בסטרונציום כדי לבטל את ההינכרון של שחרור וריצים סינפטיים. לכן, אם קיים ריבוי, זה אמור להקטין את משרעת של זרמים postsynaptic. בניסוי 2, להקליט EPSCs ספונטניים לפחות חמש דקות תוך התלקחות התא עם aCSF סידן נורמלי.
כדי לבטל את ניתוק שחרור וקסיק, להתחיל לתפור את התא עם aCSF סטרונציום, ולהקליט EPSCs ספונטניים. לניתוח לא מקוון, כדי לקבוע אם משרעת גדולה EPSCs ספונטניים נובעים שחרור סינכרוני של וקסיקים, להשוות את הדקה האחרונה של הבסיס לדקה העשירית של יישום aCSF סטרונציום. ריבוי יכול לכלול שחרור רב-מערכתי, מה שגורם לריכוז נוירוטרנסמיטר גבוה יותר בסוע הסינפטי.
תוספת של גאמא-DGG, אנטגוניסט קולטן אמפא בזיקה נמוכה, מובילה לעיכוב פחות יעיל של רב-קוואנטי גדול יותר בהשוואה לזרמים פוסט-אנטינפטיים קטנים יותר. ללא הפצה רב-מערכתית, גאמא-DGG תהיה יעילה באותה מידה בזרמים פוסט-סינפטיים גדולים וקטנים יותר. בניסוי 3, כדי לבדוק שחרור רב-מערכתי, הקלט EPSCs ספונטניים ב- aCSF עם סידן נמוך למשך חמש דקות לפחות.
הוסף 30 מיקרומולרים 4-AP ל- aCSF באמצעות מערכת החיסון. הקלט את ה- EPSCs הספונטניים למשך 10 דקות לפחות. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרומולרים גאמא-DGG ל-ACSF עם 4-AP, והקליטו את ה-EPSCs הספונטניים למשך 10 דקות לפחות.
כניסוי בקרה בתא נפרד, חזור על ההליכים, אך החל ריכוז נמוך של DNQX במקום גאמא-DGG. לניתוח לא מקוון, לנתח את הרגע האחרון של כל יישום סמים. פרצי פעילות סינפטית יכולים להגדיל באופן חולף את פוטנציאל הפעולה הספונטני ולשחרר את ההסתברות של afferents מגורה.
אם נוירונים מפגינים ריבוי, העלייה בפוטנציאל הפעולה אמורה לגרום לעלייה ארעית משרעת של זרמים פוסט-סינפטיים. בניסוי 4, להקליט EPSCs ספונטניים בסידן aCSF נורמלי. כדי להגביר את פוטנציאל הפעולה, לעורר את afferents באמצעות אלקטרודה זכוכית מונופולארי מלא aCSF בקצב של 20 הרץ במשך שתי שניות, ולחזור 10 פעמים עם מרווח בין פרץ של 20 שניות.
לניתוח, השתמש ב- EPSCs ספונטניים של 5,000 אלפיות שניה לפני הגירוי הראשון כבסיס והשווה ל- EPSCs הספונטניים של 10 עד 300 אלפיות השניה לאחר הגירוי הסופי. לאחר מכן, לקחת את משרעת הממוצע ושינוי תדירות מעל 10 ניסויים. נתח EPSCs ספונטניים ו- EPSCs זעירים באמצעות תוכנית המזהה ומנתחת זרמים סינפטיים.
השתמש בפרמטרי הזיהוי המוצעים ובפונקציית ניתוח ללא הפסקה לזיהוי EPSCs המתווים על-ידי קולטן אמפא. סרוק באופן ידני כל הקלטה כדי לוודא שהתוכנית מזהה במדויק כל אירוע. יצא את נתוני האירוע על-ידי העתקתם ללוח והדבק אותם בתוכנת ניהול נתונים.
לאחר מכן, לחשב את התדירות הממוצעת משרעת עבור כל טיפול תרופתי, ולבצע את הניתוחים הסטטיסטיים הרלוונטיים. בדוגמה המוצגת כאן, 4-AP מגביר הן את משרעת והן את התדירות של EPSCs ספונטניים. היישום הבא של TTX ו קדמיום מקטין הן את משרעת ותדירות.
הנה ההפצה של משרעת EPSC ספונטנית מההקלטה. בנוירונים ההיפותלמיים שנבדקו כאן, משרעת ותדירות של תנאי הבסיס ו- TTX זהים, מה שמרמז על כך שה- EPSCs הספונטניים הבסיסיים מכילים מעט מאוד EPSCs תלויי פוטנציאל פעולה. בהתאם לכך, ניסויים עוקבים יכולים להשוות את ההפרש בין קו הבסיס ל- 4-AP כדי למדוד ריבוי.
כוחו של שידור סינפטי יכול להיות מוגבר באופן חולף על ידי התפרצויות של פעילות סינפטית. כדי לחקור ריבוי בתנאים פיזיולוגיים יותר, גירוי אדיש יכול לשמש כדי להגדיל את פוטנציאל הפעולה ירי והסתברות שחרור. להלן הסיכומים של תדירות EPSC ספונטנית ושינויים משרעת בעקבות גירוי סינפטי.
הקלטות יציבות חיוניות לפרשנות מדויקת של הנתונים. תאר את הנתונים אם ההתנגדות לגישה משתנה ביותר מ- 20% במהלך ההקלטה, מכיוון ש הדבר עלול לבלבל את הניתוח. פרוטוקול זה מציע דרך פשוטה להעריך ריבוי סינפטי, שהוא גורם מפתח ביעילות הסינפטית ובפלסטיות שלה בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים שונים.
